蛋白质盐析课件

一、盐析一、盐析 盐析盐析：溶液中加入无机盐类而使某种物质：溶液中加入无机盐类而使某种物质溶溶解度解度降低而析出的过程降低而析出的过程向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。可复原。一、一、盐盐析析 盐盐析：溶液中加入无机析：溶液中加入无机盐类盐类而使某种物而使某种物质质溶解溶解1 （一）基本原理（一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。这些性质就本质而言是水分子间的这些性质就本质而言是水分子间的氢键氢键和蛋和蛋白质表面所暴露出的白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用原子的相互作用，所以易受溶液温度、所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强值、介电常数和离子强度等参数的影响。度等参数的影响。（一）基本原理（一）基本原理2 蛋白质在自然环境中通常是蛋白质在自然环境中通常是可溶可溶的，的，表面：大部分是亲水基团表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团内部：大部分是疏水基团蛋白质呈稳定蛋白质呈稳定的分散状态的分散状态两性物质，一定两性物质，一定pHpH下表面带有一定的下表面带有一定的电荷，电荷，静电斥力作用静电斥力作用使分子间相互排使分子间相互排斥斥蛋白质周围的水分子有序排列，在表面蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成形成水化膜水化膜，这一层能保护蛋白质粒，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。子避免因碰撞而聚沉。蛋白蛋白质质在自然在自然环环境中通常是可溶的，蛋白境中通常是可溶的，蛋白质质呈呈稳稳定的分散状定的分散状3 当向蛋白质溶液中加入当向蛋白质溶液中加入中性盐中性盐时：时：低盐低盐-盐溶盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大增加，蛋白质溶解度增大)高盐高盐-盐析盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小)盐离子部分中和蛋白盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间质的电性，使分子间排斥作用减弱排斥作用减弱中性盐的亲水性比蛋白质大，中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用盐离子在水中发生水化作用从而使从而使蛋白质脱去水化蛋白质脱去水化膜膜，暴露出疏水区域，暴露出疏水区域 当向蛋白当向蛋白质质溶液中加入中性溶液中加入中性盐时盐时：低：低盐盐-盐盐溶溶(低低盐盐情况下，随情况下，随4H+OH-+pHpI,pHpI,pHpI,带负电，带负电，有水膜，是稳定有水膜，是稳定的亲水胶体的亲水胶体_+_pH=pIpH=pI时时,有水膜，有水膜，是不稳定的亲水是不稳定的亲水胶体胶体中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜+中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜_+_中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜_中性盐中性盐中和电荷中和电荷SO42-中性盐中性盐中和电荷中和电荷NHNH4 4+或或NaNa+蛋白质的盐析机制示意图蛋白质的盐析机制示意图蛋白质沉淀蛋白质沉淀H+OH-+pH 阳离子阳离子尤其以尤其以高价阴离子高价阴离子更为明显。更为明显。常见阴离子常见阴离子的盐析作用顺序：的盐析作用顺序：PO43-SO42-CH3COO Cl NO3 ClO4 I SCN阳离子阳离子对盐析效果的影响：对盐析效果的影响：Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+盐盐析效果：阴离子析效果：阴离子 阳离子常阳离子常见见阴离子的阴离子的盐盐析作用析作用顺顺序：阳离子序：阳离子10无机盐可按两种方式加入溶液中：无机盐可按两种方式加入溶液中：直接加入固体直接加入固体(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4粉末粉末工业生产工业生产 (分批加入，充分搅拌分批加入，充分搅拌)加入加入(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4饱和溶液饱和溶液实验室和小规模生产实验室和小规模生产 (防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释)无机无机盐盐可按两种方式加入溶液中：直接加入固体可按两种方式加入溶液中：直接加入固体(NH4)2SO411 （三）影响盐析的各种因素（三）影响盐析的各种因素 无机盐的加入量无机盐的加入量蛋白质的浓度蛋白质的浓度温度温度pHpH操作方式操作方式（三）影响（三）影响盐盐析的各种因素析的各种因素 无机无机盐盐的加入量的加入量121.1.