薄层色谱和纸色谱操作方法

第第8章章 经典色谱别离实用技术经典色谱别离实用技术 学习目标学习目标知识目标知识目标 掌握吸附薄层色谱和纸色谱别离原理、常用别离参掌握吸附薄层色谱和纸色谱别离原理、常用别离参数和系统适用性指标；熟悉经典柱色谱、薄层色谱和纸数和系统适用性指标；熟悉经典柱色谱、薄层色谱和纸色谱操作方法；了解色谱的分类和吸附薄层色谱、纸色色谱操作方法；了解色谱的分类和吸附薄层色谱、纸色谱、经典柱色谱的色谱条件选择原那么。谱、经典柱色谱的色谱条件选择原那么。技能目标技能目标 掌握吸附柱色谱制备技术和薄层板制备、点样、展掌握吸附柱色谱制备技术和薄层板制备、点样、展开和显色检视等操作技术；熟悉薄层色谱、纸色谱的仪开和显色检视等操作技术；熟悉薄层色谱、纸色谱的仪器和材料；了解纸色谱和经典柱色谱的操作规程。器和材料；了解纸色谱和经典柱色谱的操作规程。第第1节节 色谱法概述色谱法概述 一、色谱法一、色谱法 Tswett叶绿素别离实验叶绿素别离实验v1 1色色谱：植物色素：植物色素经溶溶剂冲洗冲洗别离后如同白光色散成七离后如同白光色散成七色光色光带的的现象象v2)2)色色谱法：用于法：用于产生色生色谱的的别离方法离方法v3 3色色谱柱柱chromatographiccolumnchromatographiccolumnv装有用于装有用于别离的填充物的离的填充物的细长管如玻璃管、不管如玻璃管、不锈钢管管v v4)4)固定相固定相stationaryphasestationaryphase v5 5流流动相相mobilephasemobilephase 液体流动相液体流动相气体流动相气体流动相超临界流体流动相超临界流体流动相固体固定相固体固定相液体固定相液体固定相v(6 色色谱别谱别离本离本质质:v 利用混合物中各利用混合物中各组组分在流分在流动动相和固定相之相和固定相之间间相互作用力相互作用力 如溶解能力、吸附力、极性、如溶解能力、吸附力、极性、亲亲和力等和力等 的的强强弱不同，而使弱不同，而使各各组组分在色分在色谱谱柱中分柱中分别别以不同的速度移以不同的速度移动动而到达而到达别别离的定离的定性与定量分析的方法。性与定量分析的方法。二、色谱法分类二、色谱法分类1.流动相状态流动相状态液相色谱液相色谱(LC)气相色谱气相色谱(GC)超临界流体色谱超临界流体色谱(SFC)液液-固色谱固色谱(LSC)液液-液色谱液色谱(LLC)气气-固色谱固色谱(GSC)气气-液色谱液色谱(GLC)2.按别离原理分类按别离原理分类 吸附色谱吸附色谱分配色谱分配色谱DC离子交换色谱离子交换色谱IEC)分子排阻色谱分子排阻色谱(MEC亲和色谱亲和色谱3.根据实验操根据实验操作形式作形式柱色谱柱色谱(CC平面色谱平面色谱(PC薄层色谱薄层色谱TLC纸色谱纸色谱PC)薄膜色谱薄膜色谱TFC三、色谱法的特点三、色谱法的特点别离效能高别离效能高 别离与分析功能兼备别离与分析功能兼备 自动化程度高自动化程度高应用范围广应用范围广第第2节节 经典柱色谱技术经典柱色谱技术 一、液一、液-固吸附柱色谱技术固吸附柱色谱技术1别离原理别离原理1 1液液-固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液固吸附柱：色谱法固定相是固体吸附剂，流动相为液体的柱色谱法体的柱色谱法2 2别离机制别离机制:吸附剂外表对不同组分吸附力的不同和流动相吸附剂外表对不同组分吸附力的不同和流动相对各组分的溶解能力或称解吸能力、洗脱能力的差异，最对各组分的溶解能力或称解吸能力、洗脱能力的差异，最终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序或在色谱柱中终导致混合物中各组分流出色谱柱的先后顺序或在色谱柱中停留的时间即保存时间不同而到达别离。停留的时间即保存时间不同而到达别离。