蜡样芽胞杆菌检测--课件

蜡样芽胞杆菌检测Examination of Bacillus cereus1PPT课件课件蜡样芽胞杆菌检测Examination of Bacill蜡蜡样芽芽胞胞杆杆菌菌(Bacillus cereus)是芽胞杆菌属（Bacillus）的一种，属于土壤细菌。在自然界广泛分布于尘土、污水、河流和食品中，在蔬菜、谷类等农作物和食品原料中主要以芽胞状态存在。已从多种食品中分离出该菌。涉及的食品有米、肉、乳制品、蔬菜、鱼、糊、调味汁、布丁、汤、糕点、沙拉等。在食品混合物如酱油、布丁、汤、红烧蔬菜炖肉中也发现该菌。1950年首次在挪威明确报告其致病作用。2 2PPT课件课件蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是芽胞杆菌属（蜡蜡样芽芽胞胞杆杆菌菌引引起起的的食食物物中中毒毒蜡样芽胞杆菌食物中毒以夏季（蜡样芽胞杆菌食物中毒以夏季（6 6 10 10月）月）最高。最高。引起中毒的食品往往由于食前保存温度不当，引起中毒的食品往往由于食前保存温度不当，放置时间较长或食品加热不彻底而导致中毒。放置时间较长或食品加热不彻底而导致中毒。3 3PPT课件课件蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒蜡样芽胞杆菌食物中毒以夏季（6 蜡蜡样芽芽胞胞杆杆菌菌引引起起的的食食物物中中毒毒该菌引起的食物中毒发病率较高该菌引起的食物中毒发病率较高有可能在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌有可能在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌一般认为该菌为条件致病菌，中毒是产生肠毒一般认为该菌为条件致病菌，中毒是产生肠毒素所致素所致 进食其中污染菌量进食其中污染菌量10105 5g g的食物时，就可能发的食物时，就可能发生食物中毒。生食物中毒。4 4PPT课件课件蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒该菌引起的食物中毒发病率较高4PP引引起起食食物物中中毒毒的的原原因因肠毒毒素素呕吐毒素：一种环形，小分子量、热稳定多一种环形，小分子量、热稳定多肽，肽，10010030min30min不能被破坏，为引起呕吐型中不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。毒的致病因素，常在米饭中形成。腹泻毒素：一种大分子量蛋白，水样腹泻、一种大分子量蛋白，水样腹泻、腹部痉挛和疼痛，呕吐很少见。能在各种食物腹部痉挛和疼痛，呕吐很少见。能在各种食物中形成中形成;5 5PPT课件课件引起食物中毒的原因肠毒素呕吐毒素：一种环形，小分子量、热稳引引起起食食物物中中毒毒的的主主要要食食物物种种类 美国美国 炒米饭炒米饭欧洲欧洲 甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品甜点、肉饼、色拉、奶和肉制品中国中国 米饭、淀粉类制品米饭、淀粉类制品6 6PPT课件课件引起食物中毒的主要食物种类 美国 炒米饭6PPT课件 在国内，于在国内，于19731973年首次报告了南京某托儿年首次报告了南京某托儿所儿童因进食泡饭引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食所儿童因进食泡饭引起呕吐型蜡样芽胞杆菌食物中毒后，至今除西藏外，每个省、自治区、物中毒后，至今除西藏外，每个省、自治区、直辖市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食直辖市已经都有报，有些地区甚至占细菌性食物中毒的首位。物中毒的首位。7 7PPT课件课件 在国内，于1973年首次报告了南京某托儿所儿童因进食泡临临床床表表现现“呕吐型呕吐型”：潜伏期为：潜伏期为0.5h0.5h5h5h，是由于人摄，是由于人摄入本菌在食品中产生的毒素引起的，原因食品入本菌在食品中产生的毒素引起的，原因食品主要为米饭类、面类（挂面、荞麦面饼）等。主要为米饭类、面类（挂面、荞麦面饼）等。症状以恶心、呕吐为主，病程不超过症状以恶心、呕吐为主，病程不超过24h24h。“腹泻型腹泻型”：潜伏期为：潜伏期为8h8h16h16h，是由于本菌，是由于本菌在肠道内增殖过程中产生肠毒素引起的，原因在肠道内增殖过程中产生肠毒素引起的，原因食品主要为肉类、肉汤和其它食物。症状为水食品主要为肉类、肉汤和其它食物。症状为水泻、腹痛、腹痉挛为主，病程约泻、腹痛、腹痉挛为主，病程约24h24h。