第四章病毒抗原与抗体检测技术优质课件

第四章病毒抗原与抗体检测技术第四章病毒抗原与抗体检测技术1优选第四章病毒抗原与抗体检测技术优选第四章病毒抗原与抗体检测技术2二、影响反应的因素电解质电解质pH7时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀温度温度 37温度升高，反应加快温度升高，反应加快 56酸碱度酸碱度 pH68接近等电点时易出现假阳性接近等电点时易出现假阳性二、影响反应的因素电解质3第一节 免疫荧光技术Immunofluorescence assay IFA能解决是什么能解决是什么 在哪里在哪里 有多少有多少荧光荧光激发光谱激发光谱发射光谱发射光谱荧光效率荧光效率荧光寿命荧光寿命荧光猝灭荧光猝灭荧光偏振荧光偏振第一节 免疫荧光技术Immunofluorescence 4第一节 免疫荧光技术荧光物质荧光物质荧光物光物质最大吸收光最大吸收光谱最大最大发射光射光谱应用用异硫异硫氰酸酸荧光素光素(FITC)490495nm520530nm（黄（黄绿色）色）FAT、荧光偏振免疫光偏振免疫测定定四乙基四乙基罗丹明丹明(RB200)570575nm595600nm（橙（橙红色）色）FITC的的衬比染色或双比染色或双标记FAT四甲基异硫四甲基异硫氰酸酸罗丹丹明明(TRITC)550nm620nm（橙（橙红色）色）FITC的的衬比染色或双比染色或双标记FAT藻藻红蛋白（蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）色）双双标记FAT、流式、流式细胞胞术7-氨基氨基-4-甲基香豆素甲基香豆素354nm430nm（蓝色）色）双双标记或多或多标记FATEu3+螯合物螯合物340nm613nm时间分辨分辨荧光免疫光免疫测定定第一节 免疫荧光技术荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱5二、免疫荧光试验（一）原理（一）原理用荧光标记物标记病毒抗原或抗体，作为分用荧光标记物标记病毒抗原或抗体，作为分子探针，检查细胞或组织内相应的病毒抗体子探针，检查细胞或组织内相应的病毒抗体或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光，或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光，用荧光显微镜观察，可确定病毒种类、定位、用荧光显微镜观察，可确定病毒种类、定位、定量。定量。二、免疫荧光试验（一）原理6二、免疫荧光试验（二）类型（二）类型荧光抗体法荧光抗体法荧光抗原法荧光抗原法免疫细胞（组织）化学技术免疫细胞（组织）化学技术二、免疫荧光试验（二）类型7二、免疫荧光试验（三）方法（三）方法制备标本制备标本制备荧光抗体制备荧光抗体荧光抗体染色荧光抗体染色荧光显微镜检查荧光显微镜检查二、免疫荧光试验（三）方法8酶标记物结合后改变酶活性异硫氰酸荧光素(FITC)用绵羊红细胞免疫家兔获得中和试验病毒CCID50当抗血清组的CCID50与阴性组之差的对数大于2,才说明中和试验阳性。当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。距离比例（大于50%的CPE阳性率50%）/（大于50%的CPE阳性率小于50%的CPE阳性率）（8350）/（8317）0.体外将病毒与特异性抗体混合并发生反应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的方法。lgCCID50=大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数=lg105+0.（5020）/（8020）0.5630分钟灭活，加甘油后长期保存透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)lgCCID50=大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例稀释系数的对数=lg105+0.中和试验病毒CCID50当抗血清组的CCID50与阴性组之差的对数大于2,才说明中和试验阳性。两种荧光素抗体检测两种抗原二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本制作病毒染色标本培养敏感细胞（细胞爬片）培养敏感细胞（细胞爬片）种毒种毒 固定、干燥固定、干燥丙酮丙酮酶标记物结合后改变酶活性二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本9二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本制作病毒染色标本 临床样本（非固型组织）临床样本（非固型组织）涂片涂片 固定、干燥固定、干燥二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本10二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本制作病毒染色标本 尸检样品尸检样品（35mm）脱水脱色脱水脱色 冰冻切冰冻切片片 印片印片 石蜡固定、脱蜡石蜡固定、脱蜡 丙酮固定、干燥丙酮固定、干燥二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本11二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备荧光抗体制备制备抗体制备抗体用高纯度病毒免疫用高纯度病毒免疫动物动物获取血清，分离获取血清，分离IgG，提纯提纯 