肿瘤的分子生物学检验技术课件

肿瘤的分子生物学检验技术肿瘤的分子生物学检验技术肿瘤的分子生物学检验技术肿瘤的分子生1q“千手观音”21位聋哑演员中 18人有药物史q部分患者使用正常剂量也会致聋q“一针致聋”现象线粒体基因突变（线粒体基因突变（A1555GA1555G）+环境（使用氨基糖苷类）环境（使用氨基糖苷类）“千手观音”线粒体基因突变（A1555G）+环境（使用氨基2线粒体（Mitochondrion）31.1.真核真核细胞中的胞中的细胞器，胞器，二分裂方式二分裂方式进行新行新陈代代谢，平均寿命，平均寿命1010天天2.2.多数多数细胞含几个到几千个胞含几个到几千个线粒体粒体3.3.每个每个线粒体含粒体含2-10 2-10 线粒体粒体DNA（mtDNA）线粒体（Mitochondrion）31.真核细胞中的细胞3线粒体的主要功能 1、参与人体很多重要的生物化学过程生物化学过程（三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸分解代谢、血红素合成和部分尿素合成过程）被称为“细胞的能量工厂”2、线粒体体积大小，数量增减反应器官功器官功能负荷的变化能负荷的变化。线粒体的主要功能1、参与人体很多重要的生物化学过程（三羧4第一节线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组及其表达系统第一节线粒体基因组及其表达系统5第一节线粒体基因组与线粒体病人体细胞中的线粒体DNA具有自主的DNA复制、转录功能，为非孟德尔遗传方式，故称为25号染色体。25号染色体号染色体第一节线粒体基因组与线粒体病人体细胞中的线粒体DNA具有自67（一）人类线粒体基因组1、基因组小,16569 bp2、双链环状DNA外环富含鸟嘌呤称为重链，内环富含胞嘧啶称轻链3、1）编码区 13 结构基因/mRNA22 tRNA 基因2 rRNA 基因2）非编码区D-loop（约1120bp）L链复制起始区（约3050bp，tRNAAsn-tRNACys）一、线粒体基因组及其表达系统7（一）人类线粒体基因组1、基因组小,16569bp一、71、结构基因1、结构基因87 7个个为为NADH-CoQ还原酶复合体（复合体复合体）的亚基（）的亚基（ND1ND1、ND2ND2、ND3ND3、ND4LND4L、ND4ND4、ND5ND5和和ND6ND6）1 1个个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复合体（复合体复合体）中细胞色素）中细胞色素b b的亚基的亚基 3 3个个为为构成细胞色素c氧化酶（COX）复合体（复合体复合体）催化活性中）催化活性中心的亚单位（心的亚单位（COXCOX、COXCOX和和COXCOX）2 2个个为为ATP合酶复合体（复合体复合体）F0F0部分的部分的2 2个亚基（个亚基（A6A6和和A8A8）1、结构基因7个为NADH-CoQ还原酶复合体（复合体）的亚基（ND192、tRNA基因22个tRNA基因可转录20种tRNA满足线粒体内蛋白质翻译的需要。tRNALeutRNASer都有2个基因外，其余18种均只有1个基因。2、tRNA基因22个tRNA基因103、rRNA基因1、mtRNA编码两种rRNA,即12SrRNA16SrRNA2、位于H链tRNAPhetRNALeu之间以tRNAVal相隔3、变异常发生在二级结构茎环上。3、rRNA基因1、mtRNA编码两种rRNA,即12Sr114、非编码区D-loop（约1120bp）位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间，约1120bp,是mtDNA中变异最多的区域，参与并调控mtDNA的复制和转录。L链复制起始区（约3050bp，tRNAAsn-tRNACys可折叠成茎环结构。4、非编码区D-loop（约1120bp）12（二）线粒体基因表达系统及特点l1 1、密码子、密码子1979年，年，Barrell 报道了人线粒体报道了人线粒体DNA所用的遗传密码。所用的遗传密码。通用通用遗传密密码和和线粒体粒体遗传密密码的差异的差异密密码子子线粒体粒体DNADNA编码核核DNADNA编码UGAUGA色氨酸色氨酸终止止AUAAUA起始起始异亮氨酸异亮氨酸AGGAGG终止止精氨酸精氨酸（二）线粒体基因表达系统及特点1、密码子1979年，Barr13（二）线粒体基因表达系统及特点l2 2、mtDNAmtDNA复制特点复制特点lD环复制为主要模式，重链以逆时针方向复制，轻链以顺时针方向复制。lnDNA只在细胞分裂时复制，mtDNA一直处于分裂状态，并由nDNA编码的调控因子控制。（二）线粒体基因表达系统及特点2、mtDNA复制特点14mtDNA复制特点mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（OH）与L链复制起始点（OL）相隔2/3个mtDNA。复制起始于L链的转录启动子，首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，复制一条互补的H链，取代亲代H链与L链互补。被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。mtDNA复制特点mtDNA可进行半保留复制，其H链15（二）线粒体基因表达系统及特点l3 3、mtDNAmtDNA转录的特点转录的特点l对称性转录，重链启动子启动重链顺时针方向转录，轻链启动子启动轻链逆时针方向转录。l成熟的mRNA只在3末端加polyA尾巴，5 末端不修饰帽子结构（二）线粒体基因表达系统及特点3、mtDNA转录的特点16（二）线粒体基因表达系统及特点l4 4、线粒体蛋白质的合成特点、线粒体蛋白质的合成特点自主编码合成13个多肽，其余功能所需蛋白均由核基因组编码，与细菌合成蛋白质体系十分相似。“共生学说”（二）线粒体基因表达系统及特点4、线粒体蛋白质的合成特点1718核基因组编码核基因组编码了了15001500多个线多个线粒体蛋白粒体蛋白线粒体基因组线粒体基因组只编码了只编码了1313条条多肽链多肽链“交叉对话（交叉对话（cross-talkcross-talk）”机制机制（三）mtDNA与nDNA的相互关系1、nDNA的表达状况可直接影响和调控mt DNA的表达和线粒体蛋白质的生物合成。