核酸和核苷类药物培训课件

第一节第一节 概述概述一、核酸与核苷类药物一、核酸与核苷类药物核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核核酸与核苷类药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷或者碱基苷酸、核苷或者碱基天然的、类似物、衍生物及其聚合物天然的、类似物、衍生物及其聚合物作用：作用：影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢影响生物的蛋白质合成和脂肪、糖类的代谢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢恢复正常代谢或干扰某些异常代谢用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、用途：放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病急慢性肝炎、心血管疾病和肌肉萎缩、肿瘤、病毒病毒病 7/2/20241核酸和核苷类药物核酸类物质药物一般可分为两大类：核酸类物质药物一般可分为两大类：一类具天然结构的核酸类物质，一类具天然结构的核酸类物质，另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构另一类是自然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物。类似物或聚合物。7/2/20242核酸和核苷类药物 前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成前者是生物体合成原料或蛋白质、脂肪、糖生物合成与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体与降解以及能量代谢的辅酶，这一类药物有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血组织恢复正常生理机能，临床上已广泛使用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、小板减少症、白细胞减少症、急慢性肝炎、心血管疾病、肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶肌肉萎缩等病症的治疗，包括肌苷、辅酶A、GTP、CTP、UTP、ATP、腺苷、辅酶、腺苷、辅酶I、辅酶、辅酶等，多数是生物体自身等，多数是生物体自身能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本能够合成的物质，具有一定临床功能，毒副作用小，基本都可经微生物发酵或从生物资源中提取。都可经微生物发酵或从生物资源中提取。7/2/20243核酸和核苷类药物后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重后一类药物是治疗病毒感染性疾病、肿瘤的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。物。正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核正式用于临床的抗病毒核苷类药物有三氮唑核苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。7/2/20244核酸和核苷类药物珍奥核酸珍奥核酸7/2/20245核酸和核苷类药物DNA药物药物7/2/20246核酸和核苷类药物核苷类药物核苷类药物恩替卡韦 7/2/20247核酸和核苷类药物二、核酸与核苷的一般理化性质二、核酸与核苷的一般理化性质核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核糖（核糖脱氧核糖）核苷核苷核苷核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基碱基碱基碱基核酸核酸核酸核酸核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNADNA、RNARNA）磷酸磷酸磷酸磷酸 DNADNA和和和和RNARNA是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。是存在于细胞中的正常成分。DNADNA主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（主要存在于细胞核中，少量（2%2%）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；）存在于线粒体和叶绿体中；RNARNA主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（主要存在于细胞质中，少量（10%10%）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。）