3 3应用应用:别离酸性及中性化合物别离酸性及中性化合物 (如醇类和芳香烃等如醇类和芳香烃等)2吸附剂吸附剂1 1硅胶硅胶(SiO2XH2O)(SiO2XH2O)A.A.吸附机制：外表有吸附机制：外表有许多硅多硅羟基基-Si-OH-Si-OH的的氢键作用作用 B.B.吸附活性吸附活性 C.C.失活或脱活失活或脱活 D.D.活化活化 硅胶活性与含水量的关系硅胶活性与含水量的关系 硅胶含水量硅胶含水量%活度级活度级活性活性0I大大小小5II15III25IV38V2氧化铝氧化铝 A.吸附机制吸附机制:其外表其外表铝羟铝羟基基 Al-OH 的的氢键氢键作用作用B.活性活性 氧化铝含水量氧化铝含水量%活度级活度级活性活性0I大大小小5II15III25IV38VC.氧化氧化铝分分类及及应用范用范围 氧化氧化铝种种类pH应用范用范围碱性氧化碱性氧化铝910分离碱性和中性化合物，如生物碱。分离碱性和中性化合物，如生物碱。中性氧化中性氧化铝7.5分离酸性、中性和碱性化合物，如生物分离酸性、中性和碱性化合物，如生物碱、碱、挥发油、油、萜类、甾体以及在酸碱、甾体以及在酸碱中不中不稳定的定的酯类、苷、苷类等化合物。等化合物。酸性氧化酸性氧化铝45分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸分离酸性和中性化合物，如氨基酸、酸性色素。性色素。3聚酰胺聚酰胺 A.吸附机制：通吸附机制：通过过分子内的分子内的酰酰胺基与酚、酸、硝基、胺基与酚、酸、硝基、醌类醌类化化合物形成合物形成氢键氢键而而产产生吸附作用生吸附作用 B.应应用范用范围围：适合于含：适合于含-OH 的天然的天然产产物的有效成分物的有效成分别别离离 4大孔吸附树脂大孔吸附树脂 A.吸附机制：大孔网状吸附机制：大孔网状结结构的高分子化合物，不溶于酸、构的高分子化合物，不溶于酸、碱及有机溶碱及有机溶剂剂，吸附性与，吸附性与筛筛分性原理相分性原理相结结合合 B.应应用范用范围围：主要用于水溶性化合物：主要用于水溶性化合物(如皂苷如皂苷 的的别别离离纯纯化化3流动相流动相(又称为洗脱剂又称为洗脱剂)v1 1流流动相影响因素相影响因素vA.A.被被测物物质的的结构、性构、性质物物质的的结构构 v v常常见官能官能团的极性由小到大的的极性由小到大的顺序是：序是：烷烃烯烃醚类硝基化合物硝基化合物酯类酮类醛类硫醇胺硫醇胺类酰胺胺醇醇类酚酚类羧酸酸类。vB.B.流流动相极性相极性:相似相溶相似相溶 vC.C.吸附吸附剂活性活性官能团极性与数目官能团极性与数目结构空间排列结构空间排列v2 2如何如何选择流流动相？相？最正确方案总是实验确定最正确方案总是实验确定 v想一想想一想 在吸附色谱在吸附色谱中，以硅胶为固定相，中，以硅胶为固定相，当用三氯甲烷为流动相当用三氯甲烷为流动相时，样品中某些组分保时，样品中某些组分保存时间太短，假设改用存时间太短，假设改用三氯甲烷三氯甲烷甲醇甲醇1:1时，那么样品中各组时，那么样品中各组分的保存时间是变长，分的保存时间是变长，还是变得更短？为什么还是变得更短？为什么？4吸附柱色谱操作技术吸附柱色谱操作技术v1 1装柱装柱 vA.A.质量要求量要求v装柱之前，先将空柱洗装柱之前，先将空柱洗净枯燥，再将空柱枯燥，再将空柱垂直固定在垂直固定在铁架台上。如果色架台上。如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就柱下端没有砂芯横隔，就取一小取一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面平铺上一上一层厚厚0.51cm0.51cm的洗的洗过、枯燥石英砂，有助于、枯燥石英砂，有助于别离离时色色层边缘整整齐，加，加强别离效果。柱的离效果。