无机盐加入量的影响无机盐加入量的影响1 2 3 4 5 61.02.52.00.5-0.5-1.0-1.5 01.5S0(离子强度离子强度)lgS盐析盐析蛋白质溶解度蛋白质溶解度1.无机无机盐盐加入量的影响加入量的影响1 2 3 4 5130 2 4 6 8 10-0.500.50-1.00(离子强度离子强度)lgS蛋白质溶解度蛋白质溶解度 0不同蛋白质溶解度与离子强度的关系不同蛋白质溶解度与离子强度的关系蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同0 2 4 6 14 对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。定的蛋白质盐析分布曲线。30lgS蛋白质溶解度蛋白质溶解度20 30 40 50 60 702040100P不同不同(NH4)2SO4 饱和度饱和度C0 对对于特定的蛋白于特定的蛋白质质，一定操作条件下，一定操作条件下产产生沉淀生沉淀时时的无机的无机盐浓盐浓度范度范15蛋白质沉淀的速度可用蛋白质沉淀的速度可用 -对盐饱和度（对盐饱和度（P P）作图来表示：作图来表示：dSdP 620 30 40 50 60 704820dSdP 蛋白质溶解度随蛋白质溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率饱和度而变化的速率P利用不同利用不同蛋白质盐析分布蛋白质盐析分布曲线曲线在横轴上的位置不同，在横轴上的位置不同，可采取可采取先后加入不同量无先后加入不同量无机盐机盐的办法来分级沉淀蛋的办法来分级沉淀蛋白质。白质。蛋白蛋白质质沉淀的速度可用沉淀的速度可用-对盐饱对盐饱和度（和度（P）作）作图图来表示：来表示：d162.2.蛋白质浓度的影响蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。随浓度提高，盐用量减少随浓度提高，盐用量减少。640 50 60 70 804820dSdP P不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线3g/L30g/L分级沉淀分级沉淀：将溶液稀释，使重叠将溶液稀释，使重叠曲线拉开距离曲线拉开距离制取成品制取成品：提高蛋白质浓度提高蛋白质浓度2.蛋白蛋白质浓质浓度的影响度的影响 蛋白蛋白质浓质浓度不同，沉淀所需无机度不同，沉淀所需无机盐盐用量也不用量也不173.3.温度的影响温度的影响低盐浓度：温度升高，溶解度升高低盐浓度：温度升高，溶解度升高高盐浓度：温度升高，溶解度降低高盐浓度：温度升高，溶解度降低 温度适当提高有利于蛋白质沉淀。温度适当提高有利于蛋白质沉淀。高温容易导致蛋白质变性。高温容易导致蛋白质变性。蛋白质盐析一般在蛋白质盐析一般在室温室温下进行，某些温度下进行，某些温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。3.温度的影响低温度的影响低盐浓盐浓度：温度升高，溶解度升高度：温度升高，溶解度升高 温度适当提高温度适当提高18 4.pH 4.pH的影响的影响 蛋白质在蛋白质在pIpI时的溶解度最小，最容易从时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质的的pIpI附近。附近。耗盐少，蛋白质收率也高耗盐少，蛋白质收率也高 4.pH的影响的影响19 5.5.操作方式的影响操作方式的影响 10 50 60 70 饱和度饱和度（%）52.51 酶活性活性 U/ml操作方式对延胡索酸酶盐析的影响操作方式对延胡索酸酶盐析的影响固体，固体，间歇间歇12h12h饱和溶液，饱和溶液，间歇间歇12h12h饱和溶液，饱和溶液，连续连续12h饱和溶液，饱和溶液，连续连续1.6min采用间歇方式所需盐量比连续方式少；采用间歇方式所需盐量比连续方式少；间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。5.操作方式的影响操作方式的影响 10 50 20 6.6.盐析法的优缺点盐析法的优缺点（1 1）优点：）优点：室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活；活；非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单，操作方便。设备简单，操作方便。6.盐盐析法的析法的优优缺点（缺点（1）优优点：点：21 （2 2）缺点：）缺点：沉淀物中含有大量盐析剂沉淀物中含有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上直接用于医药上 盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。（2）缺点：）缺点：盐盐析法可以作析法可以作为为初始的提取方法，再与多种精制初始的提取方法，再与多种精制22