2、mt DNA突变可直接影响mt DNA所编码蛋白多肽的合成，而影响有氧呼吸、物质代谢和能量代谢，并进一步通过线粒体功能变化反馈影响nDNA的复制和表达。18核基因组编码了1500多个线粒体蛋白线粒体基因组只编码了183、各种转录因子是其通讯的基础。“交叉对话（交叉对话（cross-talkcross-talk）”机制机制3、各种转录因子是其通讯的基础。“交叉对话（cross-ta19二、线粒体病的概念l因线粒体功能受损或缺陷而导致的疾病。l主要累及大脑和肌肉组织。l分为线粒体肌病，线粒体脑病、线粒体脑肌病二、线粒体病的概念20线粒体功能涉及众多的组织器官21线粒体功能涉及众多的组织器官2121三、线粒体病的特征（一）母系遗传与遗传早发三、线粒体病的特征（一）母系遗传22线粒体疾病的母系遗传线粒体疾病的母系遗传23(二)同质性突变与异质性突变与发病阈值效应24线粒体基因线粒体基因q同质性（同质性（Homoplasmy）q0 或或 100%q异质性（异质性（Heteroplasmy）q 0-100%核基因核基因q纯合子（纯合子（Homozygous）q0 或或 100%q杂合子（杂合子（Heterozygous）q50%(二)同质性突变与异质性突变与发病阈值效应24线粒体基因核基24mtDNA同质性/异质性突变与阈值25mtDNA同质性/异质性突变与阈值2525u线粒体线粒体DNADNA的突变率极高，约比核的突变率极高，约比核DNADNA高高10-2010-20倍。倍。线粒体DNA排列紧凑，没有内含子，任何mtDNA的突变都可能影响其基因组的重要功能；线粒体DNA缺少组蛋白的保护；线粒体DNA容易被呼吸链生成自由基氧化损伤；线粒体中没有DNA损伤的修复系统；四、线粒体病的分子生物学检验标志线粒体DNA的突变率极高，约比核DNA高10-20倍。线粒26四、线粒体病的分子生物学检验标志l（一）mtDNA碱基位点l1 1、点突变、点突变 1）结构基因点突变包括同义突变和错义突变，错义突变导致氨基酸的替换，由此引起蛋白质结构和功能的改变，导致疾病。lLeberLeber视神经病（视神经病（LHONLHON）：）：lG11778AG11778A（在（在ND4ND4基因），基因），G3460AG3460A（在（在ND1ND1基因）基因）四、线粒体病的分子生物学检验标志（一）mtDNA碱基位点271 1、点突变、点突变 2）tRNA基因的点突变，可以降低线粒体内蛋白质的生物合成的能力，从而影响线粒体氧化磷酸化的功能，导致疾病的发生。lMELASMELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：中样发作）：lA3243G(80%),T3271CA3243G(80%),T3271C（在（在tRNA Leu(UUR)tRNA Leu(UUR)基因）基因）1、点突变2）tRNA基因的点突变，可以降低线粒体内蛋28四、线粒体病的分子生物学检验标志2、单核苷酸多态性位点单个核苷酸变异引起的mtDNA序列的多态性，与不同人群有关。3、线粒体单体群 在进化过程中，母系遗传的mtDNA为适应环境所形成的碱基位点多态性集合。四、线粒体病的分子生物学检验标志2、单核苷酸多态性位点29（二）（二）mtDNA mtDNA缺失或插入片段缺失或插入片段 大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。常见缺失：常见缺失：8483 84831345913459：Kearns-SayreKearns-Sayre综合症（综合症（KSSKSS）、）、缺血性心脏病缺血性心脏病 ；863716073：与衰老有关的退行性疾病；438914812：能量代谢受到严重破坏。（二）mtDNA缺失或插入片段大片段重组包括缺失和重复30（二）（二）mtDNA mtDNA拷贝数的变化拷贝数的变化lmtDNA拷贝数可作为评价线粒体功能的指标，当拷贝数减少时导致细胞能量缺乏，由此引发疾病，在胃癌、食管鳞癌等肿瘤细胞中mtDNA拷贝数下降，有可能成为一种新的肿瘤标志物。（二）mtDNA拷贝数的变化mtDNA拷贝数可作为评价线粒31第二节线粒体病分子生物学检验技术及质量控制线粒体病分子生物学检验技术及质量控制第二节线粒体病分子生物学检验技术及质量控制32一、线粒体病分子生物学检验策略一、线粒体病分子生物学检验策略33二、线粒体病的分子生物学检验技术l（一）PCR-RFLP技术二、线粒体病的分子生物学检验技术（一）PCR-RFLP技术34PCR-RELP的质量控制的质量控制l（1）模板DNAD的制备和引物设计：设计合适的引物扩增目的模板DNAl（2）酶的选择：去除干扰物质，根据酶活性要求选择适宜的缓冲液、活性剂等，酶的用量不超过总体积的10%。l（3）PCR扩增体系和酶切反应条件：优化保证PCR产物的纯度和精度，设计好酶切反应体系，根据内切酶活性，适时终止反应。l（4）结果分析：根据酶解片段选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，染色后观察扩增基因的变异情况。PCR-RELP的质量控制（1）模板DNAD的制备和引物设计35二、线粒体病的分子生物学检验技术l（二）变性高效液相色谱法l在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。二、线粒体病的分子生物学检验技术（二）变性高效液相色谱法36肿瘤的分子生物学检验技术课件37DHPLC检测的质量控制l1、DHPLC检测的样本要求l（1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。l（2）样品质量：检测前不许纯化，核苷酸和引物会很早被洗脱，模板大分子在样品峰后洗脱。引物二聚体和非特异性扩增及碱基数类似的污染物需优化PCR去除。