沉淀法生物工程下游技术-课件

沉淀法生物工程下游技术沉淀法的目的:(通过沉淀达到浓缩的目的,从而降低了后续的生产费用与简化了后续的生产工艺;(沉淀方法可有选择地沉淀所需成分或有选择地沉淀杂质,起到初步分离的作用;(将蛋白质由液态变成固态,幸免了蛋白质的降解,提高了其稳定性;u关于小分子生化物质常采纳等电点沉淀或形成复盐沉淀。如抗生素生产中,四环素可用等电点或尿素复盐沉淀法,链霉素与苯甲胺缩合形成希夫碱沉淀,并在酸性条件下分解以制得成品。u关于大分子生化物质常采纳盐析、有机溶剂、等电点及亲与沉淀方法。沉淀法的应用沉淀法的分类依照所加入的沉淀剂的不同,沉淀法能够分为:(1 1)盐析法;(2 2)等电点沉淀法;(3 3)有机溶剂沉淀法;(4 4)亲与沉淀法;(4 4)非离子型聚合物沉淀法;(5 5)聚电解质沉淀法;(6 6)复合盐沉淀法等;(7 7)选择性沉淀法。蛋白质的溶解特性n在水溶液中,多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势,即便如此,一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面,形成疏水区。n亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。n蛋白质是两性电解质,因此,蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区与疏水区构成。蛋白质分子表面的疏水区域与荷电区域防止蛋白质凝聚沉淀的屏障蛋白质周围的水化层(hydration shell)hydration shell),蛋白质分子间静电排斥作用。蛋白质水化层的厚度与电位与溶液性质紧密相关,如温度、pHpH值、介电常数与离子强度。盐析法当中性盐加入蛋白质分散体系时估计出现以下两种当中性盐加入蛋白质分散体系时估计出现以下两种情况情况:(1 1 1 1)“)“)“)“盐溶盐溶”现象现象(salt-in)(salt-in)(salt-in)(salt-in)低盐浓度下低盐浓度下,增加蛋白增加蛋白质分子间静电斥力质分子间静电斥力,随着中性盐离子强度的增加随着中性盐离子强度的增加,蛋白质溶解度增大蛋白质溶解度增大 。(2 2 2 2)“)“)“)“盐析盐析”现象现象(salt-out)(salt-out)(salt-out)(salt-out)高盐浓度下高盐浓度下,中与电中与电荷、破坏水化膜荷、破坏水化膜,蛋白质溶解度随之下降蛋白质溶解度随之下降 。盐析法原理(1 1)破坏水化膜,分子间易碰撞聚集(2 2)破坏水化膜,暴露出疏水区域(3 3)中与电荷,减少静电斥力 S=-S=-s sS S蛋白质的溶解度,g/L;g/L;I I离子强度,I=1/2mI=1/2mi iz zi i2 2 m mi i离子 i i的摩尔浓度;ZiZi所带电荷常数,图中截距KsKs盐析常数,图中直线斜率CohnCohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系盐析操作1 1)加入固体盐法 用于要求饱与度较高而不增大溶液体积的情况,工业上常采纳这种方法。2 2)加入饱与溶液法 用于要求饱与度不高而原来溶液体积不大的情况。3 3)透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中,然后浸入饱与硫酸铵中进行透析,袋内饱与度逐渐提高,达到设定浓度后,目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性同时缓慢,盐析效果好,故多用于结晶。l l盐析作用要强盐析作用要强l l需有较大的溶解度需有较大的溶解度l l盐溶液密度不高盐溶液密度不高l l盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的l l来源丰富、经济来源丰富、经济例如:盐析中常用的盐:硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。盐析用盐的选择一般的规律为:半径小的高价阴离子的盐析作用较强。例如:阴离子盐析效果:柠檬酸POPO4 43-3-SOSO4 42-2-CHCH3 3COOCOO-ClCl-NONO3 3-SCNSCN-阳离子盐析效果:NHNH4 4+K K+NaNa+Mg2+阴离子对蛋白质溶解度的影响大于阳离子。1 1、盐浓度)盐浓度u在进行分离的时候,一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后,经过过滤或冷冻离心收集,再在溶液中逐渐提高中性盐的饱与度,使另一种蛋白质组分盐析出来。影响盐析效果的因素盐析用盐量的确定-饱与度:u目标蛋白质在盐析沉淀操作之前,所需的中性盐的浓度可通过实验确定。u对多数蛋白质,当达到85%85%饱与度时,溶解度都小于 0 0、l mgl mgL L,通常为兼顾收率与纯度,饱与度的操作范围在40%-60%40%-60%之间。分段盐析(fractional salting out)硫酸铵的饱 与 度/%沉淀的蛋白质硫酸铵的饱 与 度/%沉淀的蛋白质20纤维蛋白质50白蛋白2833优球蛋白80肌红蛋白3350拟球蛋白l可在较低饱与度下先除去杂蛋白,然后在较高的饱与度下,沉淀目标蛋白质,称为分段盐析。l分段盐析时,可选择稀一些的蛋白质溶液,使共沉淀作用减至最低限度。表1 1 血浆蛋白的分段盐析结果2 2、蛋白质种类与浓度n组成相近的蛋白质,分子量越大,沉淀所需盐的量越少;蛋白质分子不对称性越大,也越易沉淀。