柱的长度与直径比一般度与直径比一般为101020:120:1。色。色谱柱的填装要均匀，不能有气泡。柱的填装要均匀，不能有气泡。vB.B.装法装法v湿法装柱湿法装柱干法装柱干法装柱 2加样加样 v干法加干法加样v湿法加湿法加样3洗脱洗脱 v洗脱洗脱剂v一种溶一种溶剂或几种溶或几种溶剂按一定比例按一定比例组成混合溶成混合溶剂 v操作要求操作要求 vA.A.保持吸附保持吸附层上方有一定量的洗脱上方有一定量的洗脱剂，防止断，防止断层和旁流和旁流 vB.B.控制洗脱控制洗脱剂的流速的流速5 51010滴滴/min)/min)4收集收集 v等份收集等份收集 (亦可用自亦可用自动收集器收集器)v按按变换洗脱洗脱剂收集收集 5检验检验可以为后续操作可以为后续操作二、凝胶柱色谱技术二、凝胶柱色谱技术1别离原理别离原理1凝胶凝胶(2)别离原理别离原理 凝胶的孔穴大小凝胶的孔穴大小与被别离组分大小相与被别离组分大小相当，尺寸大的组分分当，尺寸大的组分分子可以渗入到凝胶的子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排孔，甚至于完全被排斥先流出色谱柱。尺斥先流出色谱柱。尺寸小的组分分子，大寸小的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，孔小孔都可以渗进去，最后流出。最后流出。2固定相固定相v(1)(1)无机凝胶又称硬质凝胶无机凝胶又称硬质凝胶-多孔硅胶、多孔玻璃珠多孔硅胶、多孔玻璃珠 v 性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，性能：化学惰性、稳定性及机械强度均好，耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱别离耐高温，使用寿命长，但装柱时易碎，不易装紧，柱别离效能较低效能较低 v(2)(2)有机凝胶又称半硬质凝胶有机凝胶又称半硬质凝胶 v 性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流性能：能耐较高压力，适用于有机溶剂作流动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱别离效能较高。动相，有一定可压缩性，可填得紧密，柱别离效能较高。但在有机溶剂中有轻度膨胀。但在有机溶剂中有轻度膨胀。v(3)(3)新型凝胶新型凝胶-葡萄聚糖凝胶葡萄聚糖凝胶 3流动相流动相v1 1要求要求v流流动相必相必须与凝胶本身非常相似，能溶解与凝胶本身非常相似，能溶解样品，浸品，浸润凝胶，且具有凝胶，且具有较低的黏度，有利于大分子的低的黏度，有利于大分子的扩散散 v(2(2选用方法用方法v水溶性水溶性样品品-水溶液水溶液为流流动相相 v非水溶性非水溶性样品品-有机溶有机溶剂为流流动相相v(3(3常用的流常用的流动相相v四四氢呋喃、甲苯、喃、甲苯、N N，N-N-二甲基甲二甲基甲酰胺、三胺、三氯甲甲烷和水等和水等 4凝胶柱色谱操作技术凝胶柱色谱操作技术v1 1溶溶胀 v2 2装柱装柱 v3 3加加样 v4 4洗脱洗脱 v5 5再生再生 v 用恰当的方法除去凝胶中的用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的染物，使其恢复其原来的性性质 v交交联葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶-温温热的的0.5mol/L0.5mol/L氢氧化氧化钠和和0.5mol/L0.5mol/L的的氯化化钠的混合液浸泡，用水冲洗到中性的混合液浸泡，用水冲洗到中性v聚丙聚丙烯酰胺和胺和琼脂糖凝胶脂糖凝胶-盐溶液浸泡，用水冲到中性溶液浸泡，用水冲到中性第第3节节 薄层色谱别离检测技术薄层色谱别离检测技术 一、别离原理一、别离原理 薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄薄层色谱是一种开放性色谱，是将混合组分样品溶液点在薄层板一端的起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜层板一端的起始线上，点样处称为原点，在密闭容器中用适宜的流动相薄层色谱法中又称为展开剂展开。