骨质疏松机制和治疗药靶课件

骨质疏松机制和治疗药靶骨质疏松机制和治疗药靶骨质疏松机制和治疗药靶骨质疏松机制和治一、破骨一、破骨细胞及骨胞及骨头吸收吸收破骨细胞来源于造血干细胞造血干细胞，及单核细胞和巨噬细胞相系密切。M-CSF:巨噬细胞集落刺激因子RANKL:破骨细胞分化因子CTR:降钙素(calcitonin)受体TRAP:抗酒石酸酸性磷酸酶RANKL是破骨细胞生成的关键因子2一、破骨细胞及骨头吸收破骨细胞来源于造血干细胞，及单核细胞和破骨细胞的生成从破骨从破骨细胞胞前体分化成前体分化成多核的破骨多核的破骨细胞主要依胞主要依赖于于RANKL结合到破骨合到破骨细胞中的受胞中的受体体RANK上，上，激活破骨激活破骨细胞胞RANKL（receptoractivatorofNF-Bligand）：）：TNF家族成员，起巨噬细胞集落刺激因子作用，RANKL在成骨细胞、骨髓基质细胞，以及T和B淋巴细胞中表达RANK:RANKL受体OPG:RANKL的可溶性受体，起抑制信号作用的可溶性受体，起抑制信号作用3破骨细胞的生成从破骨细胞前体分化成多核的破骨细胞主要依赖于RRANK信号通路RANK有三个TRAF结合基序，可募集6种TRAF蛋白基序1募集TRAF6,激活6条主要的信号通路（Akt,NFATc1,NF-B,JNK,ERKandp38)，涉及涉及破骨破骨细细胞的分化胞的分化、功能和存活，其功能类似于TNF和IL-1，及免疫应答有关基序2和3及那个TRAF结合还不是很清楚，都能激活NF-KB，基序2还激活P38，这两个基序涉及破骨涉及破骨细胞生成胞生成，是治疗骨质疏松的靶点。RANK还含有一个IVVY基序，结合及TRAF无关的信号蛋白（？），介导Rac的激活，涉及涉及破骨破骨细胞骨架构架和破骨胞骨架构架和破骨细胞胞谱系的系的定型，定型，是治疗骨质疏松的靶点。c-Src,TAB2TAK1,TAB1NFATc1,在破骨在破骨细胞前体中表达，是破骨胞前体中表达，是破骨细胞生成的重胞生成的重要要调节者者TRAF:肿瘤坏死困子受体相关因子NFATc1:T 细胞激活核因子c14RANK信号通路RANK有三个TRAF结合基序，可募集6NFATc1破骨细胞分化的主要转录因子成骨细胞分泌的RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，在巨噬细胞前体中，激活Fos的表达，后者又介导破骨细胞分化的主要调节者-T细胞激活核因子C1(NFATc1)的表达，诱导破骨细胞分化。NFATc1可诱导破骨细胞表达的基因有：抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）组织蛋白酶K（cathepsinK）氯离通道7（Clcn7）MMP-9ephrinB25NFATc1破骨细胞分化的主要转录因子成骨细胞分泌的RANKRANKL/RANK/OPG系统6RANKL/RANK/OPG系统6Wnt信号及骨吸收Wnt5aRor2信号是破骨生成的重要信号，Wnt5a从成骨谱系细胞中分泌，结合成破骨细胞前体细胞上的Ror2t和其受体复受体上，激活Jnk，以致cJun募集到RANK启动的SP1上，促进RANK的表达，增强RANK诱导的破骨细胞的生成。而GST-sRor2是抑制骨形成。非非经典的典的Wnt信号能提高信号能提高RANKL的水平，能促的水平，能促进骨吸收骨吸收7Wnt信号及骨吸收Wnt5aRor2信号是破骨生成的重要破骨细胞的激活破骨细胞的激活RANKL结合到RANK后，激活一些关键的转录因子和酶，促进破骨细胞的分化、增值、多核化、激活和存活，深入诱导骨吸收。破骨细胞在激活后，在整合素v3的帮助下，破骨细胞粘附在骨表面，形成一个封闭区，质子泵和氯离子通道打开，产生高酸性的微环境，催化破骨细胞酶cathepsin K的活性，降解胶原，分解骨头。