存在于核仁、核浆和染色体中。核核核核酸酸酸酸的的的的含含含含量量量量与与与与细细细细胞胞胞胞大大大大小小小小无无无无关关关关，以以以以生生生生长长长长旺旺旺旺盛盛盛盛的的的的组组组组织织织织细细细细胞胞胞胞中中中中含含含含量量量量较较较较多多多多，如如如如动动动动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。7/2/20248核酸和核苷类药物7/2/20249核酸和核苷类药物第二节第二节 制备的一般过程与原理制备的一般过程与原理一、一、RNARNA的提取与制备的提取与制备 l工业用工业用RNARNA的提取的提取 （1 1）RNARNA及及其其工工业业来来源源：从从微微生生物物中中提提取取RNARNA是是工工业业上上最最实实际际和和有有效效的的方方法法。一一些些最最常常见见的的菌菌体体含含有有丰丰富富的的核核酸酸资资源源，如如酵酵母母、白白地地霉霉、多多种种抗抗菌菌素素的的菌菌丝丝体体青青霉霉素素，制制霉霉菌菌素素等等菌体。菌体。通通常常在在细细菌菌中中RNARNA占占5 52525，在在酵酵母母中中占占2.72.71515，在霉菌中占，在霉菌中占0.7%0.7%2828。7/2/202410核酸和核苷类药物 在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵铵离离子子浓浓度度和和磷磷酸酸盐盐浓浓度度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早早期期细细胞胞中中的的RNARNA含含量量高高，其确切数值取决于碳、氮比例碳、氮比例和培养基组成等。（2 2）高）高RNARNA含量酵母菌株的筛选含量酵母菌株的筛选 可以从自然界筛筛选选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱诱变变育种育种的方法提高酵母菌的RNA含量。7/2/202411核酸和核苷类药物 稀稀碱碱法法：是用氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液（1%1%），使使细细胞胞壁壁变变性性，使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放放出出来来。需用酸中和PH7PH7。然后除除去去菌菌体体，将pH调至RNA的等等电电点点（pH2.5pH2.5），使RNARNA沉沉淀淀出来。上法的缺点是制得的RNA M Mr r较较低低,(磷磷酸酸单单脂脂酶酶、磷磷酸酸二二脂脂酶酶降降解解RNARNA，90 90 保持保持3 34h4h破坏酶破坏酶)。浓浓盐盐法法：是用高高浓浓度度盐盐溶溶液液（6%6%8%8%）处理，同时加加热热，以改变细胞壁的通透性改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。核酸从细胞内释放出来。要避免分分子子降降解解，可采用苯苯酚酚法法制备RNARNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全全部部RNARNA，可用乙乙醇醇沉沉淀淀出来。脱脱氧氧核核糖糖核核蛋蛋白白溶于浓浓盐盐溶溶液液1mol/L1mol/L,不溶于0.14mol/0.14mol/L,而核核糖糖核核蛋蛋白白溶于0.14mol/L0.14mol/L盐溶液。7/2/202412核酸和核苷类药物（3 3）RNARNA的提取实例：的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH NaOH 3g的水，20以下缓慢搅拌30分钟。用6molL HCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至1010以下，6molL HCl调pH2.5pH2.5，置冷过夜，离心得RNA l.8g（纯度80）。7/2/202413核酸和核苷类药物RNARNA提取实例：提取实例：提取提取 中和中和 HCl 酸化、沉淀酸化、沉淀HCl酵母酵母 提取液提取液 上清液上清液 RNA NaOH、水、水 pH 7、离心、离心 pH 2.5、离心、离心 7/2/202414核酸和核苷类药物二、二、DNADNA的提取与制备的提取与制备 l 工业用工业用DNADNA的提取的提取 取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100100，保保温温1515分分钟钟，迅迅速速冷冷却却至至20202525，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L35L含含热热变变性性DNADNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶酶法法降降解解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积9595乙乙醇醇，离心可获得纤维状DNA，沉沉淀淀用用乙乙醇醇、丙丙酮酮洗洗涤涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性含热变性DNA50DNA506060。