8 8PPT课件课件临床表现“呕吐型”：潜伏期为0.5h5h，是由于人摄入本菌芽胞杆菌属 7070个种，临床上可以分离到的有一下种类：个种，临床上可以分离到的有一下种类：9 9PPT课件课件芽胞杆菌属9PPT课件1010PPT课件课件10PPT课件蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群。1111PPT课件课件蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群。11PPT课件蜡蜡样芽芽胞胞杆杆菌菌生生物物学学特特性性革兰氏阳性大杆菌，需氧或兼性需氧芽胞位于菌体的中心或次末端，不突出菌体菌体两端较平整，多呈链状排列生长温度2537，最佳30351212PPT课件课件蜡样芽胞杆菌生物学特性革兰氏阳性大杆菌，需氧或兼性需氧芽胞位在在营养肉养肉汤中中32培养培养3d后，芽胞形成后，芽胞形成率在率在90以上，以上，80-85 水浴水浴5min-10min可刺激芽胞萌可刺激芽胞萌发。1313PPT课件课件在营养肉汤中32培养3d后，芽胞形成率在90以上，80新新国国标编制制说明明背景现行标准不足处重新修订的意义1414PPT课件课件新国标编制说明背景现行标准不足处重新修订的意义14PPT课件新新国国标编制制说明明为了在食品中有效开展蜡样芽胞杆菌检测，以为了在食品中有效开展蜡样芽胞杆菌检测，以保障食品安全，降低蜡样芽胞杆菌感染的风险，保障食品安全，降低蜡样芽胞杆菌感染的风险，防止食源性蜡样芽胞杆菌疾病的发生，我国在防止食源性蜡样芽胞杆菌疾病的发生，我国在19841984年制定了年制定了食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 蜡样蜡样芽胞杆菌检验芽胞杆菌检验（GB/T 4789.14-1988GB/T 4789.14-1988）标准，）标准，该标准的颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测，为该标准的颁布为蜡样芽胞杆菌的规范检测，为蜡样芽胞杆菌病的监测、预防、控制起到了重蜡样芽胞杆菌病的监测、预防、控制起到了重要的作用。要的作用。1515PPT课件课件新国标编制说明为了在食品中有效开展蜡样芽胞杆菌检测，以保障食背背景景 在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞杆菌检测标准经过杆菌检测标准经过19941994年、年、20032003年二次修订，年二次修订，但内容可以说完全与但内容可以说完全与19841984年版相同。年版相同。1616PPT课件课件背景 在以后的二十年时间里，食品中蜡样芽胞杆菌检测标准经现现行行G GB B/T T 4 47 78 89 9.1 14 4-2 20 00 03 3标标准准不不足足处处1.1.对蜡样芽胞杆菌含量少于对蜡样芽胞杆菌含量少于1000cfu/g1000cfu/g的样品的样品计数效果差。计数效果差。2.2.采用的采用的361361培养温度并非是蜡样芽胞培养温度并非是蜡样芽胞杆菌最适生长条件。杆菌最适生长条件。3.3.检验结果与现行的其它国家的标准存在一定检验结果与现行的其它国家的标准存在一定差异。差异。1717PPT课件课件现行GB/T 4789.14-2003标准不足处1.对蜡样重新修订的意义提高提高检出率出率扩大大检测范范围与国与国际接接轨适用性适用性和可操和可操作性作性1818PPT课件课件重新修订的意义提高检出率扩大检测范围与国际接轨适用性和可操作提提高高检出出率率 蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为30303232。经标准修订协作组验证：经标准修订协作组验证：30 1 30 1 培养培养48h48h，平均生长率，平均生长率93.69%93.69%。30 1 30 1 培养培养24 h24 h，平均生长率，平均生长率92.28%92.28%。36 1 36 1 培养培养24 h24 h。平均生长率。平均生长率82.32%82.32%。1919PPT课件课件提高检出率 蜡样芽胞杆菌的最佳生长温度为3032。1提提高高检出出率率经统计学分析，经统计学分析，30 1 30 1 培养温度的培养温度的生长率显著高于生长率显著高于36 1 36 1 (P0.05(P0.05），但在培养温度相同的情况），但在培养温度相同的情况下，培育时间下，培育时间24h24h和和48h48h蜡样芽胞杆菌生蜡样芽胞杆菌生长率无显著差异（长率无显著差异（P0.05P0.05）。）。2020PPT课件课件提高检出率经统计学分析，30 1 培养温度的生长率显著表表表表1 MYP1 MYP培养条件培养条件培养条件培养条件选择选择结结果果果果2121PPT课件课件 表1 MYP培养条件选择结果扩大大检测范范围在定量检测方面，美国在定量检测方面，美国FDAFDA、ISOISO、以及、以及SN SN 0176-920176-92标准除采用平板计数外，还采用了标准除采用平板计数外，还采用了MPNMPN法。