整合素结合到骨表面上，激活整合素依赖性蛋白激酶Src激酶信号。8破骨细胞的激活RANKL结合到RANK后，激活一些关键的转二、成骨二、成骨细胞及骨形成胞及骨形成成骨细胞来源于间间质干细胞质干细胞(MSCs)成骨细胞生成涉及核心转录因子Runx2Osteopontin:骨桥蛋白Osteocalcin:骨钙素Sclerostin:硬骨素DMP-1：牙本质基质蛋白ICOllI:胶原蛋白ITNAP：组织非特异性碱性磷酸酶9二、成骨细胞及骨形成成骨细胞来源于间质干细胞(MSCs)成Runx2是成骨形成必需的转录因子在I型胶原蛋白弱表达的前成骨细胞中，可以检测到Runx2的表达，然而在表达骨钙素(OC)的成熟成骨细胞中，Runx2的表达下降。随着成骨细胞转化成能表达CD44,DMP1和MEPE的骨细胞，硷性磷酸酶降低，而OC升高。Runx2的表达和转录活性受成骨细胞分化过程中的多种蛋白质严格调节。Runx2是骨形成过程中成骨细胞分化、基质产生和矿化必需的转录因子Col1A1:胶原1型蛋白1ALP:碱性磷酸酶OPN:骨桥蛋白BSP:骨唾液酸蛋白OC:骨钙素MEPE:细胞外磷糖蛋白基质DMP1:牙本质基质酸性磷蛋白10Runx2是成骨形成必需的转录因子在I型胶原蛋白弱表达的剌激成骨细胞分化的生长因子两个生长因子家族刺激成骨细胞从MSCs分化，它们都能调节Runx2的表达WntTGF家族11剌激成骨细胞分化的生长因子两个生长因子家族刺激成骨细胞从MSWnt信号通路-catenin依赖性经典通路-catenin非依赖性非经典通路PCP:平面细胞极性12Wnt信号通路-catenin依赖性经典通路-cateDDK1抑制Wnt信号-catenin稳定化后，转移到核，及TCF结合，促进基因表达，这些基因包括：cyclinD1,c-myc,c-jun,VEGF、Runx2、Osx，以及一些及细胞生长相关的生长因子，如：TGF-等DKK1能竞争性结合到LRP5/6，使后者及Kremen结合而失活，导致形成-catenin降解复合物，CKI和GSK3 磷酸化-catenin，使-catenin通过泛素途经被解降。13DDK1抑制Wnt信号-catenin稳定化后，转移到核Wnt3a、5a、7b和10b等Wnt分子及Ihh共同捉进成骨细胞的分化DKK1抑制成骨细胞生成，使发育过程向脂肪生成方向发展。-catenin/TCF1通过诱导骨头主要发育蛋白Runx2表达，承担促进早期成骨细胞谱系的义务，而DKK1通过Wnt信号通路抑制Runx2表达Runx2促进次级骨头发育主要转录因子Osterix(Osx)的转录活性（旁边标注的是普系特异性的表型标记物）激活Wnt信号通路，能上调OPG表达，抑制RANKL表达Wnt信号调节成骨细胞生成14Wnt3a、5a、7b和10b等Wnt分子及Ihh非经典Wnt通路通过Ca2+-CaMkII-TAK1-TAB2-NLK信号抑抑制PPAR-的转录活性，促进成骨细胞生成，Wnt5a激活NLK，生成一个共抑制复合物，使PPAR-失活，非经典Wnt通路及成骨细胞生成15非经典Wnt通路通过Ca2+-CaMkII-TAK1-TGF-家族信号通路经典Smad依赖的TGF-信号，TGF-首先结合到II型受体(R-II)和I型受体(R-I),然后转导到Smads，激活的Smads2/3及Smad4形成复合物，然后转入核，激活转录，启动Runx2基因表。Smad7能破坏激活的Smad2/3及Smad4形成复合物。非Smad依赖性TAK1信号通路也调节骨形成。TGF-能调节Runx2和osterix表达PTH结合激活PTH1R，刺激几个下游效应子，驱动tPTH1R-TGFRII复合物的内化，降低TGF-和PTH信号，CREB介导成骨细胞中的PTH信号。