l（3）样品含量：PCR浓度必须足够大，要求2微升产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带，相当于浓度至少20ng/ul.DHPLC检测的质量控制1、DHPLC检测的样本要求38l（1）PCR引物的设计：引物长度200-500bp范围，且只有一个溶解区域，无错配的PCR片段l（2）PCR反应条件的优化，控制好温度和时间达到模板双链完全变性、复性l（3）DHPLC检测上样前要验证PCR产物质量，以保证结果准确性。l（4）结果分析：在部分变性条件下出现异源双链峰，表明异质性突变位点，反之则为同源单峰。建议购买阳性质控品。2、DHPLC检测的条件优化（1）PCR引物的设计：引物长度200-500bp范围，且只39二、线粒体病的分子生物学检验技术l（三）DNA芯片技术略l（四）DNA测序技术略二、线粒体病的分子生物学检验技术（三）DNA芯片技术略40三、线粒体病的分子生物学检验应用l（一）（一）MELASMELAS综合征综合征l11月23日，读初三的晓炎从学校回家后，顾春娜就感觉女儿脸色不好，以为晓炎在学校吃的没有营养，就赶紧给女儿做了顿好饭。可晓炎吃过饭后不久，就开始呕吐。l当晚凌晨2点钟，晓炎出现了全身抽搐的症状，看到女儿四肢颤抖，嘴眼歪斜，顾春娜赶紧拨打120，急救车将女儿送到医院救治。l入院后的晓炎，直接被送进了ICU重症监护室。经过医院的多次检查，也没有最终确诊，院方建议顾春娜带晓炎去北京治疗。到了北京儿童医院，终于确诊晓炎患上的是一种因遗传基因的缺陷而导致的线粒体结构和功能的异常，病症名称为线粒体脑肌病。三、线粒体病的分子生物学检验应用（一）MELAS综合征41MELAS综合征发病特点l母系遗传l1040岁发病，10岁前发育正常。l首发症状为运动不耐受、卒中样发作、偏轻瘫、失语、皮层盲或聋。并有肢体无力、抽搐或阵发性头痛、智能低下痴呆及乳酸血症MELAS综合征发病特点42肿瘤的分子生物学检验技术课件43MELAS基因l已发现4种点突变与大多数MELAS病例有关，其中2种分别在第A3243G、T3271C位核苷酸，最常见其中80%是A3243G的突变MELAS基因4445399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G为异质性突变PCR-RFLP（限制酶（限制酶Apa）PCR-DHPLCWTA3242G45399bp307bp92bpMU45mt3243突变DNA序列测定 3243正常序列突变杂合子mt3243突变DNA序列测定3243正常序列突变杂合子46三、线粒体病的分子生物学检验应用（二）（二）LeberLeber遗传性视神经病变遗传性视神经病变Leber遗传性视神经病是以德国眼科医生Theodor Leber的名字命名的，又称Leber视神经萎缩，为一种急性或亚急性发作的母系遗传病，男女病人比例5:1，至今尚未发现一个男性患者将此病传给后代。三、线粒体病的分子生物学检验应用（二）Leber遗传性视神经47视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表现急性亚急性视力减退，现急性亚急性视力减退，中心视野丧失明显，中心视野丧失明显，导导致失明。致失明。视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表现急性亚急性视力减退，48突变位点突变位点基因基因同质性同质性/异质性异质性首次报道首次报道*G3316AND1同同质性性Saillard et al.(2000)T3394CND1同同质性性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND1同同质性性/异异质性性Huoponen et al.(1991)C3497TND1同同质性性Kong et al.(2003）G3733AND1同同质性性/异异质性性Valentino et al.(2004)C4171AND1同同质性性/异异质性性Kim et al.(2002)T4216CND1同同质性性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同同质性性Herrnstadt et al.（2002）G7444ACO同同质性性Huoponen et al.（1993）T10663CND同同质性性Brown et al.(1995)G11696AND4同同质性性/异异质性性Zhou et al.（2006）G11778A*ND4同同质性性/异异质性性Wallace et al.(1988)T12338CND4同同质性性Wong et al.（2002）G14459AND6同同质性性/异异质性性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同同质性性/异异质性性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同同质性性/异异质性性Johns et al.(1992)A14495GND6异异质性性Chinnery et al.(2001)T14502CND6同同质性性Ozawa et al.（1991）C14568TND6同同质性性Wissinger et al.(1997)A14693GtRNAGlu同同质性性/异异质性性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同同质性性Li et al.