7/2/202415核酸和核苷类药物工业用工业用DNADNA的提取的提取 提取提取 热变性热变性 沉淀沉淀乙醇乙醇鱼精鱼精 提取液提取液 纤维状纤维状DNA 水、水、100 冷却、离心冷却、离心 70%-80%（无生物活性）（无生物活性）15min 干燥干燥 粗品粗品DNA（热变性后无活性）热变性后无活性）7/2/202416核酸和核苷类药物l 具有生物活性具有生物活性DNADNA的制备的制备 动物内脏（肝、脾、胸腺）加4 4倍倍重重量量生生理理盐盐水水经组组织织捣捣碎碎机机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加加入入2 2倍倍量量5 5的的（用用45%45%乙乙醇醇作作溶溶剂剂）十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠，并搅拌23小时，在02500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷冷9595乙乙醇醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5 5十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠达110体积，搅搅拌拌1 1小小时时，经5000rpm离心1小时，清液中加加入入NaClNaCl达达1mol1molL L，再缓慢加入冷冷95%95%乙乙醇醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活活性性DNADNA制制备备需需在在0 033操作）。操作）。7/2/202417核酸和核苷类药物l生物活性生物活性DNADNA的制备的制备 提取提取 洗涤洗涤3次次 5%SDS 动物内脏动物内脏 沉淀沉淀 沉淀沉淀 上层液上层液（肝、脾）（肝、脾）生理盐水生理盐水 生理盐水生理盐水 再捣碎再捣碎 离心、离心、30min 沉淀沉淀 洗涤、干燥洗涤、干燥 提取提取 纤维状纤维状DNA 粗品粗品DNA 上清液上清液 95%乙醇乙醇 冷乙醇、丙酮冷乙醇、丙酮 水、水、5%SDS 离心离心 沉淀沉淀 洗涤、干燥洗涤、干燥 DNA沉淀沉淀 活性活性DNANaCL、95%乙醇乙醇 乙醇、丙酮乙醇、丙酮7/2/202418核酸和核苷类药物三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸三、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸 1 1、酶解法及碱水解法制备核苷酸、酶解法及碱水解法制备核苷酸l 酶解法制备脱氧核苷酸酶解法制备脱氧核苷酸 桔青霉桔青霉产生5-5-磷酸二脂酶磷酸二脂酶 红酵母红酵母产生3-3-磷酸二脂酶磷酸二脂酶7/2/202419核酸和核苷类药物 7/2/202420核酸和核苷类药物l 酶解法制备戊糖核苷酸酶解法制备戊糖核苷酸 我国从60年代开始使用核核酸酸酶酶P1P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈呈味味核核苷苷酸酸（肌肌苷苷酸酸和和鸟鸟苷苷酸酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产酶解法生产55单核苷酸工艺流程单核苷酸工艺流程7/2/202421核酸和核苷类药物7/2/202422核酸和核苷类药物l双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I IG G）呈呈味味核核苷苷酸酸的主要品种是肌肌苷苷酸酸钠钠和和鸟鸟苷苷酸酸钠钠，商品名简称为（I IG G），用核核酸酸酶酶PlPl降解RNA可获得GMPGMP和和AMPAMP，其中AMP经脱脱氨氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。7/2/202423核酸和核苷类药物7/2/202424核酸和核苷类药物l菌体自溶法生产核苷酸菌体自溶法生产核苷酸磷磷酸酸二二酯酯酶酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-5-核苷酸核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸。（1 1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：7/2/202425核酸和核苷类药物l 碱水解法生产碱水解法生产2 2，3 3-混合核苷酸混合核苷酸 RNARNA结结构构中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键对对于于碱碱性性条条件件不不稳稳定定，很很容容易易生生成成22，3 3 -环环状状磷磷酸酸酯酯，此此环环状状磷磷酸酸酯酯对对碱碱更更不不稳稳定定，很很易易加加水水分分解解生生成成2 2，3 3-混混合合核核苷苷酸酸。取RNA配成3 33.5%3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol0.3molL L浓度，升温至3838，保保温温16162020小小时时，用6mol6molL L盐盐酸酸中中和和至至pH7.0pH7.0，从RNARNA水水解解成成22，3 3-核核苷苷酸酸的的降降解解率率达达9595以以上上，将22，3 3-混混合合核核苷苷酸酸制制成成每每片片含含5050100mg100mg的的片片剂剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。7/2/202426核酸和核苷类药物7/2/202427核酸和核苷类药物l发酵法生产核苷酸发酵法生产核苷酸1 1、发酵法生产肌苷酸（、发酵法生产肌苷酸（IMPIMP）肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中肌苷酸钠是一种高效增鲜剂，在谷氨酸钠（味精）中加加2%2%，鲜度可增加，鲜度可增加3 3倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或倍。因此，在味精中添加肌苷酸钠（或鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。鸟苷酸钠）后成为第二代特鲜味精。产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌产氨短杆菌嘌呤核苷酸生物合成途径、代谢调控和肌苷酸发酵机制苷酸发酵机制:7/2/202428核酸和核苷类药物7/2/202429核酸和核苷类药物 积累积累IMPIMP的主要前提：的主要前提：（1 1）阻断）阻断SAMPSAMP合成酶合成酶:即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供即选育缺该酶的菌株（嘌呤缺陷型），发酵前期提供适量腺嘌呤，以满足菌体生长；适量腺嘌呤，以满足菌体生长；（2 2）保持）保持 PRA PRA 合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步合成畅通，即后期没有多余腺嘌呤阻遏该步反应；反应；（3 3）要使）要使IMPIMP渗出胞外，选育对渗出胞外，选育对MnMn+不敏感菌株；不敏感菌株；（4 4）生成的）生成的IMPIMP不被降解，恰好原菌株该酶活力低。不被降解，恰好原菌株该酶活力低。7/2/202430核酸和核苷类药物2 2、混合培养法发酵生产鸟苷酸（、混合培养法发酵生产鸟苷酸（GMPGMP）:直接发酵法生产直接发酵法生产GMPGMP必需满足以下条件必需满足以下条件（1 1）解除）解除GMPGMP的反馈抑制（与的反馈抑制（与GMPGMP积累相勃）积累相勃）;（2 2）改变细胞对）改变细胞对GMPGMP的透性的透性;（3 3）不分解生成）不分解生成GMPGMP 只能先合成只能先合成XMPXMP，后转化为，后转化为GMPGMP：方法如下：方法如下：选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时解除选育鸟嘌呤、腺嘌呤缺陷型菌株，同时解除PRPPPRPP转酰转酰胺酶及胺酶及XMPXMP合成酶的阻遏，积累大量合成酶的阻遏，积累大量XMP(GMPXMP(GMP合成酶及合成酶及SAMPSAMP合成酶缺失）。合成酶缺失）。7/2/202431核酸和核苷类药物XMPXMP转化为转化为GMPGMP菌株的条件菌株的条件:(1)GMP (1)GMP不被分解不被分解 (2)GMP (2)GMP合成酶活力要强化合成酶活力要强化(抗生素激动剂抗生素激动剂)(3)(3)增加细胞通透性增加细胞通透性7/2/202432核酸和核苷类药物l 半合成法制备核苷酸半合成法制备核苷酸 由于发酵法生产核苷发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成从核苷生成5-5-核苷酸收率可达核苷酸收率可达90%90%。例例一一：肌肌苷苷2mmol2mmolL L悬悬浮浮于于5ml5ml磷磷酸酸三三乙乙酯酯中中，温温度度控控制制00，添添加加氯氯化化氧氧磷磷6mmol6mmolL L，水水2mmol2mmolL L，反反应应2h2h，5 5-IMP-IMP摩摩尔尔产率达产率达9191。