家兔、绵羊、山羊家兔、绵羊、山羊 高特异性高特异性 高亲和力高亲和力二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备12二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备荧光抗体制备标记荧光素标记荧光素 共价键结合共价键结合抗体抗体+荧光素荧光素 4持续搅拌数小时持续搅拌数小时纯化（离心、透析、过滤）纯化（离心、透析、过滤）二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备13二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体鉴定制成的荧光抗体 以以FITC为例为例荧光（荧光（F）蛋白（）蛋白（P）结合率）结合率调整制备液至调整制备液至A280mm=1 2.87A495mm A280mm0.35A495mm比值越大，抗体结合荧光素越多比值越大，抗体结合荧光素越多F/P=二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体 以FITC为例F14二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体鉴定制成的荧光抗体测定抗体效价双向免疫扩散试验测定抗体效价双向免疫扩散试验抗体特异性吸收试验、抑制试验抗体特异性吸收试验、抑制试验抗体特异性染色滴度倍比稀释抗体特异性染色滴度倍比稀释二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体15高特异性 高亲和力含钙镁离子的生理盐水，可维持补体的稳定四、时间分辩免疫荧光技术1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；距离比例（大于50%的CPE阳性率50%）/（大于50%的CPE酸碱度 pH68接近等电点时易出现假阳性比值越大，抗体结合荧光素越多0 10测滴度细胞培养，将病毒10倍稀释接种敏感细胞或动物，观察CPE或动物感染情况，确定滴定终点以CCID50或LD50表示滤光片隔热、激发和吸收滤光片底物铕Ed3+锝Tb3+钐Sm3+标准抗体浓度为20个抗体单位/0.FITC的衬比染色或双标记FAT固相抗体 标本 酶标抗体 底物 显色固定血清稀释抗病毒法二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色荧光抗体染色直接法直接法高特异性 高亲和力二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色16二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色荧光抗体染色间接法间接法二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色17二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色荧光抗体染色补体法补体法荧光标记抗补体抗体荧光标记抗补体抗体 双标记法双标记法两种荧光素抗体检测两种抗原两种荧光素抗体检测两种抗原二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色18二、免疫荧光试验5.设立对照设立对照 区分特异性和非特异性染色区分特异性和非特异性染色标本自发荧光对照标本自发荧光对照荧光抗体对照荧光抗体对照阳性抗原对照阳性抗原对照阻断试验阻断试验二、免疫荧光试验5.设立对照 区分特异性和非特异性染色19三、免疫荧光显微镜技术荧光显微镜荧光显微镜利用一定波利用一定波长的激的激发光光对样品品进行激行激发，产生一定波生一定波长的的荧光，光，对样品品结构或其构或其组分分进行定行定性、定位、定量性、定位、定量观察察检测。三、免疫荧光显微镜技术荧光显微镜20三、免疫荧光显微镜技术l光源高光源高压汞灯、氙灯或汞灯、氙灯或卤素灯素灯 l滤光片隔光片隔热、激、激发和吸收和吸收滤光片光片l光路透射光、落射光光路透射光、落射光l聚光器明聚光器明视野、暗野、暗视野和相差野和相差荧光聚光器光聚光器l镜头消色差消色差镜头 三、免疫荧光显微镜技术光源高压汞灯、氙灯或卤素灯 21三、免疫荧光显微镜技术透射光：照明光透射光：照明光线从从标本下本下经聚光器透聚光器透过标本本进入物入物镜。落射光：照明光落射光：照明光线从从标本上本上经垂直照明垂直照明器落射到器落射到标本，本，经标本反射本反射进入物入物镜。三、免疫荧光显微镜技术透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标22四、时间分辩免疫荧光技术Timeresolved fluoroimmunoassay TRFIA（一）原理（一）原理自发荧光寿命短自发荧光寿命短:1ns10ns镧系元素寿命长镧系元素寿命长:10s1000s短寿命短寿命荧光完全衰光完全衰变后再后再测定定镧系元素特异系元素特异荧光光铕Ed3+锝Tb3+钐Sm3+镝Dy3+四、时间分辩免疫荧光技术Timeresolved fluor23四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型（二）方法类型双抗体夹心法双抗体夹心法固相抗体和固相抗体和Eu3+标记抗体与待抗体与待检抗原抗原结合，形成固相抗合，形成固相抗体体-待待检抗原抗原-Eu3+标记抗体复合物，抗体复合物，酸性增酸性增强液下，液下，Eu3+解离，解离，340nm激激发光下光下发射射613nm荧光。