艾滋病病毒研究现状课件

艾滋病病毒研究现状2020/11/41艾滋病病毒研究现状2020/11/41前言 在当今社会，严重危害人类健康、令人谈之色变的传染性疾病莫过于艾滋病。艾滋病的全名为“获得性免疫缺陷综合征”(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodefieiency virus，HIV)感染引起的全身性免疫功能丧失综合征。自美国1981年诊断出首例艾滋病病人以来，艾滋病病毒在全球范围内的传播速度惊人，已有200余个国家和地区受到艾滋病的严重威胁。因此，国内外在艾滋病毒的研究上一直投放大量人力财力，非常重视。2020/11/42前言 在当今社会，严重危害人类健康、令人谈之色变HIV结构模式图2020/11/43HIV结构模式图2020/11/43HIVHIV的生命周期的生命周期2020/11/44HIV的生命周期2020/11/44HIVHIV的生命周期和抗的生命周期和抗HIVHIV药物靶向目标药物靶向目标2020/11/45HIV的生命周期和抗HIV药物靶向目标2020/11/45根据根据HIV-1的生命周期，目前已的生命周期，目前已应应用或正在研制的抗艾滋病用或正在研制的抗艾滋病药药物主要物主要针对针对病毒复制病毒复制过过程的程的8个重要个重要环节环节：1）HIV对宿主细胞的依附进入抑制剂；2）辅受体相互作用进入抑制剂；3）HIV与细胞的融合进入抑制剂；4）病毒RNA的逆转录核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)；5）病毒RNA的逆转录非核苷类逆转录酶抑制(NNRTIs)；6）前病毒DNA的整合整合酶抑制剂；7）DNA的转录；8）病毒蛋白质的表达，病毒的组装，以及病毒粒子的发芽和成熟蛋白酶抑制剂(PIs)2020/11/46根据HIV-1的生命周期，目前已应2020/11/46 这这些些环节环节中所涉及到的中所涉及到的酶酶或受体就成或受体就成为为抗艾滋病抗艾滋病药药物物设计设计的靶向目的靶向目标标，例如病毒的逆，例如病毒的逆转录转录酶酶、蛋白、蛋白酶酶、整合、整合酶酶、多聚多聚酶酶、糖蛋白、糖蛋白gp41和和gpl20，以及宿主，以及宿主细细胞的胞的CD4受体受体和和辅辅受体受体CCR5和和CXCR4等。等。2020/11/47 这些环节中所涉及到的酶或受体就成为抗艾滋病药物目前艾滋病的治疗方法、精选出抗病毒中医药队；、抗基因突变药队及控制转录因素解胎毒；、激发血细胞抗原体系；A、提高整体免疫水平。B、多向免疫调节。C、努力增强人体T细胞，消除产生胸腺萎缩因素二者并重。D、增强吞噬细胞祖系和保护吞噬细胞不受破坏。E、诱发和增生人体干扰素。、补髓并解骨髓中毒，促多能干细胞生成，增强解毒功能，使免疫系统功能有总的源泉和效能发挥，加强吞噬特异抗原特异突变细胞能力。2020/11/48目前艾滋病的治疗方法、精选出抗病毒中医药队；2020/11HIV 疫苗实验研究的现状 当前用于治疗HIV 感染的药物只能控制病毒复制，不能彻底清除病毒，而且抗HIV药物价格昂贵，具有较严重的副作用，药物使用不当亦会诱发耐药株的产生。因此，研制安全、有效的疫苗是控制HIV传播的重要手段之一。2020/11/49HIV 疫苗实验研究的现状 当前用于治疗HIV 感染的药物只HIV 疫苗实验研究的现状 疫苗分预防疫苗和治疗疫苗，预防疫苗的作用是防止感染病毒，针对的是未感染人群。而治疗疫苗的作用，则是诱导人体免疫系统发挥抵抗病毒对人体的损伤，或者增强免疫系统对病毒的抵抗能力，针对的是已经感染病毒的人群。