例例二二：鸟鸟苷苷2mmol2mmolL L悬悬浮浮于于5ml5ml磷磷酸酸三三甲甲酯酯中中，温温度度控控制制00，添添加加氯氯化化氧氧磷磷6mmol6mmolL L，水水2mmo/L2mmo/L，反反应应6h6h，5 5-GMP-GMP摩摩尔尔产产率达率达90%90%。7/2/202433核酸和核苷类药物四、核苷的制备四、核苷的制备 核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。核苷是多种核苷类药物的原料，在核酸类药物中占主导地位。（1 1）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种；）以核苷及其结构类似物、衍生物为主药物多达几十种；（2 2）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位；）核苷类药物在抗病毒、抗肿瘤、增强免疫方面占重要地位；（3 3）核核苷苷的的发发酵酵水水平平大大大大高高于于核核苷苷酸酸，所所以以常常做做后后者者的的前前体体物物质。质。1 1、RNARNA化学水解法制备核苷化学水解法制备核苷：7/2/202434核酸和核苷类药物7/2/202435核酸和核苷类药物2 2、发酵法生产核苷、发酵法生产核苷 产率高、周期短、控制容易、产量大。产率高、周期短、控制容易、产量大。共同特点：共同特点：（1 1）使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆）使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株；菌为诱变出发菌株；（2 2）具有特定标记的有变株；）具有特定标记的有变株；（3 3）发酵培养时需提供限量生长因素。）发酵培养时需提供限量生长因素。原菌株：原菌株：（1 1）AMPAMP强烈抑制强烈抑制PRPPPRPP转酰胺酶的活性，控制总代谢途径；转酰胺酶的活性，控制总代谢途径；（2 2）AMPAMP抑制抑制SAMPSAMP合成酶；合成酶；（3 3）GMPGMP抑制抑制IMPIMP脱氢酶脱氢酶7/2/202436核酸和核苷类药物7/2/202437核酸和核苷类药物生产菌株：生产菌株：（1 1）酶）酶6 6、7 7缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累缺失（为腺嘌呤缺陷型）积累IMP-IMP-肌肌苷（肝炎辅助药）；苷（肝炎辅助药）；（2 2）酶）酶4 4缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累缺失（为鸟嘌呤缺陷型）积累XMP-XMP-黄苷；黄苷；（3 3）酶）酶5 5缺失积累鸟苷。缺失积累鸟苷。7/2/202438核酸和核苷类药物发酵法生产肌苷发酵法生产肌苷（1 1）肌苷生产工艺）肌苷生产工艺（2 2）发酵工艺条件：）发酵工艺条件：碳源为葡萄糖碳源为葡萄糖保证充足的氮源保证充足的氮源磷酸盐的影响磷酸盐的影响Mg+Mg+、Ca+Ca+有促进作用有促进作用生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量生长因子腺嘌呤或酵母粉要亚适量最适发酵温度为最适发酵温度为30-3430-34，pH6.06.2pH6.06.2需大风量需大风量,高溶氧和低高溶氧和低COCO2 27/2/202439核酸和核苷类药物7/2/202440核酸和核苷类药物发酵法生产鸟苷和黄苷发酵法生产鸟苷和黄苷 鸟苷产生菌的特征：鸟苷产生菌的特征：（1 1）嘌呤核苷酸分解酶活力强；）嘌呤核苷酸分解酶活力强；（2 2）SAMPSAMP合成酶，合成酶，GMPGMP还原酶缺失；还原酶缺失；（3 3）解除）解除AMPAMP、GMPGMP对对PRPPPRPP转酰胺酶，肌苷酸脱氢酶转酰胺酶，肌苷酸脱氢酶和和GMPGMP合成酶的反馈抑制；合成酶的反馈抑制；7/2/202441核酸和核苷类药物7/2/202442核酸和核苷类药物发酵法生产腺苷发酵法生产腺苷 以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础菌株。以肌苷生产菌（枯草杆菌）为诱变基础菌株。诱变结果：诱变结果：（1 1）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失；）腺嘌呤回复，腺嘌呤酶缺失；（2 2）黄嘌呤缺陷型，）黄嘌呤缺陷型，GMPGMP还原酶缺失；还原酶缺失；（3 3）抗）抗8 8杂氮黄嘌呤解除对杂氮黄嘌呤解除对PRPPPRPP转酰胺酶的抑制；转酰胺酶的抑制；（4 4）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失与回复）发酵不稳定的原因：黄嘌呤缺陷及腺嘌呤酶缺失与回复（菌种传代中）。