法。新标准增加新标准增加MPNMPN法，以弥补样品中蜡样芽胞杆法，以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于菌带菌量少于10103 3 cfu/mL cfu/mL时用平板计数法计数时用平板计数法计数不准的问题；不准的问题；该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。推广使用。2222PPT课件课件扩大检测范围在定量检测方面，美国FDA、ISO、以及SN 0便便于于与与国国际际接接轨轨随着经济全球化的发展，食品贸易随着经济全球化的发展，食品贸易不断扩大，食品安全问题越来越到受各不断扩大，食品安全问题越来越到受各国政府的重视，为了保护我国消费者健国政府的重视，为了保护我国消费者健康，避免贸易摩擦，急需对原标准进行康，避免贸易摩擦，急需对原标准进行修订，使其与国际接轨。修订，使其与国际接轨。2323PPT课件课件便于与国际接轨 随着经济全球化的发展，食品贸易不断扩大提提高高方方法法的的适适用用性性和和可可操操作作性性新标准将考虑我国的实际情况，使蜡新标准将考虑我国的实际情况，使蜡样芽胞杆菌检测方法具有更好的适用性样芽胞杆菌检测方法具有更好的适用性和可操作性。并保持与原标准的连续性。和可操作性。并保持与原标准的连续性。2424PPT课件课件提高方法的适用性和可操作性 新标准将考虑我国的实际情况，新新标标准准与与G GB B/T T 4 47 78 89 9.1 14 4-2 20 00 03 3相相比比主主要要修修改改如如下下:-修改了修改了标准的中英文名称；准的中英文名称；-增加了第二法增加了第二法 蜡蜡样芽胞杆菌芽胞杆菌MPN 计数法；数法；-将将选择性分离培养基（性分离培养基（MYP）培养条件由）培养条件由37 培培12 h-20 h改改为30 1 培养培养24 h-48 h；-增加了根状生增加了根状生长试验和溶菌和溶菌酶试验。-增加了附增加了附录A、附、附录B。2525PPT课件课件新标准与GB/T 4789.14-2003相比主要修改如下:食品安全国家标准食品安全国家标准 食品微生物学检验食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验蜡样芽胞杆菌检验（修订版）（修订版）2626PPT课件课件食品安全国家标准 食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验（修1 1 范范围围本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法。验方法。本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数；第较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数；第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。2727PPT课件课件1 范围本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法。27PPT2 2 设设备备和和材材料料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：冰箱：2-5;恒温培养箱：30 1、36 1;均质器;电子天平：感量0.1 g;无菌锥形瓶：100 mL、500 mL;无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头;无菌平皿：直径90 mm;无菌试管：18 mm180 mm;显微镜：10倍-100倍（油镜）;L涂布棒。2828PPT课件课件2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和3 3 培培养养基基和和试试剂剂3.1 磷酸磷酸盐缓冲液（冲液（PBS）3.2 甘露醇卵黄多黏菌素（甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂脂3.3 胰酪胰酪胨大豆多黏菌素肉大豆多黏菌素肉汤3.4 营养养琼脂脂 3.5过氧化氧化氢溶液溶液 3.6动力培养基力培养基 3.7硝酸硝酸盐肉肉汤 3.8酪蛋白酪蛋白琼脂脂 2929PPT课件课件3 培养基和试剂3.1 磷酸盐缓冲液（PBS）29PPT课3 3 培培养养基基和和试试剂剂3.9 硫酸硫酸锰营养养琼脂培养基脂培养基 3.10 糖糖发酵管酵管 3.11 V-P培养基培养基 3.12 胰酪胰酪胨大豆羊血（大豆羊血（TSSB）琼脂脂 3.13 溶菌溶菌酶营养肉养肉汤 3.14 西蒙氏西蒙氏柠檬酸檬酸盐培养基培养基 3.15 明胶培养基明胶培养基 3030PPT课件课件3 培养基和试剂3.9 硫酸锰营养琼脂培养基 30PPT课件蜡蜡样芽胞杆菌平板芽胞杆菌平板计数法（第一法）数法（第一法）3131PPT课件课件蜡样芽胞杆菌平板计数法（第一法）31PPT课件4 检验程程序序3232PPT课件课件4 检验程序32PPT课件5 操作步操作步骤3333PPT课件课件5 操作步骤33PPT课件5 5.1 1 样样品品处处理理冷冻样品应在45以下不超过15 min或在28不超过18 h解冻。