2020/11/410HIV 疫苗实验研究的现状 疫苗分预防疫苗和治疗疫苗，预防疫HIV 疫苗实验研究的现状目前HIV疫苗的研究包括采用传统疫苗技术研制的减毒活疫苗和灭活疫苗以及采用现代生物技术研制的重组蛋白疫苗、DNA 疫苗、病毒载体疫苗等，有些疫苗已完成了期临床研究，有些正在进行或期临床研究，但大部分仍处在实验室研究阶段。2020/11/411HIV 疫苗实验研究的现状目前HIV疫苗的研究包括采用传统疫HIV 疫苗实验研究的现状一、一、减毒活疫苗减毒活疫苗 到目前为止，进行过动物实验的免疫缺陷病毒疫苗中，减毒活疫苗的保护效果是最好的。早期对SIV的减毒集中于nef基因的部分或全部删除，使用nef 基因缺失的SIV减毒株免疫恒河猴，随后用野毒株感染恒河猴，较短时期内不能检测到感染。减毒SIV疫苗还具有一定程度的交叉保护能力。2020/11/412HIV 疫苗实验研究的现状一、减毒活疫苗 到目前HIV 疫苗实验研究的现状 但经过长期观察，试验动物全部感染减毒株，并发展为AIDS样症状，分析病毒基因发现nef 基因修复了12个核苷酸的缺失研究者删除vpr 基因经过长期追踪观察,也存在同样的问题。Anita Milicic 等人对nef 的三个保守区进行突变。结果表明，突变后的基因对蛋白酶体的表位加工有很大的影响。因此，HIV-1 减毒活疫苗的安全性问题制约了它的发展。2020/11/413HIV 疫苗实验研究的现状 但经过长期观察，试验动HIV 疫苗实验研究的现状二、灭活疫苗二、灭活疫苗 Murphey-Corb 等使用5%8%甲醛溶液灭活的SIV病毒免疫9只猕猴，在10倍SID50(50%simian infectious dose)剂量灭活病毒原始株攻毒中，全部免于感染。但当使用其他毒株攻击时，几乎没有保护效果，分析表明保护作用与抗体反应有关。2020/11/414HIV 疫苗实验研究的现状二、灭活疫苗 MurpHIV 疫苗实验研究的现状 许多研究人员指出在以上实验中使用的灭活病毒和攻击病毒为在人T细胞中培养的SIV，保护作用可能与人源HLA I 类分子诱发的抗体有关。使用灭活疫苗在HIV-1 感染者中进行的早期人体试验也没有取得预防感染和控制病毒复制的效果，同时由于没有确证病毒灭活完全性的手段，难以保证不会发生由于病毒灭活不完全而导致感染的情况，灭活疫苗的研究受到了很大的限制。2020/11/415HIV 疫苗实验研究的现状 许多研究人员指出在以HIV 疫苗实验研究的现状三、蛋白疫苗三、蛋白疫苗 HIV 疫苗设计的主要困难在于鉴别引起中和抗体的异常表位。目前的研究表明，HIV-1 的糖类是主要的抵抗宿主攻击的物质，那么疫苗的设计就可以针对这些糖类，这个想法通过对HIV-1 糖蛋白gp120 上的寡聚甘露糖簇的研究得到实，gp120是广泛的中和抗体2G12 的表位，这项研究表明HIV疫苗的研究朝着糖蛋白疫苗的方向发展着。2020/11/416HIV 疫苗实验研究的现状三、蛋白疫苗 HIV HIV 疫苗实验研究的现状 HIV膜区蛋白的结构非常复杂，既含有复杂的立体构像，中和性抗体多为构像依赖性抗体，又含有多糖基化位点，过多的糖基化可能会掩盖中和抗体位点的暴露，而且HIV自然感染机体后所诱导的中和抗体普遍较弱。这些现象提示单纯模仿HIV 膜蛋白天然的抗原结构研制的疫苗将不会产生较强的而且广谱的中和抗体。因此，目前国际上研究的重点是根据HIV膜蛋白的基本特点设计新的免疫原，或对天然的膜蛋白进行改造，其目的是诱导机体产生广谱而且较强的中和抗体。2020/11/417HIV 疫苗实验研究的现状 HIV膜区蛋白的结HIV 疫苗实验研究的现状四、四、DNA 疫苗疫苗 HIV 是高度是高度变变异的，异的，对对如此高如此高变变异的病毒异的病毒产产生有效的免生有效的免疫反疫反应应是艾滋病疫苗的一个是艾滋病疫苗的一个发发展方向。