（2006）School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College49q原发性突变：原发性突变：G3460A，G11778A，T14484C的突变，占的突变，占全部全部LHON的的 80-90q继发性突变：继发性突变：T3394C，T4216C，C4019T，G5244A，C4777T，G9438A，G13708A，G15257Aq新突变：新突变：A4435G q位于位于tRNAMet 基基因因q可以调节可以调节ND4 G11778A 突变的突变的外显率外显率与与LeberLeber遗传性视神经病变相关的遗传性视神经病变相关的mtDNAmtDNA突变突变突变位点基因同质性/异质性首次报道*G3316AND1同质性49l11778GA 90.9%,3460GA 1.8%,14484TC 7.3%是目前公认的致病性最强的三种原发性突变l11778GA发病时视力多低于0.1，视力预后也最差；14484TC发病时视力及视力恢复情况明显好于11778GA患者 肿瘤的分子生物学检验技术课件5011778GA导 致 编 码NADH脱氢酶亚单位4(ND4)中第340位的Arg精His组，改变ND4空间构型，NADH脱氢酶活性降低，线粒体产能效率下降，视神经细胞提供能量不能长期维持视神经完整结构，导致神经细胞退行性变、死亡。11778 GA3460GA(ND1)3460GA(ND1)3460GA(ND1)3460GA(ND1)14484TC(ND6)14484TC(ND6)14484TC(ND6)14484TC(ND6)11778GA导致编码NADH脱氢酶亚单位4(ND4)中第51lLeberLeber病变相关的病变相关的mtDNAmtDNA突变常用检测技术突变常用检测技术lPCR-RFLPPCR-RFLP技术技术lPCR-SSCPPCR-SSCP技术技术lDHPLCDHPLC技术技术lDNADNA测序技术测序技术School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College52G3460A，G11778A，T11484C原发性突变测序图原发性突变测序图Leber病变相关的mtDNA突变常用检测技术School52三、线粒体病的分子生物学检验应用（三）药物性耳聋三、线粒体病的分子生物学检验应用（三）药物性耳聋53突变位点突变位点基基 因因同质性同质性/异质性异质性疾疾 病病首次报道首次报道aT961delT+C(n)ins961insC12S rRNA同质性同质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同质性同质性/异质性异质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Thyagarajan et al.(2000)C1494T12S rRNA同质性同质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同质性同质性/异质性异质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋van den Ouweland,et al.(1992)G7444ACO1/tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Pandya et al.(1999)A7445GCO1/tRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性非综合征型耳聋非综合征型耳聋Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性非综合征型耳聋非综合征型耳聋Sue et al.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同质性同质性/异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Nakamura et al.(1995)A8344GtRNALys异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Shoffner et al.(1990)G8363AtRNALys异质性异质性综合征型耳聋综合征型耳聋Santorelli et al.(1996)T14709CtRNAGlu同质性同质性综合征型耳聋综合征型耳聋Rigoli et al.(2001)G15927AtRNAThr同质性同质性药物性耳聋药物性耳聋/非综合征型耳聋非综合征型耳聋Wang et al.(2008)突变位点基因同质性/异质性疾病首次报道aT961de54第二节线粒体基因组与耳聋耳聋相关的耳聋相关的mtDNAmtDNA突变的检测突变的检测lPCR-RFLPPCR-RFLP技术技术lDHPLCDHPLC技术技术lDNADNA测序技术测序技术l基因芯片技术基因芯片技术55检测位点位点引物序列引物序列(53)退火温度退火温度()产物物长度度(bp)A1555GC1494TCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT第二节线粒体基因组与耳聋耳聋相关的mtDNA突变的检测555三、线粒体病的分子生物学检验应用（四）线粒体糖尿病l线粒体糖尿病线粒体糖尿病l美国糖尿病协会美国糖尿病协会(1997)/(1997)/世界卫生组织世界卫生组织(1999)(1999)制定了新的糖尿制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于病，属于细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的1 13 3l据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率为为2.96%2.96%三、线粒体病的分子生物学检验应用（四）线粒体糖尿病线粒体糖尿56线粒体线粒体线粒体线粒体DNADNA突变与糖尿病突变与糖尿病突变与糖尿病突变与糖尿病突变位点突变位点累及基因累及基因同质性同质性/异质性异质性疾病疾病首次报道首次报道C1310T12S rRNA同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Guan et al.(2010)A1438G12S rRNA同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Vawter et al.