n不同浓度的同种蛋白质溶液要产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。蛋白质浓度大时,用盐少,沉淀作用强,蛋白质溶解损失小。一般常将蛋白质的含量控制在2 23%3%为宜。影响盐析效果的因素u对起始浓度为 30g/L30g/L的碳氧肌红蛋白溶液,目标蛋白在硫酸铵饱与度为 58-6558-65之间沉淀出来;u当稀释1010倍时,饱与度达到66%66%时才开始沉淀,而相应的沉淀范围为66-73%66-73%饱与度。硫酸铵盐析过程目标蛋白的最适饱与度是多少？204060800100总蛋白目标蛋白质上清液蛋白浓度3 3、pHpH值u为提高盐析效率,多将溶液pHpH值调到目标蛋白的等电点处。u在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的,需依照实际情况调整溶液pHpH值,以达到最好的盐析效果。影响盐析效果的因素在进行盐折时,必须控制pHpH图中直线都相互平行pH值盐析影响因素:4、温度的影响u在高盐浓度下,大部分蛋白质的溶解度随温度上升而下降。u在一般情况下,盐析可在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-40-4进行。盐析法特点1.成本低,操作简单、安全;2.在中性温与的环境中,可不能引起蛋白质变性;3.盐析后要透析或超滤去盐;4.只是作为初步的分离纯化,还需要结合其它的纯化方法。等电点沉淀法等电点沉淀:在低离子强度下,调pHpH至等电点,使蛋白质所带净电荷为零,降低了静电斥力,而疏水力能使分子间相互吸引,形成沉淀。pH=pI等电点沉淀法注意事项F本法适用于疏水性较强的蛋白质;例如:酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶,则在低离子强度的溶液中,调 pH在等电点并不产生沉淀。F蛋白质的等电点易受盐离子的影响发生变化;自然界中,蛋白质较易结合阴离子,使等电点向酸侧移动。低离子强度下,pH约等于等电点。F在调节等电点时,要注意防止酶的失活或蛋白变性。一般使用可用乙酸、碳酸等弱酸与碳酸钠等弱碱。F蛋白质在等电点附近盐溶作用明显,必须控制溶液较高的离子强度。F等电点沉淀法往往不能获得高的回收率,通常与其他沉淀方法结合使用;l l定定义义:在在含含有有溶溶质质的的水水溶溶液液中中加加入入一一定定量量亲亲水水的的有有机机溶剂溶剂,降低溶质的溶解度降低溶质的溶解度,使其沉淀析出。使其沉淀析出。l l优点优点:1 1)分辨能力比盐析法高;2 2)沉淀不用脱盐;3 3)离心收集较为容易;4 4)溶剂沸点较低,除去回收方便。l l缺点缺点:1 1)容易引起变性失活;2 2)操作要求在低温下进行;3 3)有机溶剂易挥发,需有防护。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法机理有机溶剂沉淀法原理 A 降低溶剂介电常数B 破坏水化膜C 相反力表2 一些有机溶剂的介电常数溶剂介电常数溶剂介电常数水802、5M尿素8420%乙醇705M尿素9140%乙醇60丙酮2260%乙醇48甲醇33100%乙醇24丙醇232、5M 甘氨酸137常用的有机溶剂(水溶性要好(介电常数要小(致变性作用要小(毒性要小、挥发性适中(容易获取常用的有机溶剂:乙醇、甲醇与丙酮 1 1、温度使用有机溶剂沉淀时,操作必须在低温下进行,u有机溶剂要预冷,并缓缓加入伴随不断搅拌,一是防止溶液局部升温,二是为了防止局部过浓引起变性作用与分辨率下降。u温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力。大多数蛋白质在乙醇-水体系中溶解度随温度降低而减少,低温对提高收率也是有利的。有机溶剂沉淀法的影响因素 2 2、pHpH值:许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果。3 3、样品浓度:样品较稀时,将增加有机溶剂投入量,降低了样品的回收率;样品太浓,会增加共沉作用。一般认为蛋白质的初浓度以0 0、5 52 2为好,粘多糖则以1 12 2较合适。4 4、中性盐浓度:较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用,减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0 0、01010 0、05mol/L05mol/L为好,常用的中性盐为氯化钠等。有机溶剂沉淀法的影响因素例:调pH4、2 上清液胰岛素粗品溶液 30%丙酮 沉淀(杂蛋白)上清液调pH6、0 上清液 Zn2+胰岛素锌盐 举例:固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶(米曲霉)菌体+水 过滤 水抽提清液 加乙醇(70%)搅拌 -淀粉酶*pH影响 收率 酶活 6、5 pH *适宜的pH 5、6 6、0 *温度影响 酶活 收率 10 20 T *适宜的温度10 20 水溶性非离子型聚合物机理:与有机溶剂相似,破坏蛋白质的水化膜。常用非离子性聚合物:聚乙二醇(PEG)PEG):是一种水溶性的高分子聚合物,分子量 4,000 4,000 以上的 PEG PEG 能够用来沉淀蛋白质。还有葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯等。优缺点:1 1、可在室温下进行2 2、沉淀颗粒大,易于收集 3 3、能够稳定蛋白质4 4、PEG PEG 难去除用聚乙二醇等非离子性聚合物一般用来沉淀核酸(如质粒)与酶。