因吸附剂对不的流动相薄层色谱法中又称为展开剂展开。因吸附剂对不同组分的吸附能力不同，展开剂对不同组分的解吸能力也不完同组分的吸附能力不同，展开剂对不同组分的解吸能力也不完全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢，经过一全相同，造成各组分在薄层析上移动的速度有快有慢，经过一段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互别离的斑段时间展开后，不同的组分彼此分开，最终形成相互别离的斑点点 薄层色谱法薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)将固定相均匀平铺在光洁外表的玻璃、塑料或金属板上将固定相均匀平铺在光洁外表的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱别离的方法形成薄层，在此薄层上进行色谱别离的方法 可分为吸附、分配、分子排阻色谱法等可分为吸附、分配、分子排阻色谱法等 二、薄层色谱参数二、薄层色谱参数1比移值比移值(1定义定义 组分迁移的距离与展开组分迁移的距离与展开剂迁移的距离之比剂迁移的距离之比(2)计算方法计算方法2相比照移值相比照移值(1(1定义定义 指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比指被测组分的比移值与参照组分的比移值之比 (2(2计算方法计算方法(3(3）特点）特点消除系统误差，消除系统误差，值的重复性和可靠性都比值的重复性和可靠性都比 好好 3别离度别离度1)1)定义定义衡量薄层色谱别离效果的重要指标，是衡量薄层色谱别离效果的重要指标，是指相邻两斑点中心至原点的距离之差与指相邻两斑点中心至原点的距离之差与两斑点平均径向宽度径向宽度是指斑两斑点平均径向宽度径向宽度是指斑点沿着展开方向的宽度的比值点沿着展开方向的宽度的比值 (2(2计算方法计算方法三、仪器与材料三、仪器与材料1吸附剂吸附剂粒径粒径 540 硅胶硅胶聚酰胺聚酰胺 微晶纤维素微晶纤维素 氧化铝氧化铝硅藻土硅藻土常用常用硅胶硅胶H硅胶硅胶G硅胶硅胶GF254硅胶硅胶HF254 想一想想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶各代表何种意思？试解释硅胶HF365？2载板载板玻璃板玻璃板塑料膜塑料膜金属箔金属箔厚度厚度 2mm 规格规格5cm20cm10cm10cm10cm15cm10cm20cm 种类种类要求要求 外表光滑、平整清洁外表光滑、平整清洁 玻板处理措施玻板处理措施清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用清洁剂或铬酸洗液浸泡洗涤，用清水充分清洗，再用蒸馏水或去离子水冲洗，外表应不附水珠，晾干备用蒸馏水或去离子水冲洗，外表应不附水珠，晾干备用 3点样器点样器 手动手动全自动点样仪全自动点样仪定量毛细管 平口微量注射器平口微量注射器 3展开容器展开容器 平底色谱专用展开缸平底色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸双槽薄层色谱专用展开缸 