(2009)A3243G*tRNA Leu(UUR)异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Van den et al.(1992)C3254AtRNA Leu(UUR)异质性异质性妊娠糖尿病妊娠糖尿病Ng et al.(2000)T3264CtRNA Leu(UUR)异质性异质性糖尿病糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu(UUR)异质性异质性糖尿病糖尿病Jaksch et al.(1995)G3316AMT-ND1同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Ogihara et al.(1995)T3394CMT-ND1同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Wallace et al.(1995)T3398CMT-ND1同质性同质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Jaksch et al.(1995)A3399TMT-ND1同质性同质性妊娠糖尿病妊娠糖尿病Ng et al.(2000)T4291CtRNA Ile同质性同质性糖尿病临床表型糖尿病临床表型Lifton et al.(2004)A4833GMT-ND2同质性同质性非胰岛素依赖性糖尿病非胰岛素依赖性糖尿病Onaya et al.(2000)A7472CtRNA Ser(UCN)同质性同质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Hanna et al.(2005)A8296GtRNA Lys同质性同质性/异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Ohsawa et al.(1998)A10398GMT-ND3同质性同质性2型糖尿病型糖尿病Kato et al.(2003)A12026GMT-ND4同质性同质性糖尿病糖尿病Onaya et al.(1998)C12258AtRNA Ser(AGY)异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Turnbull et al.(1998)T14709C*tRNA Glu同质性同质性/异质性异质性糖尿病合并耳聋糖尿病合并耳聋Moraes et al.(1995)T16189CMT-DLOOP同质性同质性2型糖尿病型糖尿病Poulton et al.(1998)School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College57线粒体DNA突变与糖尿病突变位点累及基因同质性/异质性疾病首5758携带tRNA Leu(UUR)A3243G突变的糖尿病家系School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College58携带tRNALeu(UUR)A3243G突变的糖尿病5859399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 为异质性突变为异质性突变RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWTSchool of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College59399bp307bp92bpMU5960School of Laboratory Medicine,Wenzhou Medical College60SchoolofLaboratoryMedicin60 第十六章肿瘤的分子生物学检验技术滨医附院检验科滨医附院检验科 袁笑袁笑第十六章滨61常见肿瘤标志物与肿瘤 前列腺癌前列腺癌前列腺癌前列腺癌PSAPSAEAPEAP睾丸癌睾丸癌睾丸癌睾丸癌AFP,AFP,hCGhCG胰腺癌胰腺癌胰腺癌胰腺癌CA 199CA 199乳房癌乳房癌乳房癌乳房癌CA 153CA 153卵巢癌卵巢癌卵巢癌卵巢癌CA 125CA 125肝癌肝癌肝癌肝癌AFPAFP肝癌肝癌肝癌肝癌AFPAFP常见肿瘤标志物与肿瘤前列腺癌睾丸癌胰腺癌乳房癌卵巢癌肝癌肝62 肿瘤 首选标志物 补充标志物 肺癌 CEA、NSE、CYFRA21-1 TPA、SCC、ACTH、降钙素、TSA肝癌 AFP AFU、GT、CEA、ALP乳腺癌 CA15-3、CEA CA549、hCG、降钙素、铁蛋白 胃癌 CA72-4 CEA、CA19-9、CA242前列腺癌 PSA、f-PSA PAP结肠直肠癌 CEA CA19-9、CA50 胰腺癌 CA19-9 CA50、CEA、CA125 卵巢癌 CA125 CEA、hCG、CA19-9 睾丸肿瘤 AFP、hCG宫颈癌 SCC CA125、CEA、TPA 膀胱癌 无 TPA、CEA 骨髓瘤 本-周蛋白、2-M 常用肿瘤标志物联合检测的临床应用常用肿瘤标志物联合检测的临床应用63肿瘤的分子诊断l肿瘤从本质上来讲是基因出现了问题，本质上是一种基因病l同一种肿瘤其驱动基因可能完全不同，对治疗的反应，肿瘤的发展以及预后可能完全不同l不同的肿瘤其驱动基因可能相同，对相同的针对性治疗方案反应相似因此，针对肿瘤的分子诊断愈发重要肿瘤的分子诊断肿瘤从本质上来讲是基因出现了问题，本质上是一种64第一节肿瘤的分子生物学检验策略第一节肿瘤的分子生物学检验策略65一、肿瘤的分子生物学检验策略l1、检测肿瘤相关基因l包括癌基因、抑癌基因、肿瘤转移相关基因等。l2、检测肿瘤相关病毒的基因l致瘤性DNA病毒：HPV,HBV,EBV等l致瘤性RNA病毒：人类T细胞白血病/淋巴瘤病毒1和HCV.l3、检测肿瘤标志物基因或Mrnal在血液中的含量能反应恶性肿瘤的发生发展以及对治疗的反应一、肿瘤的分子生物学检验策略1、检测肿瘤相关基因66二、肿瘤的分子生物学检验技术1、标本的来源：容易获得（无创或微创）2、分析方法的选择：敏感性高、特异性强，适合相应样本的检测方法分析DNA,RNA仍然是分子杂交、PCR、基因测序。