若不能及时检验，应放于-15左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应置于28冰箱保存，在24 h内检验。3434PPT课件课件5.1 样品处理冷冻样品应在45以下不超过15 min或在5.2样品品制制备 以无菌操作取样品以无菌操作取样品25 g25 g（mLmL），加入），加入PBS 225 PBS 225 mLmL，用旋转刀片式均质器以，用旋转刀片式均质器以8000 r/min8000 r/min10000 r/min10000 r/min均质均质1 min1 min2 min2 min，或拍击式均，或拍击式均质器拍击质器拍击2 min2 min。如无均质器，则将样品放入。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后称取无菌乳钵中磨碎，然后称取25 g25 g（mLmL）置合适）置合适的容器中，加的容器中，加225 mL PBS225 mL PBS，充分振荡混匀。制，充分振荡混匀。制成成1:101:10的样品匀液。的样品匀液。3535PPT课件课件5.2样品制备以无菌操作取样品25 g（mL），加入PB5.3 样品品的的稀稀释吸取上述吸取上述1:101:10的样品匀液的样品匀液1 mL1 mL加到装有加到装有9 mL 9 mL PBSPBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1:1001:100的样品匀液。的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 1次，换用次，换用1 1支支1mL1mL无菌吸管或吸头。无菌吸管或吸头。3636PPT课件课件5.3 样品的稀释吸取上述1:10的样品匀液1 mL加到装有5.4样品品接接种种根据对样品污染状况的估计，选择根据对样品污染状况的估计，选择2 2个个 3 3个个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以，以0.3 mL0.3 mL、0.3 mL0.3 mL、0.4 mL 0.4 mL 接种量分别入接种量分别入三块三块MYPMYP琼脂平板，然后用无菌琼脂平板，然后用无菌L L棒涂布整个平棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。板，注意不要触及平板边缘。使用前，如使用前，如MYPMYP琼脂平板表面有水珠，可放在琼脂平板表面有水珠，可放在25 25 50 50 的培养箱里干燥，直到平板表的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。面的水珠消失。3737PPT课件课件5.4样品接种根据对样品污染状况的估计，选择2个 3个适5.5分分离离、培培养养5.5.1 5.5.1 分离分离在通常情况下，涂布后，将平板静置在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱如样液不易吸收，可将平板放在培养箱30 30 1 1 培养培养1 h1 h，等样品匀液吸收后翻转平，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，皿，倒置于培养箱，30 1 30 1 培养培养24 h2 24 h2 h h。如果菌落不典型，可继续培养如果菌落不典型，可继续培养24 h2 h24 h2 h再观再观察。察。3838PPT课件课件5.5分离、培养5.5.1 分离38PPT课件分离分离 在在MYPMYP琼脂平板琼脂平板上，典型菌落为微粉上，典型菌落为微粉红色红色(表示不发酵甘表示不发酵甘露醇露醇)，周围有白色，周围有白色至淡粉红色沉淀环至淡粉红色沉淀环（表示产卵磷脂酶）（表示产卵磷脂酶）。