（菌种传代中）。7/2/202443核酸和核苷类药物7/2/202444核酸和核苷类药物第三节第三节 核酸与核苷类药物的制备举例核酸与核苷类药物的制备举例 7/2/202445核酸和核苷类药物（一）叠氮胸苷（一）叠氮胸苷（AzidothymidineAzidothymidine，AZTAZT）1 1、结构与性质、结构与性质 AZT是1987美国FDA批准的治疗艾艾滋滋病病的新药 。AZT的药理作用是人体内经磷磷酸酸化化后生成了3-叠氮-2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取取代代了了正正常常的的胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸参参与与病病毒毒DNADNA的的合合成成，含含有有AZTAZT成成份份的的DNADNA不不能能继继续续复复制制，从从而而达达到到阻阻止止病病毒毒增殖的目的增殖的目的。2 2、生产工艺、生产工艺 此合成路线的起始原原料料是是胸胸苷苷，目前主要是从DNADNA水水解解法法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。7/2/202446核酸和核苷类药物 已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：从2-脱氧胞苷或2-脱氧鸟苷或2-脱氧腺苷与胸胸腺腺嘧啶嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶磷酸化酶催化生成胸苷胸苷。从鸟苷（300mmolL）与胸腺嘧啶（300mmolL）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌嘌呤呤核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶和嘧嘧啶啶核核苷苷磷酸化酶磷酸化酶的催化下生成5-甲基尿苷，然后经化学法合成胸苷。7/2/202447核酸和核苷类药物7/2/202448核酸和核苷类药物（二）阿糖腺苷（二）阿糖腺苷（Adenine arabinosideAdenine arabinoside）1 1、结构与性质、结构与性质 阿阿糖糖腺腺苷苷的化学名称为9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美国用Streptomyces antibioticus NRRL3238菌株，1972年日本用Streptomyces hebacecus 4334菌株发发酵酵法法分分别别制制备备了了阿阿糖糖腺苷腺苷。1979年用从EColi中分离得到的尿尿嘧嘧啶啶磷磷酸酸化化酶酶和嘌嘌呤呤核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶，以固相酶固相酶的方法将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷将阿糖脲苷转化为阿糖腺苷。7/2/202449核酸和核苷类药物2 2、生产工艺、生产工艺l 酶酶-化学合成法化学合成法 最新的阿阿糖糖腺腺苷苷的合成法是酶酶-化化学学合合成成法法：用用尿尿苷苷为原料经氧氧氯氯化化磷磷和二二甲甲基基甲甲酰酰胺胺反应，生成氧氧桥桥化化合合物物，在碱性水溶液中水解成阿糖尿苷，然后利用阿糖尿苷中的阿阿拉拉伯伯糖糖经酶法酶法转化成阿糖腺苷阿糖腺苷。经选育从阿糖尿苷酶法合成阿糖腺苷的优秀菌株是产产气气肠肠杆杆菌菌（Enterbacteraerogens），这株菌能产生尿尿苷苷磷磷酸酸化化酶酶（Upase）和嘌嘌呤呤核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶（Pynpase），用这个菌株的休休止止细细胞胞作为酶源，从阿糖尿苷和腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷，菌体也可制成固定化细胞进行连续生产。7/2/202450核酸和核苷类药物7/2/202451核酸和核苷类药物7/2/202452核酸和核苷类药物l以以5-AMP5-AMP为原料的化学合成为原料的化学合成3 3、作用与用途、作用与用途 阿阿糖糖腺腺苷苷是近年来引人注目的广广谱谱DNADNA病病毒毒抑抑制制剂剂，对单纯疱疱疹疹、型型，带带状状疱疱疹疹，巨巨细细，牛牛痘痘等等DNADNA病病毒毒，在在体体内内外外都都有有明明显显抑抑制制作作用用。目前认为，阿糖腺苷是治疗单纯疱疹脑炎最好的抗病毒药物。阿糖腺苷在体内受激酶作用生成的阿阿糖糖腺腺三三磷磷，是是脱脱氧氧腺腺三三磷磷（dATPdATP）的的拮拮抗抗物物，从从而而阻阻抑抑了了以以dATPdATP为为底底物物的的病病毒毒DNADNA聚聚合合酶酶的的活活力力。