3、新技术产生：基因芯片，高通量测序，分子病理学，分子显像技术，高通量质谱技术等。二、肿瘤的分子生物学检验技术1、标本的来源：6768肿瘤分子诊断的常用方法染色体数目异常：荧光原位杂交技术染色体数目异常：荧光原位杂交技术FISH致病基因结构异常检测致病基因结构异常检测（1）斑点杂交（斑点杂交（dot blot hybridization）（2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（ASO）（3）单链构象多态性（）单链构象多态性（SSCP）（4）限制性内切酶图谱（）限制性内切酶图谱（restriction map）分析）分析（5）限制性片段长度多态性（）限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）（6）DNA 分子杂交（分子杂交（Southern blot）致病基因表达异常检测致病基因表达异常检测（1）mRNA检测检测 定量定量PCR（2）蛋白检测免疫组化：定性、半定量、定位）蛋白检测免疫组化：定性、半定量、定位Western blot：定量：定量68肿瘤分子诊断的常用方法染色体数目异常：荧光原位杂交技术F68第二节肿瘤诊断的生物标志物第二节肿瘤诊断的生物标志物6970肿瘤诊断的生物标志物的发展第第1 1阶段阶段（1963-19781963-1978）：癌胚性抗原）：癌胚性抗原l19631963年年 Abelev AFP Abelev AFPl19651965年年 Gold&Freeman CEA Gold&Freeman CEA第第2 2阶段阶段（1979-19891979-1989）：糖链抗原为主）：糖链抗原为主l19801980年年 Koprowski CA19-9 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-91116-NS-19-9）l19811981年年 Bast CA125 Bast CA125（OC125OC125）第第3 3阶段阶段（19901990以后）：基因标志以后）：基因标志l肿瘤基因标志肿瘤基因标志70肿瘤诊断的生物标志物的发展第1阶段（1963-1978）7071一、肿瘤相关的染色体异常1、数目异常：某个癌细胞的染色体共104条，包括许多异常的染色体 71一、肿瘤相关的染色体异常71722.染色体结构异常易位、缺失、重复、环状染色体和双着丝粒染色体 例：Ph染色体（费城1号染色体），慢性粒细胞性白血病（CML），9号和22号染色体长臂易位 9号原癌基因abl和22号bcr基因组合成融合基因增高的酪氨酸激酶活性。Ph临床意义在于：95的CML都是Ph阳性，可以作为诊断的依据。有时Ph先于临床症状出现，故又可用于早期诊断。722.染色体结构异常7273二、肿瘤相关基因表达异常1.原癌基因:sis、VEGF、EGFR、c-myc2.抑癌基因:APC、BRCA、p53、Rb3.细胞周期调节基因:cyclins、CDKs、CKIs4.细胞凋亡相关基因:Bcl-1、p53、bcr-abl5.基因组稳定相关基因(DNA修复基因):APE16.肿瘤转移相关基因:nm23、WDNM、sis、p537.肿瘤血管生成相关基因:VEGF、EGFR、p5373二、肿瘤相关基因表达异常73（一）原癌基因（一）原癌基因l普遍存在于人类或其他动物固有的一类基因，其在生物进化过程中高度稳定，对细胞无害，而且在控制细胞生长和分化中起重要作用。在环境致癌因素作用下，原癌基因发生点突变、易位激活、原癌基因扩增、癌基因甲基化程度降低被激活成活性形式的癌基因才引起细胞癌变。（一）原癌基因普遍存在于人类或其他动物固有的一类基因，其在74(一)原癌基因点突变(point mutation)癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，从而获得了转化细胞的活性 75mutationmutation(一)原癌基因点突变(pointmutation)75 (二)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation）基因重排（rearrangemant）：有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著增加而导致肿瘤的发生 76(二)基因易位或重排使原癌基因激活基因易位（t76(三)原癌基因获得外源启动子而激活 肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的mRNA或翻译产物蛋白质的含量来表示 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激活原癌基因，使其表达产物增多 病毒的增强子常位于5端的长末端重复序列(1ong terminal repeat，LTR)内。如果增强子插入到原癌基因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的表达比正常表达增高几十甚至上百倍 77(三)原癌基因获得外源启动子而激活肿瘤细胞中原癌基77(四)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)对阻抑基因的转录具有重要作用 78(四)原癌基因甲基化程度降低而激活78（二）抑癌基因（二）抑癌基因l又称肿瘤抑制基因，为一类可编码对肿瘤形成起阻抑作用的蛋白质基因，正常情况下抑制细胞增殖、促进细胞分化。抑癌基因失活方式：1）DNA点突变或缺失导致一个等位基因失活。2）DNA甲基化和组蛋白去乙酰化抑制一个等位基因表达。（二）抑癌基因又称肿瘤抑制基因，为一类可编码对肿瘤形成起阻抑79（三）细胞周期调节基因（三）细胞周期调节基因l细胞周期：正常连续分裂的细胞从前一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的连续动态过程，也是多阶段多因子参与的精确而有序的调控过程。