16TGF-家族信号通路经典Smad依赖的TGF-信号，BMPs属于TGF-超级家族Smad依赖的BMP信号，BMP结合到R-II和R-I，然后信号转导至Smads，激活的Smads1/5/8及Smad4形成复合物，转移到核，启动靶基因表达。Neogenin调节BMP受体的联系和Smad1/5/8信号。激活的Smads调节成骨细胞中转录因子和转录共活化因子(Dlx5,Runx2andOsx)的表达。Smad6结合I型BMP受体，抑制Smad1/5/8的激活。非Smad依赖的TAK1信号通路也调节骨形成。BMPs和Wnt信号相互作用影响骨的形成，BMPRIA信号上调Sost表达，主要通过Smad依赖的信号，而它又通过Smad依赖和非Smad依赖的信号上调DKK1，Sost和DKK1都能抑制经典的Wnt信号，导致骨质降低。17BMPs属于TGF-超级家族Smad依赖的BMP信号，三、骨三、骨细胞胞形态类似于神经细胞，有长的树枝状突出的管道，在骨细胞之间连接成网络，形成感应网络骨细胞能表达许多可以调节磷盐的因子，在基质的矿化过程中起着重要的作用骨细胞能分泌硬骨素（sclerostin），是Wnt信号通路的抑制剂，可抑制成骨细胞分化和骨形成骨细胞能通过TGF-B降低RANKL的表达抑制骨吸收骨细胞在所有的骨头细胞中占90%，分散在矿化的基质中。是最终分化的成骨细胞骨细胞能沿着树枝极化到骨表面，并及成骨细胞和骨衬细胞接触，感应微裂缝、裂纹和机械负荷丧失，触发破骨细胞分化。凋亡的骨细胞可能分泌一些因子达到骨表面诱导破骨细胞分化。18三、骨细胞形态类似于神经细胞，有长的树枝状突出的管道，在骨细四、骨四、骨头重构的三个重构的三个阶段段在启始阶段，开始于造血前体细胞的募集，成骨细胞谱系表达RANKL，诱导破骨细胞分化，形成多核破的骨细胞，吸收骨头转换阶段，以骨头吸收到骨头形成为标志，通过偶合因子开启，这些因子可以是可扩散的因子、膜结合分子，或骨基质内含有的因子终止阶段，由于成骨细胞的骨形成活性，确保成骨细胞在吸收陷窝内填充，而且，成骨细胞扁平化形成新骨头表面的骨衬细胞层3周周3月月19四、骨头重构的三个阶段在启始阶段，开始于造血前体细胞的募集启始阶段(a)早期的始发阶段，破骨细胞前体的募集(b)在骨表面上骨衬细胞下，破骨细胞分化转换阶段(c)多核的破骨细胞进行骨吸收，诱导成骨细胞分化。(d)破骨细胞在骨吸收陷窝内凋亡终止阶段(e)成骨细胞生成和骨细胞的产生(f)进入静态20启始阶段20骨重构发生于对不同剌激的响应：骨微裂、失去机械负荷、低血钙、激素和细胞因子变化等骨细胞定位并响应刺激，刺激表面的骨髓基质细胞、骨血管内皮细胞、成骨细胞分泌RANKL和一些趋化因子，募集破骨细胞前体，触发破骨细胞分化。RANKL等介导破骨细胞分化，然后，破骨细胞通过整合素avb3及骨基质上的玻连蛋白、粘连蛋白和骨桥蛋白相互作用。启始阶段21骨重构发生于对不同剌激的响应：骨微裂、失去机械负荷、低血钙、过渡阶段在过渡阶段，骨吸收的破骨细胞刺激成骨细胞前体分化，在骨吸收陷窝处激活骨的形成。随着骨形成的激活，破骨细胞的骨吸收停止，破骨细胞通过Bim/caspase-3依赖途经过雌激素诱导的Fas配体，经受凋亡。在骨吸收过程中，破骨细胞分泌盐酸分解羟基磷灰石，以及组织蛋白酶K分解胶原和其它基质蛋白。破骨细胞的骨吸收会从基质中释放出生长因子如：TGF-b、BMPs和IGF-II等，这些反过来又激活成骨细胞的形成。破骨细胞产生分泌的或膜结合的分子能作用于成骨细胞前体刺激骨的形成。为什么成骨细胞会在骨吸收陷窝处成骨，在没有破骨细胞的骨吸收陷窝内，V型抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和TGF-b受体相互作用蛋白(TRIP-1)可能起了重要作用。骨头吸收会刺激对等的骨形成（偶联），有多少骨吸收就能诱导多少骨形成。