4显色剂显色剂显色剂适用范围显色方法斑点颜色浓硫酸乙醇溶液多数有机化合物喷雾加热多数加热后呈黑色碘多数有机化合物薰蒸多数显黄棕色磷钼酸乙醇溶液醛等还原性物质喷雾烘干蓝色茚三酮试液氨基酸类喷雾或浸渍紫色或黄色三氯化铁-铁氰化钾试液含酚羟基化合物喷雾或浸渍红褐色或棕红色5显色装置显色装置 喷雾瓶喷雾瓶浸渍槽浸渍槽蒸气熏蒸蒸气熏蒸 -双槽展开缸双槽展开缸 6检视装置检视装置 紫外分析仪紫外分析仪(三用三用)摄像设备摄像设备薄层色谱扫描仪薄层色谱扫描仪(CS9301型型四、操作技术四、操作技术1薄层薄层板制备板制备自制薄自制薄层板层板 市售薄市售薄层板层板 无黏合剂无黏合剂分类分类含黏合剂含黏合剂10%15%煅石膏煅石膏 0.2%0.5%羧甲基纤羧甲基纤维素钠水溶液维素钠水溶液 操作方法操作方法普通薄层板普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基玻璃、聚酰胺薄膜和铝基)高效薄层板（高效薄层板（固定相粒径为固定相粒径为57 ）分类分类操作方法操作方法临用前一般应在临用前一般应在110活化活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁 操作方法操作方法v将将1 1份固定相和份固定相和3 3份水或份水或羧甲基甲基纤维素素钠水溶液在研水溶液在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除外表的气泡后，置玻璃板上中沿同一方向研磨混匀，去除外表的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布器使涂布均匀，或倒入涂布器见图8-148-14中，在玻板上平中，在玻板上平稳地移地移动涂布器涂布器进行涂布行涂布(涂涂层厚度厚度为0.2mm0.2mm0.3mm)0.3mm)，取涂好的薄取涂好的薄层板，置水平台上于室温下晾干后，在板，置水平台上于室温下晾干后，在110110活化活化3030分分钟，立即置于有枯燥，立即置于有枯燥剂的枯燥器中的枯燥器中备用用。手动涂布器手动涂布器 2点样点样 普通板普通板点样基线点样基线-距底边距底边2.0cm 圆点状圆点状-R3mm条带状条带状-宽度宽度510mm 点或条带间距点或条带间距-8mm 点样量点样量-10高效板高效板点样基线点样基线-距底边距底边0.81cm 圆点状圆点状-R2mm条带状条带状-宽度宽度48mm 点或条带间距点或条带间距-5mm 点样量点样量-53.展开展开 1展开要求展开要求 查阅查阅 A.何为边缘效应何为边缘效应?何因何因?如何防止如何防止?B.展开剂参加量展开剂参加量?展开剂展开距离展开剂展开距离?2展开方式展开方式 上行上行近水平近水平双向双向屡次屡次上行展开上行展开近水平展开近水平展开4检视检视有色物质斑点有色物质斑点-目光检视目光检视无色物质斑点无色物质斑点荧光检出法荧光检出法 化学检出法化学检出法 五、检测技术五、检测技术1系统适用性试验系统适用性试验检测灵敏度检测灵敏度 比移值比移值 别离效能别离效能 2鉴别鉴别等浓度对照法等浓度对照法-同板同板-大致同位、同大、同色泽大致同位、同大、同色泽等体积混合法等体积混合法-斑点单一、紧密斑点单一、紧密 结构相似比照法结构相似比照法-Rf不同或两斑不同或两斑点点3杂质检查杂质检查 杂质对照品法杂质对照品法 样品溶液的自身稀释对照法样品溶液的自身稀释对照法 二者合用法二者合用法4定量方法定量方法1目视比色法目视比色法-半定量法精度半定量法精度10%2斑点洗脱法斑点洗脱法 3薄层扫描法薄层扫描法(正在减少使用正在减少使用)第第4节节 纸色谱别离技术纸色谱别离技术 