特点：1）单向性：G1 S G2 M 2）阶段性：因某种原因停滞下来，条件好转，进入下一时项 3）检查点：细胞各时项交叉处存在检查点，通过检查点才能进入下一个时项。（三）细胞周期调节基因细胞周期：正常连续分裂的细胞从前一次80l细胞周期运行的动力主要来自细胞周期蛋白依赖性激酶，它的活性受细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂调控。这些调控方式相互制约，形成一个复杂的细胞周期分子调控网络。1、细胞周期依赖性蛋白激酶CDK1-132、细胞周期蛋白CCND13、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDK4、细胞周期检查点Chk1(三三)细胞周期调节基因细胞周期调节基因细胞周期运行的动力主要来自细胞周期蛋白依赖性激酶，它的活性受81（四）细胞凋亡相关基因（四）细胞凋亡相关基因l大致分为三组l1、促进细胞凋亡基因l2、抑制细胞凋亡基因l3、细胞凋亡过程中表达的基因（四）细胞凋亡相关基因大致分为三组82（五）维持细胞基因组稳定相关基因lDNA修复基因及基因组不稳定性基因（六）促进和抑制肿瘤转移的相关基因（七）肿瘤血管生成相关基因VEGF(血管内皮生长因子)（五）维持细胞基因组稳定相关基因DNA修复基因及基因组不稳定8384三、肿瘤相关单核苷酸多态性1.SNP与肿瘤肿瘤易感基因、肿瘤药物治疗相关基因肿瘤个体化诊疗2.SNP的研究思路研究对象差异性研究技术：PCR、芯片研究难点：样本采集84三、肿瘤相关单核苷酸多态性8485四、肿瘤相关表观遗传异常 （一）表观遗传（一）表观遗传（epigenetics）是指）是指DNA序列不发生变化序列不发生变化，但但基因表达却发生了可遗传的改变基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。（二）分子机制：（二）分子机制：1、基因印记丢失，一对等位基因只表达来、基因印记丢失，一对等位基因只表达来自亲本一方的等位基因，而与性别无关。自亲本一方的等位基因，而与性别无关。2、DNA甲基化：例如启动子区域的甲基化：例如启动子区域的CpG岛高甲基化岛高甲基化所致抑癌基因转录沉默所致抑癌基因转录沉默 3、组蛋白修饰与染色体重塑、组蛋白修饰与染色体重塑85四、肿瘤相关表观遗传异常8586五、肿瘤相关miRNA1、miRNA与肿瘤miRNA与肿瘤发生、发展、诊断、治疗、预后2、miRNA类肿瘤标志物的研究思路研究对象：实体瘤、细胞、循环血、其他研究技术：定量PCR、western blot、芯片、免疫组化、细胞培养（增殖、迁移、浸润）等等86五、肿瘤相关miRNA86第三节肿瘤分子生物学检验的临床应用肿瘤分子生物学检验的临床应用第三节肿瘤分子生物学检验的临床应用87 肺癌肺癌88肺癌的分子遗传特征1、细胞色素P450家族，绝大多数的致癌物包括内源性和外源性都需经过P450转化，研究最多的CYP1A12、谷胱甘肽转移酶（GST）家族,使致癌物失活3、NAT2家族，解毒作用肺癌的分子遗传特征1、细胞色素P450家族，绝大多数的致癌物8990肺癌的分子生物学检验1、EGFR（原癌基因表皮生长因子受体）基因检测 大多数在NSCLC中过表达且是重表皮生长要是治疗靶标，EGFR是表皮生长因子相关酪氨酸受体家族的成员，通过与配体的结合，受体同源和异源二聚体化，从而激活受体内源性的酪氨酸激酶，并引发下游信号级联反应，主要包括Ras-Raf-MAP激酶信号通路、P3K-Akt信号通路和STAT通路。这些信号通路对细胞的增值、分化、迁移和血管生成有很强的刺激效应。90肺癌的分子生物学检验9091肺癌的分子生物学检验2、K-ras检测 ras基因，特别是K-ras基因，与肺癌的发生及预后有 关。有20%-30%的NSCLC患者存在K-ras基因突变。80%-90%的突变是12密码子G-T引起的，导致K-ras蛋白组成性活化，NSCLC患者伴随K-ras突变与预后不良有关，K-ras突变与EGFR突变是相互排斥的。伴随K-ras突变的NSCLC患者EGFR-TK3药物敏感性较差91肺癌的分子生物学检验9192肺癌的分子生物学检验3、甲状腺转录因子1（TTF-1）是一种分子量为38-40的核蛋白，在胎儿肺组织及成人型肺泡上皮中存在，而在型肺泡上皮中不表达，TTF-1高表达则EGFR突变率高，是服用EGFR-TK3药物的优势人群。92肺癌的分子生物学检验9293肺癌的分子生物学检验4、癌胚抗原（CEA）表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，用于检测上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。93肺癌的分子生物学检验93靶向EGFR的抗肿瘤药物类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR TKI)作用机制：抑制作用机制：抑制EGFR胞内区胞内区酪氨酸激酶活性，酪氨酸激酶活性，阻断阻断EGFR信号通路；信号通路；药物代表：药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替尼尼（罗氏）。（罗氏）。类别二：单克隆抗体类别二：单克隆抗体(mAb)作用机制：与作用机制：与EGFR胞外区胞外区结合，阻断配体与结合，阻断配体与EGFR的结合；的结合；药物代表：药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗氏）氏）。靶向EGFR的抗肿瘤药物类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（E94乳腺癌乳腺癌95乳腺癌基因检测的意义BRCA1:1990年研究者发现一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因，命名为BRCA1，1994年又发现另外一种与乳腺癌有关的基因，称为BRCA2。