3939PPT课件课件 分离 在MYP琼脂平板上，典型菌落为微粉红色(表5.5.2 纯培培养养从每个平板中至少挑取从每个平板中至少挑取3 3个典型菌落（小于个典型菌落（小于3 3个个全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培全选），分别划线接种于营养琼脂平板做纯培养，养，30 1 30 1 培养培养24 h2 h24 h2 h，进行确证实，进行确证实验。验。在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有在营养琼脂平板上，典型菌落为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm 4 mm 10 mm 10 mm。4040PPT课件课件5.5.2 纯培养从每个平板中至少挑取3个典型菌落（小于3个营养养琼脂脂平平板板纯化化培培养养4141PPT课件课件营养琼脂平板纯化培养41PPT课件6 6确确证证实实验验 6.16.1形态形态挑取纯培养的单个菌落，作革兰氏染色镜检。挑取纯培养的单个菌落，作革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞大杆菌，大小蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞大杆菌，大小为（为（1 11.31.3）mm（3 35 5）mm，芽胞呈椭圆，芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体形位于菌体中央或偏端，不膨大于菌体，菌体两端较平整，多呈短链或长链状排列。两端较平整，多呈短链或长链状排列。4242PPT课件课件6确证实验6.1形态42PPT课件蜡样芽胞杆菌革兰氏染色蜡样芽胞杆菌革兰氏染色4343PPT课件课件蜡样芽胞杆菌革兰氏染色43PPT课件蕈状芽胞杆菌革蕈状芽胞杆菌革蕈状芽胞杆菌革蕈状芽胞杆菌革兰兰氏染色氏染色氏染色氏染色菌体，游离芽胞4444PPT课件课件蕈状芽胞杆菌革兰氏染色菌体，游离芽胞44PPT课件巨大芽胞杆菌巨大芽胞杆菌巨大芽胞杆菌巨大芽胞杆菌4545PPT课件课件巨大芽胞杆菌45PPT课件6 6.2 2生生化化鉴鉴定定挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、挑取纯培养的单个菌落，进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶菌酶耐性试验、溶菌酶耐性试验、V-PV-P试验、葡萄糖利用试验、葡萄糖利用(厌氧厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。晶试验。蜡样芽胞杆菌的主要生化特征见表蜡样芽胞杆菌的主要生化特征见表1 1。4646PPT课件课件6.2生化鉴定46PPT课件表表表表1 1 蜡蜡蜡蜡样样芽胞杆菌的主要生化特征芽胞杆菌的主要生化特征芽胞杆菌的主要生化特征芽胞杆菌的主要生化特征4747PPT课件课件表1 蜡样芽胞杆菌的主要生化特征47PPT课件蜡蜡蜡蜡样样芽胞杆菌生化特征芽胞杆菌生化特征芽胞杆菌生化特征芽胞杆菌生化特征过氧化氢酶；葡萄糖利用（厌氧）；硝酸盐还原；V-P试验；甘露醇产酸；酪蛋白分解；4848PPT课件课件蜡样芽胞杆菌生化特征过氧化氢酶；葡萄糖利用（厌氧）；硝酸6.2.1 溶溶血血试验 挑取纯培养的单个可疑菌落接种于挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSBTSSB琼琼脂平板上，脂平板上，30 1 30 1 培养培养24 h2 h24 h2 h。蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似蜡样芽胞杆菌菌落为浅灰色，不透明，似白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。白色毛玻璃状，有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈现弱的溶血现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽现象，而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血，巨大芽胞杆菌为不溶血。胞杆菌为不溶血。4949PPT课件课件6.2.1 溶血试验 挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TS蜡样芽胞杆菌完全溶血环（蜡样芽胞杆菌完全溶血环（蜡样芽胞杆菌完全溶血环（蜡样芽胞杆菌完全溶血环（24h24h24h24h）5050PPT课件课件蜡样芽胞杆菌完全溶血环（24h）50PPT课件苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，巨大芽胞杆菌不溶血。