一、别离原理一、别离原理(液液-液萃取液萃取)利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性或分配系数不利用样品中不同组分在两相溶剂中溶解性或分配系数不同，当流动相携带样品流经固定相被吸附或固定在惰性材料同，当流动相携带样品流经固定相被吸附或固定在惰性材料上的液体时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、上的液体时，各组分在两相间不断进行溶解、萃取、再溶解、再萃取，再萃取，样品经过屡次反复分配后，造成分配系数稍有，样品经过屡次反复分配后，造成分配系数稍有差异的组分移行的距离不同面实现别离差异的组分移行的距离不同面实现别离.二、仪器与材料二、仪器与材料 1色谱滤纸色谱滤纸想一想想一想:色谱滤纸如何选择色谱滤纸如何选择?2展开剂展开剂1纸色谱固定相一般是什么纸色谱固定相一般是什么?2纸色谱展开剂如何选择纸色谱展开剂如何选择?3展开容器展开容器 圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖且能密闭 下行纸色谱展开缸下行纸色谱展开缸三、操作技术三、操作技术1色谱滤纸的准备色谱滤纸的准备1用于下行法的色谱滤纸用于下行法的色谱滤纸 2用于上行法的色谱滤纸用于上行法的色谱滤纸 2点样点样 样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量样品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分毛细管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟其自然枯燥、低温烘干或经温热气次点加，每次点加后，俟其自然枯燥、低温烘干或经温热气流吹干，点样直径为流吹干，点样直径为2 mm4mm，点样量取决于色谱滤纸，点样量取决于色谱滤纸的薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。点间距的薄厚程度和显色剂的灵敏度，一般几到几十微克。点间距离约为离约为1.5cm2.0cm，样点通常为圆形，也可点成条形。，样点通常为圆形，也可点成条形。3展开展开纸色谱下行展开纸色谱下行展开纸色谱上行展开纸色谱上行展开4斑点定位斑点定位v纸色色谱法斑点的定位根本和薄法斑点的定位根本和薄层色色谱法相似，但法相似，但纸色色谱法不能使用腐法不能使用腐蚀性性显色色剂，也不能在高温下，也不能在高温下显色。色。v运用运用纸色色谱进行行药物的物的鉴别、检查和含量和含量测定的方法、要求与薄定的方法、要求与薄层色色谱法一致法一致 第第5节节 应用案例应用案例一、柱色谱法的应用案例一、柱色谱法的应用案例 案例案例8-1 黄芪含量测定中样品溶液的制备黄芪含量测定中样品溶液的制备1.黄芪中主要活性成分是什么黄芪中主要活性成分是什么?如何提取和纯化如何提取和纯化?2.提取液用氨试液洗涤的目的是什么提取液用氨试液洗涤的目的是什么?3.D101水洗和水洗和40%乙醇液洗脱液为何弃去乙醇液洗脱液为何弃去?二、薄层色谱法应用案例二、薄层色谱法应用案例案例案例8-2 六味地黄丸中牡丹皮的鉴别六味地黄丸中牡丹皮的鉴别1.牡丹皮牡丹皮 的鉴别指标是什么的鉴别指标是什么?鉴别原理是什么鉴别原理是什么?2.为何选择环己烷为何选择环己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯3:1为展开剂为展开剂?显色方式是什么显色方式是什么?3鉴别结果鉴别结果 六味地黄丸薄层色谱图六味地黄丸薄层色谱图1.丹皮酚；丹皮酚；25.六味地黄丸六味地黄丸 案例案例8-3 甲苯咪唑中有关物质检查甲苯咪唑中有关物质检查 1.TLC法检查杂质常用有哪些方法法检查杂质常用有哪些方法?2.检查中为何采用硅胶检查中为何采用硅胶GF254?3.甲苯咪唑中有关物质的限度是多少？甲苯咪唑中有关物质的限度是多少？