乳腺癌基因检测的意义BRCA1:1990年研究者发现一种直接96乳腺癌遗传检测适宜人群(如果有以下因素，强烈建议接受乳腺癌BRCA检查)1、一个或多个直系亲属有乳腺癌史，如母亲或姐妹 2、家族成员里有早发乳腺癌患者，发病年龄早于40 3、家族成员里两代以上出现乳腺癌患者 4、家族成员有双侧乳腺癌患者 5、家族成员里有卵巢癌患者 6、家族成员有男性成员乳腺癌患者 7、一个或多个家族成员携带BRCA基因突变，即遗传检测阳性 乳腺癌遗传检测适宜人群(如果有以下因素，强烈建议接受乳腺癌97乳腺癌的分子生物学检测乳腺癌的分子生物学检测l1、c-erbB-2/HER2基因的检测l是乳腺癌中较常见，易激活的原癌基因c-erbB-2/HER2基因高表达往往生存率低，恶性程度高l2、雌激素受体和孕激素受体的检测lER和PR阳性的乳腺癌可以进行内分泌治疗乳腺癌的分子生物学检测1、c-erbB-2/HER2基因的98肿瘤生物学行为决定乳癌治疗选择NegativePositiveER /PgRHER-2NegativePositive 化化疗疗 Avastin内分泌治内分泌治疗疗抗抗Her-2治治疗疗肿瘤生物学行为决定乳癌治疗选择NegativePosi99 白血病白血病1001、白血病相关基因突变、白血病相关基因突变l（1）C-KIT基因突变l（2）FLT3基因突变l(3)NPM基因突变l（4）N-ras基因突变l（5）NOTCH1基因突变1、白血病相关基因突变（1）C-KIT基因突变1012、白血病相关基因异常表达、白血病相关基因异常表达l（1）WT1基因异常表达，为抑癌基因的一种，是急性白血病独立的预后因子l（2）HOX11基因异常表达，此类患者预后较好，化疗效果佳。2、白血病相关基因异常表达（1）WT1基因异常表达，为抑癌基1023、白血病融合基因、白血病融合基因 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生 3、白血病融合基因染色体易位使位于9q34的c-ab103 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生 104 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22104结直肠癌结直肠癌105大肠癌靶向治疗敏感基因EGFR的传导通路大肠癌靶向治疗敏感基因EGFR的传导通路106大肠癌靶向治疗敏感性基因检测K-RASK-RAS基因检测已经成为大肠癌患者治疗前基因检测已经成为大肠癌患者治疗前必做的常规检查，是目前医生了解大肠癌必做的常规检查，是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法患者癌基因状况最直接、最有效的方法K-RASK-RAS基因检测可以筛选出对抗基因检测可以筛选出对抗EGFR(EGFR(表皮表皮生长因子受体生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。达到良好的预后。早期检测早期检测K-RASK-RAS还可以通过该基因的状态了还可以通过该基因的状态了解到病人的复发转移风险，为将来选择最解到病人的复发转移风险，为将来选择最佳治疗做好准备。佳治疗做好准备。大肠癌靶向治疗敏感性基因检测K-RAS基因检测已经成为大肠癌107 第十七章药物代谢与毒副作用相关基因的分子生物学检验技术滨医附院检验科滨医附院检验科 袁笑袁笑第十七章滨108是药三分毒？你你吃错药吃错药啦啦!你你药吃多药吃多啦！啦！是药三分毒？你吃错药啦!你药吃多啦！109不合理用药导致严重不良反应全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用药，而并非死于自然全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用药，而并非死于自然疾病本身。疾病本身。WHO WHO（联合国世界卫生组织）（联合国世界卫生组织）美国每年有美国每年有1010万人死于药物不良反应，直接和间接经济损失达万人死于药物不良反应，直接和间接经济损失达120120亿美元。亿美元。FDA(FDA(美国食品和药物管理局美国食品和药物管理局)根据药监局和食品药品管理局等机构的统计：根据药监局和食品药品管理局等机构的统计：1 1、中国每年有、中国每年有50005000万的住院病人，其中至少万的住院病人，其中至少250250万与药物万与药物不良反应有关，不良反应有关，2020多万人因此而死亡。多万人因此而死亡。2 2、我国住院病人中有、我国住院病人中有2020是由于不合理用药造成二次住是由于不合理用药造成二次住院。院。不合理用药导致严重不良反应全球死亡患者中，三分之一是由于不110传统用药的弊端症状体征及仪器检查症状体征及仪器检查诊断诊断药物治疗药物治疗经验处方经验处方药物治疗药物治疗A药药B药药C药药D药药传统经验性用药代价传统经验性用药代价1 1、耗时多、耗时多2 2、花费大、花费大3 3、疗效差、疗效差4 4、不良反应多、不良反应多5 5、毒副作用几率大、毒副作用几率大传统用药的弊端症状体征及仪器检查诊断药物治疗经验处方药物治111药物代谢因人而异生物转化生物转化肝脏肝脏药物药物药物重吸收药物重吸收代谢产物代谢产物排泄排泄药物重吸收药物重吸收肾脏肾脏 药药物毒性但有效物毒性但有效药药物毒性且无效物毒性且无效药药物无毒性且有效物无毒性且有效药药物无毒性也无效物无毒性也无效 同种同量同种同量药物治疗药物治疗一种类型的药并不适合所有人一种类型的药并不适合所有人药物代谢酶药物代谢酶药物代谢因人而异生物转化肝脏药物药物重吸收代谢产物排泄药物重112决定药物反应的因素 体重体重/身高身高性别性别老人老人/小孩小孩/孕妇孕妇病史病史并发症并发症环境因素环境因素遗传因素（基因）遗传因素（基因）不同人群不同人群决定药物反应的因素体重/身高性113药代动力学药代动力学药效动力学药效动力学药物疗效和毒性的个体差异药物疗效和毒性的个体差异基因组基因组基因变异基因变异(单核苷酸多态性单核苷酸多态性)药物靶点药物靶点药物转运体药物转运体药物代谢酶药物代谢酶约约59%59%的药物不良反应与遗传相关的药物不良反应与遗传相关基因变异决定药物反应个体差异决定性因素决定性因素药代动力