另一个展方向。另一个难题难题是是鉴鉴定保定保护护性免疫。近来的疫苗主要性免疫。近来的疫苗主要尝试尝试用重用重组组的核心病毒序列，在的核心病毒序列，在小范小范围围内突内突变变而成。自体病毒来源的而成。自体病毒来源的COT 或或CON 序列序列(HIV-1env 变变异体异体编码编码广泛的多广泛的多样样性性)对评对评价抗病毒反价抗病毒反应应的敏感性的敏感性可能是有用的。近来科学家可能是有用的。近来科学家发现发现HIV制造的蛋白制造的蛋白质质，称，称为为Vif，这这种蛋白种蛋白质质可以防止宿主的攻可以防止宿主的攻击击。2020/11/418HIV 疫苗实验研究的现状四、DNA 疫苗 H Nathaniel Landau 等等发现发现了了Vif 的工作原理。的工作原理。Vif 可以可以制制约约人体内的一种称人体内的一种称为为APOBEC3G 的蛋白的蛋白质质。人体内，。人体内，如果没有如果没有Vif，APOBEC3G蛋白蛋白质质可以侵入病毒，取出病可以侵入病毒，取出病毒中的部分毒中的部分DNA的片段，的片段，这样这样病毒就不能起作用了。但是，病毒就不能起作用了。但是，Vif 可以阻止可以阻止APOBEC3G工作。工作。这对这对于研究抗于研究抗HIV病毒病毒药药品和疫苗有巨大的参考价品和疫苗有巨大的参考价值值。HIV 疫苗实验研究的现状2020/11/419 Nathaniel Landau 等发现了Vi DNA疫苗疫苗进进入入细细胞核内部表达所携胞核内部表达所携带带的外源基因，在的外源基因，在诱诱发细发细胞免疫反胞免疫反应应方面具有方面具有优势优势。HIV DNA疫苗研究中多采用疫苗研究中多采用包括多个病毒基因的方式来增加包括多个病毒基因的方式来增加细细胞免疫反胞免疫反应应的的强强度和广泛度和广泛性。如性。如Fuller 等使用等使用gag-pol-env 的的DNA疫苗黏膜途径免疫疫苗黏膜途径免疫猕猕猴，在异源猴，在异源SHIV-1 黏膜攻黏膜攻击击中，可保中，可保护护4/7只只猕猕猴免于感染。猴免于感染。质质粒粒DNA进进入入细细胞核表达外源蛋白，能胞核表达外源蛋白，能进进行正确的翻行正确的翻译译后加后加工并保持天然构像，在工并保持天然构像，在诱发诱发体液免疫反体液免疫反应应方面具有特殊方面具有特殊优势优势。HIV 疫苗实验研究的现状2020/11/420 DNA疫苗进入细胞核内部表达所携带的外源基因HIV 疫苗实验研究的现状五、病毒载体疫苗五、病毒载体疫苗 为为了增加外源基因了增加外源基因进进入宿主体入宿主体细细胞的能力和表达效率，胞的能力和表达效率，增加疫苗增加疫苗诱发诱发的免疫反的免疫反应应强强度，研究者度，研究者发发展了多种活病毒展了多种活病毒载载体疫苗。其中最具代表性的是痘病毒体疫苗。其中最具代表性的是痘病毒(Vaccinia virus，VAC)载载体。从安全性和免疫效果体。从安全性和免疫效果综综合考合考虑虑，MVA为为其中其中的佼佼者，的佼佼者，MVA为为Ankara株痘病毒在株痘病毒在鸡鸡胚胚细细胞中胞中经过经过570次次传传代，代，获获得得丢丢失六失六处处共共长长达达10 kb基因片断限制了其宿基因片断限制了其宿主主细细胞胞谱谱系的减毒株。不同于一些保留系的减毒株。不同于一些保留较较强强复制能力的痘复制能力的痘病毒减毒株通病毒减毒株通过删过删除病毒的除病毒的细细胞因子胞因子(如如IFN-)受体受体为为减减毒手段，并以宿主能毒手段，并以宿主能产产生足生足够够强强度的特异性免疫反度的特异性免疫反应为应为前前提来确保安全性。