而且阿糖腺三磷对于病毒DNA聚合酶的亲和性比宿主细胞的同一个酶的亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性。7/2/202453核酸和核苷类药物 （三）三氮唑核苷三）三氮唑核苷1 1、结构与性质、结构与性质 三氮唑核苷商品名病病毒毒唑唑，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。本品为白色结晶，熔点174176，易溶于水。这个化合物经X X线线解解析析，它的立体结构与腺苷、鸟苷非常类似，在在体体内内被被磷磷酸酸化化成成三三氮氮唑唑核核苷苷酸酸，抑制肌苷酸脱氢酶阻阻断断鸟鸟苷苷酸酸的的生生物物合合成成，从而抑制病毒DNA合成。它的另一特点是对病毒作用点多，不易使病毒产生抗药性。7/2/202454核酸和核苷类药物2 2、生产工艺、生产工艺 酶酶合合成成法法 使用产产气气肠肠杆杆菌菌，以（尿尿苷苷）肌肌苷苷和和TCATCA为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷。采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧嘧啶啶核核苷磷酸化酶苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶。7/2/202455核酸和核苷类药物（四四）阿阿糖糖胞胞苷苷（CytarabineCytarabine，Cytosine Cytosine arabinosidearabinoside，Arabinosyl CytosineArabinosyl Cytosine，AracytidineAracytidine）1 1、结构与性质、结构与性质 阿阿糖糖胞胞苷苷又称胞胞嘧嘧啶啶阿阿拉拉伯伯糖糖苷苷，糖的组成部分是阿阿拉拉伯伯糖糖。白色或类自色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻阻止止胞胞二二磷磷转转变变为为脱脱氧氧胞胞二二磷磷从从而而抑抑制制DNADNA的的合合成成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。只能注射只能注射。7/2/202456核酸和核苷类药物2 2、生产工艺、生产工艺 l以以5 5CMPCMP为原料的合成法为原料的合成法（1 1）工艺路线：）工艺路线：7/2/202457核酸和核苷类药物7/2/202458核酸和核苷类药物（2 2）工艺过程：）工艺过程：水水解解：并加入处理好的6.5L 氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至90，在不断搅拌下，于pH9下进行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2mL凝胶溶液，离心分离，取上清液5至10l，pH9.2电泳分析，检查水解程度。氧桥化氧桥化：氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm（pH2）氨解氨解：使氧桥断裂3，5-乙酰基脱落。成盐成盐：2盐酸-甲醇 l 以葡萄糖酸钙为原料的合成路线以葡萄糖酸钙为原料的合成路线 7/2/202459核酸和核苷类药物7/2/202460核酸和核苷类药物（五五）聚聚 肌肌 胞胞 苷苷 酸酸（聚聚 肌肌 胞胞）（PoyinosinicPoyinosinic，Polycytidylic AcidPolycytidylic Acid，Poly1Poly1：C C）1 1、结构与性质、结构与性质 1967年美国人Field发现聚聚肌肌胞胞是干干扰扰素素诱诱导导物物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人人工工合合成成的的干干扰扰素素诱诱导导剂剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶溶于于0.850.85氯化钠氯化钠溶液。2 2、生产工艺、生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：l 底物底物5-5-核苷二磷酸吡啶盐的制备核苷二磷酸吡啶盐的制备7/2/202461核酸和核苷类药物（3）固定化多多核核苷苷酸酸磷磷酸酸化化酶酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。7/2/202462核酸和核苷类药物3 3、Poly IPoly I：C C制备制备（1 1）底物预处理：）底物预处理：CDPCDP吡啶盐转成锂盐，吡啶盐转成锂盐，IDPIDP转成钠盐。转成钠盐。（2 2）酶酶促促反反应应：（每每毫毫升升反反应应液液含含molmolL L数数）IDPIDP或或CDP CDP 1515；Tris Tris 150150；MgC1MgC12 26 6；EDTA EDTA 1 1；聚聚合合酶酶5 5单单位位，pH9.0pH9.0，3737，3 34 4小小时时。