22过渡阶段在过渡阶段，骨吸收的破骨细胞刺激成骨细胞前体分化，在红色的是正在临床应用或还在临床研究的，绿色为可能的靶骨重构各阶段及涉及的因子23红色的是正在临床应用或还在临床研究的，绿色为可能的靶骨重构各TRAP(Tartarateresistantacidphosphatase)Trph1(Tryptophanhydroxylase1WIF(Wntinhibitoryfactor)sFRP(Secretedfrizzledrelatedprotein）24TRAP(Tartarateresistantacid骨重构过程中的偶合刺激因子和抑制因子其中ephrins/Ephs非常重要25骨重构过程中的偶合刺激因子和抑制因子其中ephrins/Eephrins/Ephs重要的偶合因子Eph受体及蝶素（ephrin)在细胞表面结合，触化双相信号：向前，通过Eph受体（如：EphB2），激活Eph激酶活性和激酶依赖信号，反向，通过ephrin，激活Src家族激酶和其它效应因子。从而，改变细胞粘附、迁移、分化。ephrinB2在分化中的和成熟的破骨细胞中表达，而ephrinA2在早期的分化中的破骨细胞中表达。反向，ephrinB2通过含PDZ结构域的蛋白质(如Dvl2)介导反向信号，抑制Fos和Nfatc1的转录，抑制破骨细胞的分化。LephrinA2通过激活PC2介导反向信号。向前，dEphB4通过抑制RhoA的活性刺激成骨细胞分化，而通EphA2可能增强RhoA的活性，而抑制成骨细胞的分化。而RhoA是如何受体EphB4和EphA2不同调节还不清楚。26ephrins/Ephs重要的偶合因子Eph受体及蝶素（ep终止阶段骨形成过程缓慢，约三个月，而骨吸收大约3周。骨细胞产生sclerostin，并通过微管分泌。sclerostin抑制成骨细胞的骨形成，使成骨细胞安静下来。在终止阶段，破骨细胞的分化受成骨细胞产生的OPG所抑制。成熟的成骨细胞中Wnt信号通路调节OPG的转录,抑制破骨细胞生成。Notch配体表达于破骨细胞，破骨细胞及成骨细胞相互作用诱导成骨细胞中的Notch信号通路，增加OPG的产生，抑制破骨细胞的形成27终止阶段骨形成过程缓慢，约三个月，而骨吸收大约3周。27骨吸收及骨形成不平衡相关疾病骨吸收和骨形成的任务不平衡，都会造成骨不正常石骨症（osteopetrosis）：破骨形成缺陷，或破骨细胞的骨吸收功能缺陷骨硬化症(osteosclerosis)：骨形成增加骨质疏松（osteoporosis）：骨吸收增加，及骨吸收相比，骨形成相对降低28骨吸收及骨形成不平衡相关疾病骨吸收和骨形成的任务不平衡，都会五、骨质疏松Hipfracturesper1000person-yearsWHOcategoryAge5064Age64OverallNormal5.39.46.6Osteopenia(骨质缺乏)11.419.615.7Osteoporosis22.446.640.6骨质疏松的根本机制是骨吸收和骨形成之间的不平衡。正常情况下，骨基质的重构是恒定的，多达10%的骨质在任何时间都在进行着重构。在重构过程中，过度的骨吸收和不适当的新骨形成是骨质疏松的根本原因。29五、骨质疏松Hipfracturesper1000p骨质疏松的诊断传统的X-射线图像：传统的X-射线图像，或者，及CT或MRI合用，主要特征是骨皮质变薄和射线透射性增加。灵敏度低，30%的骨流失量才能在X-射线图像中出现，常检查脊椎，如：T4-L4，表现为高度和面积减少。