提来确保安全性。2020/11/421HIV 疫苗实验研究的现状五、病毒载体疫苗 为 MVA 在人体内复制水平很低，几乎在人体内复制水平很低，几乎检测检测不到。不到。MVA多种途径接种放多种途径接种放射射线线照射和抗照射和抗T细细胞抗体清除胞抗体清除T淋巴淋巴细细胞的胞的猕猕猴，猴，虽虽然在然在动动物全身多个器物全身多个器官官检检出了出了MVA基因，但没有分离到活病毒基因，但没有分离到活病毒颗颗粒。同粒。同时时，MVA可可诱诱生生IFN-、TNF-等等细细胞因子，但它自身不表达胞因子，但它自身不表达IFN和和TNF可溶性受体，从而可可溶性受体，从而可间间接接增增强强细细胞免疫反胞免疫反应应。使用使用rMVA-gag-pol-env 89.6P 免疫恒河猴，免疫恒河猴，SHIV89.6P攻毒后，攻毒后，对对照照组动组动物出物出现现明明显显的的AIDS 样样症状，攻毒后症状，攻毒后168 d半数死亡，免疫半数死亡，免疫组组动动物表物表现现出出强强的的Gag-特异性特异性细细胞免疫反胞免疫反应应和高滴度的中和抗体，到和高滴度的中和抗体，到168 d观观察察终终点，点，CD4+T淋巴淋巴细细胞保持正常水平，病毒胞保持正常水平，病毒载载量控制在量控制在检检出范出范围围(500-1000 拷拷贝贝/mL)以下，无以下，无1 例出例出现现AIDS 样样症状。症状。现现代探代探针针技技术带术带着潜在的可着潜在的可产产生保生保护护性性细细胞免疫反胞免疫反应应的的优势优势，已，已经经在在临临床床试验试验上得到了上得到了证实证实。腺病毒探。腺病毒探针针的出的出现现肯定了肯定了这这种种说说法，而法，而泡沫病毒在人体内引起有效的泡沫病毒在人体内引起有效的细细胞免疫反胞免疫反应应没有得到没有得到证实证实。2020/11/422 MVA 在人体内复制水平很低，几乎检测不到。MHIV 疫苗实验研究的现状六、六、DNA-病毒载体疫苗联合免疫病毒载体疫苗联合免疫 动物实验表明，已经存在的针对载体病毒的免疫反应能够严重影响免疫效果。以Prime-Boost 方式,使用携带gag-pol-env的DNA/rMVA 和rMVA/rMVA 同时免疫猕猴，rMVA/rMVA方式免疫的猕猴其CTL反应强度比DNA/rMVA方式低10倍。以腺病毒作为载体的疫苗中，这种现象比MVA还要明显。使用DNA-活病毒载体疫苗,以Prime-Boost方式免疫，可以避免这种现象。2020/11/423HIV 疫苗实验研究的现状六、DNA-病毒载体疫苗联合免疫 HIV 疫苗实验研究的现状七、治疗性疫苗七、治疗性疫苗 艾滋病被称为“世纪瘟疫”，人类至今尚未找到医治这一顽症的理想方法。现在普遍采用的“鸡尾酒”疗法，就是让患者服用抗逆转录酶等抗病毒药物，以控制病情的进一步发展，但它无法完全杀灭病毒，而且还会产生毒副作用。用“治疗疫苗”抑制艾滋病毒的新思路的原理是：既然艾滋病患者最主要的问题是免疫功能的丧失，那么只要找到一种能够有效触发并恢复其自身免疫能力的方法，病情应该可以得到控制。2020/11/424HIV 疫苗实验研究的现状七、治疗性疫苗 艾滋艾滋病研究新消息2020/11/425艾滋病研究新消息2020/11/425感染感染HIVHIV的的T T细胞（红色为细胞（红色为HIVHIV病毒，绿色为宿主细胞）病毒，绿色为宿主细胞）加拿大和美国研究人加拿大和美国研究人员员21日日在英国自然在英国自然医学医学发发表表论论文称，文称，他他们发现们发现了可能会了可能会彻彻底治愈艾滋病底治愈艾滋病的新方法，艾滋病将有可能不再是的新方法，艾滋病将有可能不再是不治之症。不治之症。