用用盐盐酸酸调调pH1.5pH1.52.02.0，使使PolyIPolyI（或或Poly Poly C C）沉沉淀淀，立立即即离离心心。此此后后在在磷磷酸酸液液冲冲液液中中溶溶解解，等摩尔等摩尔Poly IPoly I与与Poly CPoly C混合，生成产品混合，生成产品 。7/2/202463核酸和核苷类药物3 3、作用与用途、作用与用途 本本品品具具有有抗抗病病毒毒，抗抗肿肿瘤瘤，增增强强淋淋巴巴细细胞胞免免疫疫功功能能和和抑抑制核酸代谢等作用制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。诱导产生干扰素。临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒性感染等多种疾患。7/2/202464核酸和核苷类药物l 胞二磷胆碱（胞二磷胆碱（CDP-CDP-胆碱）胆碱）1 1、结构与性质、结构与性质 胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐本品为白色无定形粉末，易易吸吸湿湿，易易溶溶于于水水，几几不不溶溶于于乙乙醇醇、氯氯仿仿、丙丙酮酮等等多多数数有有机机溶溶剂剂。1水溶液pH2.53.5，注射液pH7.0。7/2/202465核酸和核苷类药物2 2、生产工艺、生产工艺l 酶合成法酶合成法 胞二磷胆碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞胞苷苷酸酸和磷磷酸酸胆胆碱碱而合成，国内使用啤酒生产中废废弃弃的的酵酵母母，反应体系为：磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液（pH8.0）200molml，CMP CMP 20molml，磷酰胆碱磷酰胆碱 30molml，葡萄糖 1000molml，MgSO4.7H2O 20molml，酵母泥酵母泥 550mgm1。上述反应体系于2828保保温温2020小小时时，胞二磷胆碱对胞苷酸的收率为80。7/2/202466核酸和核苷类药物l 粘性红酵母发酵法粘性红酵母发酵法 国外发现一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱红酵母可高产胞二磷胆碱。菌体培养基（gL）：葡萄糖50；多胨5；酵母膏2；KH2PO4 2；（NH4）2HPO4 2；MgSO4.7H2O 1；pH6.0，经28，22h培养，收收集集菌菌体体，菌体经0.2molL磷酸缓冲液pH7.0洗涤，备用备用。产生胞二磷胆碱的反应体系（gL）：葡萄糖140；MgSO4.7H2O 6；5CMPCMPNa2 20；磷磷酸酸胆胆碱碱20；析干菌菌体体50；反应体系中保持磷酸缓冲缓pH7.0、0.2molL，30，28小时产胞二磷胆碱9.8gL，对5-CMP收率92.5。7/2/202467核酸和核苷类药物提提取取工工艺艺：反应液离心除去菌体，用0.5molL KOH调pH8.5，上dowex 12（酸型）树脂，水洗后用甲甲酸酸梯梯度度洗洗脱脱，在0.04molL甲酸洗脱液中收集产品，含胞二磷胆碱溶液上活性炭柱，丙酮-氨水溶液洗脱，减压浓缩，乙醇中结晶。3 3、作用与用途、作用与用途 胞二磷胆碱是卵卵磷磷脂脂生物合成的前前体体。当脑功能下降时，脑组织内卵磷脂含量显著减少。本本品品能能促促进进卵卵磷磷脂脂生生物物合合成成，兴奋脑干网状结构，特别是上行网状联系，提高觉醒反应，降低“肌放电”阈值，恢复神经组织机能，增加脑血流量和脑耗氧量，从而改善脑循环和脑代谢改善脑循环和脑代谢，大大提高患者的意识水平大大提高患者的意识水平。7/2/202468核酸和核苷类药物 临床用于减轻严重脑外伤和脑手术伴随的意识障碍，治治疗疗帕帕金金森森氏氏症症，抑抑郁郁症症等等精精神神疾疾患患。由于胞二磷胆碱是在ATPATP存存在在下下参与磷脂的合成反应，故合用ATP可提高本品疗效；用于脑外伤，脑出血患者可合用止血剂和防水肿药；用于震颤麻痹可合用L-多巴；用于精神病可合用镇静药。7/2/202469核酸和核苷类药物1、酶合成法：、酶合成法：啤酒酵母泥啤酒酵母泥 CMP+磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱 胞二磷胆碱胞二磷胆碱 Ph8，282、粘性红酵母发酵法：、粘性红酵母发酵法：粘性红酵母粘性红酵母5-CMPNa+磷酸胆碱磷酸胆碱 胞二磷胆碱胞二磷胆碱 pH7，303、提取工艺：、提取工艺：离心离心 KOH 离子交换离子交换 洗脱洗脱反应液反应液 去菌体去菌体 洗脱液洗脱液 Ph 8.5 甲酸甲酸7/2/202470核酸和核苷类药物 活性炭吸附活性炭吸附 减压、浓缩减压、浓缩 结晶结晶 洗脱液洗脱液 成品成品丙酮、氨水洗脱丙酮、氨水洗脱7/2/202471核酸和核苷类药物