巨大芽胞杆菌不溶血。巨大芽胞杆菌不溶血。巨大芽胞杆菌不溶血。5151PPT课件课件苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌呈弱溶血现象，巨大芽胞杆菌不溶血6 6.2 2.2 2根根状状生生长长试试验验 挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上，挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上，30 1 30 1 培养培养24 h2 h24 h2 h。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。蕈状芽胞杆菌形成根状生长的特征。多数蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛玻璃状多数蜡样芽胞杆菌菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。或融蜡状的菌落。5252PPT课件课件6.2.2根状生长试验挑取单个可疑菌落划线接种于营养琼脂根根状状生生长5353PPT课件课件根状生长53PPT课件根状生根状生根状生根状生长长3030，24h24h培养，培养，室温放置室温放置3 3天后根天后根状生长观察。状生长观察。5454PPT课件课件根状生长30，24h培养，室温放置3天后根状生长观察。546 6.2 2.3 3蛋蛋白白质质毒毒素素结结晶晶试试验验 取经取经30 1 30 1 培养培养24 h2 h24 h2 h并于室温并于室温放置放置3 d3 d4 d4 d的营养琼脂培养物少许于载玻片的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，上，滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，加甲醇作用微火固定后，加甲醇作用30 s30 s后倾去，再通过后倾去，再通过火焰干燥，于载玻片上滴满火焰干燥，于载玻片上滴满0.50.5碱性复红，碱性复红，放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾放火焰上加热（微见蒸气，勿使染液沸腾)持持续续1 min1 min2 min2 min，移去火焰，再更换染色液再，移去火焰，再更换染色液再次加温染色次加温染色30 s30 s，倾去染液用洁净自来水彻底，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干后镜检。清洗、晾干后镜检。5555PPT课件课件6.2.3蛋白质毒素结晶试验 取经30 1 培观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。如发菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成的不丰富，应将培养物置室温现游离芽胞形成的不丰富，应将培养物置室温2 d2 d3 d3 d再行检查。放置再行检查。放置3d3d4d4d以上的苏云金以上的苏云金芽胞杆菌培养物有大量的结晶体，但是只有在芽胞杆菌培养物有大量的结晶体，但是只有在芽胞裂解通过上述染色方法才能见到。然而，芽胞裂解通过上述染色方法才能见到。然而，除非见到芽胞，否则培养物应在室温继续放置除非见到芽胞，否则培养物应在室温继续放置几天以重新检查毒素晶体。其它芽胞杆菌不产几天以重新检查毒素晶体。其它芽胞杆菌不产生蛋白质毒素晶体。生蛋白质毒素晶体。5656PPT课件课件观察有无游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形苏苏云金芽胞杆菌蛋白云金芽胞杆菌蛋白云金芽胞杆菌蛋白云金芽胞杆菌蛋白质质毒素毒素毒素毒素结结晶晶晶晶游离芽胞（浅红色）和染成深红色的菱形、正方形或其它形状的蛋白结晶体。5757PPT课件课件苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶游离芽胞（浅红色）和染成深红色苏苏云金芽胞杆菌蛋白云金芽胞杆菌蛋白云金芽胞杆菌蛋白云金芽胞杆菌蛋白质质毒素毒素毒素毒素结结晶晶晶晶5858PPT课件课件苏云金芽胞杆菌蛋白质毒素结晶58PPT课件蛋白蛋白质毒素毒素结晶形晶形态观察察芽孢形成期的菱形晶体蛋白芽孢形成期的菱形晶体蛋白扫描电镜观察（扫描电镜观察（20kv20kv，9.5mm9.5mm15.0k15.0k）光学显微镜观察光学显微镜观察 100 100倍油镜倍油镜5959PPT课件课件蛋白质毒素结晶形态观察芽孢形成期的菱形晶体蛋白 光学显6 6.2 2.4 4溶溶菌菌酶酶耐耐性性试试验验 用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，肉汤中，3636（or30or30）11 培养培养24h24h。