Multipleosteoporoticwedgefracturesdemonstratedonalateralthoraco-lumbarspineX-ray30骨质疏松的诊断传统的X-射线图像：Multipleoste双能量X-射线(DXA)是骨质疏松诊断的金标准，用骨矿物质密度指数T-score来表示CategoryT-scorerange%youngwomenNormalT-score1.085%Osteopenia2.5T-score1.014%OsteoporosisT-score2.50.6%SevereosteoporosisT-score2.5withfragilityfracturecathepsinK：也是诊断骨质疏松的一个重要的指标，可以用抗体检验其中的neoepitope片段；尿药排泄的1型胶原蛋白的碎片也成骨质疏松的标志物31双能量X-射线(DXA)CategoryT-scorer六、骨六、骨质疏松治疏松治疗靶点和靶点和药物物骨质疏松的治疗药物分为两类：抗吸收药物，减慢骨吸收骨生成药物，刺激骨形成32六、骨质疏松治疗靶点和药物骨质疏松的治疗药物分为两类：32抗吸收治疗成骨细胞及破骨细胞的功能是双向信息交流偶联的经典的抗吸收作用是降低破骨细胞的活力，结果是破骨细胞的信号和相继的成骨细胞的形成都被抑制解偶联抗吸收只抑制破骨细胞的作用，而不是破骨细胞的活力，让破骨细胞及成骨细胞之间能进行信息交流，维持成骨细胞的形成33抗吸收治疗成骨细胞及破骨细胞的功能是双向信息交流偶联的33治疗的靶点及药物Estrogen受体Estrogen直接降低RANKL表达，增加OPG分泌，抑制破骨细胞。间接抑制炎症因子和增加IGF-1和TGF-1在成骨细胞中的表达。SERMs（选择性雌激素受体调节剂），结合到其受体抑制破骨细胞功能双磷酸盐类药物Bisphosphonates,降低骨折PTH间歇性的PTH钙受体拮抗剂：拮抗CaSR，可唤起PTH分泌的短期脉冲，缺点是治疗指数较窄，如：MK-5442CathepsinsK(CatK)抑制剂，如：odanacatib激动剂：加强受体及特定的共激活剂(CoA)相互作用，细胞的响应决定于不同组织中表达特定的CoA的水平拮抗剂：促进受体及共抑制剂相互作用(CoR)选择性受体调节剂(SERMs)：使受体及不同的共激活剂或共抑制剂的亚型相互作用，使药物在不同的组织发挥不同的作用34治疗的靶点及药物Estrogen受体双磷酸盐类药物激动剂：加Srctyrosinekinase抑制剂，如：Saracatinib，Srckinase的ATP竞争抑制剂Wnt抑制分子：抑制分子：sclerostin和Dkk-1是可能的靶点。抑制它可以促进骨形成。如：Sclerostin antibody（Romosozumab）Dickkopf-1 antibody(BHQ-880)RANKL拮抗剂，如：RANKL的抗体Denosumab3535可能的靶点Nitricoxide(NO)基于骨内NO/cyclicGMP/PKG信号，增强骨细胞的成活和骨形成，活化，如：cinaciguatSirtuin1NAD+依赖的去乙酰化酶，可以使重要的转录因子共因子去乙醯化，如：FoxO家族和-catenin等，激活Wnt信号通路。活化，如：Resveratrol（白黎芦醇）tryptophanhydroxylase1(Tph-1)周边血清素合成的主要酶，血清素能抑制成骨基因的增值。抑制剂，如：LP533401Glucagon-likepeptide1(GLP-1)作用于成骨前体细胞中的GLP-1受体，通过降钙素依赖性通路，PTH-relatedprotein(PTHrP)表达于骨头中，调节骨的形成OPG结合RNAKL36可能的靶点Nitricoxide(NO)36VitaminK调节骨钙素osteocalcin的羧基化，有利于结合到矿物磷灰石上。ActivinA激活素A,通过Smad通路，促进破骨细胞生成，抑制成骨细胞分化。