多聚电解质沉淀 机理:架桥与静电,与絮凝剂类似。n离子型多糖聚合物,酸性多糖、羧甲基纤维素、海藻酸钠。n合成的离子聚合物:n聚丙烯酸n聚苯乙烯季胺盐n聚甲基丙烯酸n聚乙烯亚胺此类沉析剂有以下三种:(1)高价金属盐:Cu2+,Ag2+,Zn2+,Ca2+与酸性基团结合;(2)苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等,与碱性基团结合;(3)无机复合盐:磷钨酸盐、磷钼酸盐等优点:以上盐类复合物的溶解度特别低,极容易沉淀析出。缺点:容易导致活性蛋白的不可逆变性,需采纳较温与的条件。成盐类复合物沉淀)金属离子沉淀n金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特别部位(如羧基、氨基、咪唑基与巯基)起反应造成的。例如Zn2+Zn2+易与组氨酸残基中咪唑基结合,从而降低蛋白质的溶解度。n能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子,如:MnMn2+2+、FeFe2+2+、o o2+2+、NiNi2+2+、u u2+2+、ZnZn2+2+、CdCd2+2+;n能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子,如:CaCa2+2+、BaBa2+2+、MgMg2+2+、PbPb2+2+;n能巯基化合物强烈结合的一些金属离子,如:g g2+2+、AgAg2+2+、PbPb2+2+。选择性变性沉淀法 选择性变性沉淀法:选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质变性沉淀下来,而与目的物分开。分离核酸l l沉淀剂沉淀剂:酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等l l目的目的:使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离,蛋白质变性沉淀蛋白质变性沉淀,核酸则存核酸则存在于水溶液中。在于水溶液中。例如:n在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇,振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去,核酸仍然留在水溶液中。n在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下,用苯酚-水溶液提取核酸,而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去。分离多糖n n沉淀剂沉淀剂:CTABCTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物十六烷基三甲基季铵盐溴化物)CPC CPC(十六烷基氯化吡啶十六烷基氯化吡啶)n n原理原理:季铵基团上的阳离子季铵基团上的阳离子与多糖上的阴离子形与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物成形成季铵络合物,降低离子强度降低离子强度,络合物析出络合物析出,但当离子强度增加到一定范围时但当离子强度增加到一定范围时,络合物解离络合物解离,最后溶解。最后溶解。沉淀剂:三氯乙酸例如用2 2、5%5%三氯乙酸处理胰蛋白酶、抑肽酶或细胞色素c c粗提取液,均可除去大量杂蛋白,而对所提取的酶活力没有影响。但使用前,必须对酶的酸碱稳定性有足够了解,使用时一般应注意环境条件温与(如低温段时间)分离蛋白质各种沉淀方法应用范围盐析法:多用于各种蛋白质与酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法:多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化,有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法:用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少,多与其它方法结合使用。非离子聚合物沉淀法:用于分离生物大分子。生成盐类复合物沉淀:多用于小分子物质的沉淀。选择性沉淀:多用于除去某些不耐热的与在一定条件下易变性的杂蛋白。亲与沉淀affinity precipitation 原理:是一种将生物专一性识别与沉淀分离相结合的分离纯化技术。可逆性溶解聚合物在溶液中与目标分子专一性结合后,在一定条件下形成可逆性沉淀,从而使目标分子形成沉淀从固相分离出来。可逆性溶解聚合物(soluble and insoluble polymers,SIS)uSIS上的功能基团能够直截了当与蛋白质结合发生亲与沉淀,有时也需要将亲与配基结合在SIS上。u在物理条件(如pH值、离子强度、温度等)改变时,待分离的生物分子与SIS发生可逆性沉淀。SIS的种类upH值敏感型SIS:聚合物的溶解性与自身所带电荷多少相关,当它的净电荷减少时,自身溶解度降低而沉淀。1.天然可逆性聚合物:脱乙酰壳聚糖(pH6pH6时可溶)、藻酸盐;2.合成可逆性聚合物:甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的聚合物(Eudragit S-100Eudragit S-100在4 4、5pH55pH00、17M17M时,快速完全沉淀。感谢您的聆听！