治愈艾滋病的关治愈艾滋病的关键键在于找到艾滋病在于找到艾滋病病毒潜伏池。研究人病毒潜伏池。研究人员说员说，他，他们们找到了找到了这这种潜伏池，即种潜伏池，即记忆记忆T细细胞。胞。他们他们提出提出了了结结合化学合化学疗疗法和抗逆法和抗逆转录转录病毒病毒疗疗法来治法来治疗疗艾滋病的新方法，其中，艾滋病的新方法，其中，抗逆抗逆转录转录病毒病毒疗疗法杀死法杀死人体内大部人体内大部分艾滋病病毒，而化学分艾滋病病毒，而化学疗疗法法则专门针对则专门针对“躲躲藏藏”在在记忆记忆T细细胞中的艾滋病病毒，胞中的艾滋病病毒，这这使得艾滋病病毒在人体中再无藏身之使得艾滋病病毒在人体中再无藏身之地。地。HIV HIV 的新藏身之处的新藏身之处2020/11/426感染HIV的T细胞（红色为 加拿大和美国研究人员 美国科学美国科学杂杂志志发发表了由浙江大学教授于表了由浙江大学教授于晓晓方方领导领导的科研小的科研小组组的研究的研究成果，揭示了艾滋病成果，揭示了艾滋病发发病的新机理。病的新机理。该该研究在国研究在国际际上首先上首先发现发现一一组组使使HIV避避过过人体人体细细胞天然防御系胞天然防御系统统而在人体而在人体细细胞内大量复制的蛋白，胞内大量复制的蛋白，阐阐明了明了HIV突破宿主突破宿主细细胞防御系胞防御系统统分子机制，并提出了新的分子机制，并提出了新的HIV防治策略。防治策略。这组这组蛋白的蛋白的发现对发现对于了解于了解HIV如何如何战胜战胜宿主防御系宿主防御系统统至至为为关关键键，有望成有望成为为HIV治治疗疗的新靶点，从而的新靶点，从而为预为预防和治防和治疗疗艾滋病提供了一种艾滋病提供了一种全新的理念和途径，具有十分重大的理全新的理念和途径，具有十分重大的理论论意意义义和和实际应实际应用价用价值值。艾滋病病毒含有一种病毒感染因子，艾滋病病毒含有一种病毒感染因子，该该因子通因子通过过一一组组蛋白复合体，增加了蛋白复合体，增加了艾滋病的感染机会。一系列艾滋病的感染机会。一系列实验发现实验发现，只要阻断病毒感染因子和泛素，只要阻断病毒感染因子和泛素连连接接酶酶的的共同作用，艾滋病的感染率就降低了共同作用，艾滋病的感染率就降低了90。这这个新个新发现发现有可能开有可能开发发出防治出防治HIV感染的新感染的新药药和新和新疗疗法。法。HIV HIV 突破宿主细胞防御系统分子机制突破宿主细胞防御系统分子机制2020/11/427 美国科学杂志发表了由浙江大学教授于晓方领 美国科研人美国科研人员员最近利用基因技最近利用基因技术术成功遏制老鼠体内的艾滋病病毒，成功遏制老鼠体内的艾滋病病毒，这这一方法一方法为为控制艾滋病病毒增殖提供了新思路。控制艾滋病病毒增殖提供了新思路。这这一技一技术术的关的关键键在于在于负责负责指指导导合成合成CCR5蛋白的一种基因。蛋白的一种基因。CCR5蛋白是蛋白是艾滋病病毒入侵机体艾滋病病毒入侵机体细细胞的胞的“帮凶帮凶”。科研人。科研人员员很早就很早就发现发现，如果，如果CCR5蛋白基蛋白基因因发发生有利的生有利的变变异，那么人体就可能出异，那么人体就可能出现针对现针对艾滋病病毒的免疫抵抗力。艾滋病病毒的免疫抵抗力。美国南加州大学的葆拉美国南加州大学的葆拉坎坎农农等人在新一期英国自然等人在新一期英国自然-生物工生物工艺艺学学杂杂志上志上报报告告说说，他，他们们用老鼠做用老鼠做实验时实验时，借助一种名，借助一种名为为cutter的的酶酶，删删除了未成熟造血除了未成熟造血细细胞中的胞中的CCR5蛋白基因，因此蛋白基因，因此这这些些细细胞成熟分化胞成熟分化时时不会不会产产生生CCR5蛋白。蛋白。