蜡样。蜡样芽胞杆菌在本培养基（含芽胞杆菌在本培养基（含0.010.01溶菌酶）中能溶菌酶）中能生长。如出现阴性反应，应继续培养生长。如出现阴性反应，应继续培养24h24h。巨。巨大芽胞杆菌不生长。大芽胞杆菌不生长。6060PPT课件课件6.2.4溶菌酶耐性试验 用接种环取纯菌悬液一环，接种6 6.6 6生生化化分分型型 可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、解、V-PV-P试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成不同生化型别。胞杆菌分成不同生化型别。6161PPT课件课件6.6生化分型可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解7 结果果计算算7.1 7.1 典型菌落计数和确认典型菌落计数和确认7.1.1 7.1.1 选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板，且同一稀释度且同一稀释度3 3个平板所有菌落数合计在个平板所有菌落数合计在20 20 CFUCFU200 CFU200 CFU之间的平板，计数典型菌落数。之间的平板，计数典型菌落数。6262PPT课件课件7 结果计算7.1 典型菌落计数和确认62PPT课件如果：a）只有一个稀释度的平板菌落数在20CFU200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）所有稀释度的平板菌落数均小于20CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；6363PPT课件课件如果：63PPT课件d）若所有稀释度的平板菌落数大于200 CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e）若所有稀释度的平板菌落数均不在20 CFU-200 CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200 CFU时，应计数最接近20 CFU或200 CFU的稀释度平板上的典型菌落。以上按公式（1）计算。6464PPT课件课件d）若所有稀释度的平板菌落数大于200 CFU且有典型菌落，f f）若）若2 2 个连续稀释度的平板菌落数均在个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU-200 CFU20 CFU-200 CFU之间，按之间，按公式（公式（2 2）计算。）计算。4.4.1.24.4.1.2从典型菌落中至少挑取从典型菌落中至少挑取5 5个典型菌落（小于个典型菌落（小于5 5个全选），划个全选），划线接种于营养琼脂平板做纯培养，线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 1 30 1 培养培养24 h2 h24 h2 h。4.4.2 4.4.2 计算公式计算公式4.4.2.1 4.4.2.1 公式（公式（1 1）T=AB/CdT=AB/Cd(1)(1)式中：式中：T T样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；A A某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；某一稀释度蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；B B鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；C C用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；d d 稀释因子。稀释因子。6565PPT课件课件f）若2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU-200 公式（公式（2）)式中：T 样品中蜡样芽胞杆菌菌落数；A1第一稀释度（低稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；A2第二稀释度（高稀释倍数）蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数；B1第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数；C1第一稀释度（低稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；C2第二稀释度（高稀释倍数）用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数；1.1计算系数（如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；d 稀释因子（第一稀释度）。