拮抗剂Glycogensynthasekinase-3(GSK-3)抑制Wnt信号通路的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，抑制剂11-Hydroxysteroiddehydrogenasetype1(11-HSD1)能将皮质酮转化成对骨有害的皮质醇，抑制剂PPAR转录因子，将前体细胞分化的脂肪细胞，抑制它可以促进前体细胞分化成成骨细胞还不是脂肪细胞。其抑制剂对糠尿病骨质疏松可能更有吸引力semaphorins(Semas)信号素通过及破骨细胞和间质前体上的神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1）相互作用，Sema3A能抑制破骨细胞的形成和成骨细胞的分化。Bonemorphogeneticproteins(BMPs)Glucagonlikepeptide2(GLP-2)抑制PTH分泌3737七、骨、肾和淫羊藿中医观点：补肾强骨淫羊藿，味辛甘性温，入肝、肾经。具有温补肾阳38七、骨、肾和淫羊藿中医观点：38BMP-7能刺激成骨细胞的增生和分化，影响骨细胞的活性（是否受FGF23调节不明）Calcitriol（生理水平）激活成骨细胞中的VDR受体，通过调节RANKLOPG直接影响骨细胞生成和活性。但是，如高生理水平对骨头是有害的。PTH,能促进破骨细胞形成骨骨-肾-副甲状腺内分泌副甲状腺内分泌轴 受成受成纤维细胞生胞生长因子（因子（FGF23)和和klotho的的调节。有活性形式的有活性形式的维生素生素D（钙三醇）三醇）结合到骨合到骨细胞中的胞中的维生素生素D受体受体（VDR）上，）上，调节FGF23的表达和分的表达和分泌，泌，FGF23结合到在合到在肾和副甲状腺中和副甲状腺中表达的表达的Klotho-(FGFR）复合物上。在）复合物上。在肾中中FGF23可抑制可抑制编码1-羟化化酶的基的基因因Cyp27b1的表达，从而可抑制的表达，从而可抑制25(OH)D3向向钙三醇的三醇的转化；同化；同时FGF23可增加可增加编码24-羟化化酶的基因的基因Cyp24表达，表达，该基因可抑制基因可抑制钙三醇的三醇的活性，降低血清中活性，降低血清中钙三醇的水平。三醇的水平。在副甲状腺中，在副甲状腺中，FGF23抑制抑制PTH的表的表达。由于达。由于PTH是是Cyp27b1基因表达的基因表达的诱导者，通者，通过FGF23抑制抑制PTH，能降，能降低低Cyp27b1基因的表达，同基因的表达，同时降低血降低血清中清中钙三醇的水平。三醇的水平。FGF23/Klotho轴FGF23作用需要klotho的帮助，没有它，将难以发挥作用。BMP-7FGF23能刺激MSC的分化，诱导骨生成，在MSC中表达，决定着MSC细胞的谱系命运39BMP-7能刺激成骨细胞的增生和分化，影响骨细胞的活性（是否调节Klotho表达的表达的药物物筛选淫羊藿提取物做淫羊藿提取物做为筛中物中物，意味着淫羊藿能调节Klotho基因表达可能是补肾强骨的基础。是不是黄酮？不清楚！40调节Klotho表达的药物筛选淫羊藿提取物做为筛中物，意味着如何做中药的抗骨质疏松的研究基于骨质疏松的分子机制，研究中药的机制1）是作用在骨重构的哪个阶段？骨吸收，还是骨形成？破骨细胞，成骨细胞的增值、分化，关键的标志分子等。2）通过什么途经？关键的转录因子，ANKL信号，Wnt，TGF-家庭等 蛋白质水平，磷酸化水平，蛋白质相互作用等3）靶点是什么？（难！）文献分析，预测，顺藤摸瓜，验证，运气！41如何做中药的抗骨质疏松的研究基于骨质疏松的分子机制，研究中药淫羊藿黄酮的抗骨质疏作用从蛋白水平变化分析，能调节两条信号通路相关蛋白水平，最终调节Runx2这个骨生成的关键的转录因子的变化，说明药物能促进骨生成。1）但为什么可以调节这些蛋白质的变化，不清楚，靶点？（性激素受体？）2）在骨吸收方面，是否有功能，未知42淫羊藿黄酮的抗骨质疏作用从蛋白水平变化分析，能调节两条信号通THANKYOU43THANKYOU43谢谢大家！结结 语语谢谢大家！结语