研究人研究人员员把把这这些些细细胞注入感染了艾滋病病毒的老鼠体内，并把它胞注入感染了艾滋病病毒的老鼠体内，并把它们们与感染与感染艾滋病病毒的普通老鼠艾滋病病毒的普通老鼠进进行比行比较较，结结果果发现发现12周后在接受注射的老鼠体内，免周后在接受注射的老鼠体内，免疫疫T细细胞水平有所恢复，艾滋病病毒含量保持在胞水平有所恢复，艾滋病病毒含量保持在较较低水平。而低水平。而对对照照组组老鼠的免老鼠的免疫系疫系统统能力减弱，艾滋病病毒大量分裂增殖。能力减弱，艾滋病病毒大量分裂增殖。基因技术遏制艾滋病毒基因技术遏制艾滋病毒2020/11/428 美国科研人员最近利用基因技术成功遏制老鼠体内的“阴性艾滋病”的恐慌 日前传言内地多个省市发现一种“阴性艾滋病”的神秘病毒，据说这些患者出现类似艾滋病的症状，但是检验结果却呈阴性，而这个人群大多有过高危性行为。“阴性艾滋病”患者出现了淋巴肿胀、皮下出血、舌苔生绒毛等和艾滋病患者极为相像的症状，还有免疫力下降、头疼等其他表现。但是，经过多次HIV检查却仍然显示阴性，临床报告显示他们是“无明显的器质性病变”，因此他们自称是“艾滋病阴性感染者”。2020/11/429“阴性艾滋病”的恐慌 日前传言内地多个省市发现一传言一：“阴性艾滋病”是艾滋病的变异传言二：“阴性艾滋病”是一种新病毒传言三：“阴性艾滋病”是传染病传言四：“阴性艾滋病”无法根治，可致死关于“阴性艾滋病”的四大传言2020/11/430传言一：“阴性艾滋病”是艾滋病的变异关于“阴性艾滋病”的四大传言一：“阴性艾滋病”是艾滋病的变异【检测结果可排除该人群感染艾滋病病毒或变种】2009年7月，中国疾控中心开始启动相关调查工作，至2010年1月，招募了59名自愿接受调查的“自述疑似艾滋病感染者”进行了第一次调查。调查结果表明，该人群艾滋病抗体检测均为阴性，未检测到相关致病病原体，缺乏新病毒或未知病原体感染的证据。考虑到调查对象自述症状与XMRV病毒（异嗜性鼠白血病病毒相关病毒）导致的慢性疲劳综合征的临床症状相似，59名调查对象均检测了XMRV病毒，结果均为阴性。后中国疾控中心又将采集的血液标本送美国相关实验室进行病原学检测。目前美方反馈称，已经检测的样本艾滋病抗体均为阴性，未检测到相关致病病原体。2020/11/431传言一：“阴性艾滋病”是艾滋病的变异 2009传言二：“阴性艾滋病”是一种新病毒【根据中国权威机构及美国有关机构的检测，没有发现新的病毒】经过临床检查和实验室检测，临床专家没有发现其中任何人有影响生命的临床疾病。此外，检测结果还表明：所有病友均未罹患梅毒这一常见的性传播疾病；除1例为丙肝抗体阳性外，其他人也均未感染丙肝这一指征性的血液传染病。国内检测判断该人群并非感染新病毒的情况下，将样本寄给了美国的一家病毒检测机构，该机构能对1.5万种病毒和多种未知病毒进行检测。至3月31日，对1/3的样本检测表明，没有发现新的病毒2020/11/432传言二：“阴性艾滋病”是一种新病毒 经过临床检查传言三：“阴性艾滋病”是传染病【没有证据表明其具有传染性和聚集性】调查对象分布于不同的市、县，未呈现聚集性，也未发现调查对象之间存在互相传染的情况；调查对象和密切接触者无共同的特异性感染症状和体征，未发现传染病传播的因果关系。实验室检查结果发现，调查对象血常规结果基本正常，无感染性疾病的特征性变化。2020/11/433传言三：“阴性艾滋病”是传染病 调查对象分布于不传言四：“阴性艾滋病”无法根治，可致死【大部分调查对象均能正常工作学习，未出现死亡情况】2020/11/434传言四：“阴性艾滋病”无法根治，可致死2020/11/434Thanks for attention!THE END2020/11/435Thanks for attention!THE END20