6666PPT课件课件公式（2）)式中：66PPT课件8 结果果报告告 根据根据MYPMYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，按公式计算，报告每按公式计算，报告每g g（mLmL）样品中蜡样芽胞）样品中蜡样芽胞杆菌菌数，以杆菌菌数，以CFU/g(mL)CFU/g(mL)表示；如表示；如T T值为值为0 0，则，则以小于以小于1 1乘以最低稀释倍数报告乘以最低稀释倍数报告。6767PPT课件课件8 结果报告 根据MYP平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数，蜡蜡样芽胞杆菌芽胞杆菌MPN计数法（第二法）数法（第二法）6868PPT课件课件蜡样芽胞杆菌MPN计数法（第二法）68PPT课件10.1-10.3 样品品处理、理、样品制品制备和和样品稀品稀释同平板同平板计数法数法6969PPT课件课件10.1-10.3 样品处理、样品制备和样品稀释同平板计数法10.4 样品品接接种种取三个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品取三个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），接种于可包括原液），接种于10 mL10 mL胰酪胨大豆多粘胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，每一稀释度接种菌素肉汤中，每一稀释度接种3 3管，每管接种管，每管接种1 1 mLmL（如果接种量需要超过（如果接种量需要超过1 mL1 mL，则用双料胰酪，则用双料胰酪胨大豆多粘菌素肉汤）。胨大豆多粘菌素肉汤）。于于30 30 1 1 培养培养48 h2 h48 h2 h。7070PPT课件课件10.4 样品接种取三个适宜连续稀释度的样品匀液（液体样品可10.5 培培养养用接种环从各管中分别移取用接种环从各管中分别移取1 1环，划线接种到环，划线接种到MYPMYP琼脂平板上，琼脂平板上，30 30 1 1 培养培养24 h2 h24 h2 h。如果菌落不典型如果菌落不典型,可继续培养可继续培养24 h2 h24 h2 h再观察。再观察。7171PPT课件课件10.5 培养用接种环从各管中分别移取1环，划线接种到MYP10.6确确证实验 从每个平板选取至少从每个平板选取至少5 5个典型或可疑菌落，划个典型或可疑菌落，划线接种于营养琼脂平板做纯培养，线接种于营养琼脂平板做纯培养，30 30 1 1 培养培养24 h2 h24 h2 h，进行确证实验，进行确证实验。7272PPT课件课件10.6确证实验 从每个平板选取至少5个典型或可疑菌落，11结果果报告告 MPNMPN计数结果报告方式：根据证实为蜡样芽计数结果报告方式：根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数，查胞杆菌阳性的试管管数，查MPNMPN检索表，报告检索表，报告每每g g（mLmL）样品中蜡样芽胞杆菌的）样品中蜡样芽胞杆菌的MPNMPN值。值。7373PPT课件课件11结果报告 MPN计数结果报告方式：根据证实为蜡样芽注注意意事事项MPNMPN法法法可以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量法可以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于少于10103 3 cfu/mL cfu/mL时用平板计数法计数不准的问时用平板计数法计数不准的问题，同时该方法操作与现行大肠菌群的操作类题，同时该方法操作与现行大肠菌群的操作类似，容易推广使用。似，容易推广使用。某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也某些不适合用平板计数法的脱水淀粉类食品也可用此法检验。可用此法检验。7474PPT课件课件注意事项MPN法法可以弥补样品中蜡样芽胞杆菌带菌量少于103谢谢！谢谢！谢谢！谢谢！7575PPT课件课件谢谢！75PPT课件谢 谢！放映结束 感谢各位的批评指导！让我们共同进步7676PPT课件课件谢 谢！放映结束 让我们共同进步76PP