光。四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型固相抗体和Eu3+标记24四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型（二）方法类型固相抗体竞争法固相抗体竞争法待待检抗原和抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体抗原与固相抗体竞争争结合合,温育洗温育洗涤后在固相中加入后在固相中加入荧光增光增强液液,测定定荧光光强度，度，荧光光强度与度与待待检抗原含量成反比。抗原含量成反比。固相抗原竞争法固相抗原竞争法待待检抗原和固相抗原抗原和固相抗原竞争争结合定量的合定量的Eu3+标记抗体，抗体，温育洗温育洗涤后在固相中加入后在固相中加入荧光增光增强液液,测定定荧光光强度，度，荧光光强度与待度与待检抗原含量成反比。抗原含量成反比。四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型25第二节 酶免疫技术Enzyme immunoassay抗原抗体反应特异性抗原抗体反应特异性酶高效催化反应专一性酶高效催化反应专一性 第二节 酶免疫技术Enzyme immunoassay26第二节 酶免疫技术酶酶 底底 物物显色反应显色反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRPHRP 邻苯二胺邻苯二胺OPDOPD四甲替联苯胺四甲替联苯胺TMBTMB氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,22,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 APAP4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405405420 420-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420 420 第二节 酶免疫技术酶 底 物显色反应 测定波长 辣根过氧化27第二节 酶免疫技术酶标记酶标记戊二醛交联法戊二醛交联法过碘酸氧化法过碘酸氧化法醛基醛基酶酶蛋白质蛋白质HRP过碘酸盐过碘酸盐HRP 醛基醛基第二节 酶免疫技术酶标记醛基酶蛋白质HRP过碘酸盐HRP醛28滤光片隔热、激发和吸收滤光片Enzyme immunoassay标准抗病毒血清(20个抗体单位/0.人和豚鼠灭活温度为56；抗体滴度的含义抑制CPE的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。5630分钟灭活，加甘油后长期保存待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。补体不稳定，每次试验前需滴定血凝滴度以出现+的稀释度的倒数为判定终点,为1个血凝单位。标准抗体浓度为20个抗体单位/0.四、时间分辩免疫荧光技术用绵羊红细胞免疫家兔获得0 10固相抗体 标本 酶标抗体 底物 显色阳性率小于50%的CPE阳性率）短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光铕Ed3+锝Tb3+钐Sm3+抗体特异性染色滴度倍比稀释滤光片隔热、激发和吸收滤光片2ml、1绵羊红细胞0.第二节 酶免疫技术固相载体固相载体塑料制品塑料制品微粒微粒膜载体膜载体 NC膜、尼龙膜膜、尼龙膜滤光片隔热、激发和吸收滤光片第二节 酶免疫技术固相载体29第二节 酶免疫技术包被与封闭包被与封闭包被包被适宜浓度蛋白质适宜浓度蛋白质封闭封闭二次包被填补空隙二次包被填补空隙 小牛血清小牛血清第二节 酶免疫技术包被与封闭30二、酶联免疫吸附试验Enzymelinked immunosorbent assay ELISA酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。二、酶联免疫吸附试验Enzymelinked immunos31第四章病毒抗原与抗体检测技术优质课件32间接法检测抗体检测抗体+固相抗原固相抗原 标本标本 酶标抗体酶标抗体 底物底物 显色显色间接法检测抗体+固相抗原 标本 33双抗体夹心法检测抗原检测抗原+固相抗体固相抗体 标本标本 酶标抗体酶标抗体 底物底物 显色显色双抗体夹心法检测抗原+固相抗体 标本 34竞争法可检测抗原、抗体可检测抗原、抗体YYY+YYY+YYY参参考考管管酶标抗原酶标抗原YYY+YYY+YYY待待测测管管酶标抗原酶标抗原抗原抗原竞争法可检测抗原、抗体YYY+YYY+YYY参考管酶标抗原Y35捕获法检测检测IgM抗体抗体+抗抗IgM 标本标本 抗原抗原 酶标抗体酶标抗体 显色显色 （含（含IgM）+捕获法检测IgM抗体+抗IgM 标本 36三、免疫酶染色试验Immunoenzymatic staining test IEST酶标抗体（抗原）酶标抗体（抗原）抗原（抗体）复合物抗原（抗体）复合物 底物底物 有色底物有色底物三、免疫酶染色试验Immunoenzymatic stain37三、免疫酶染色试验细胞免疫酶染色细胞免疫酶染色均相酶免疫测定均相酶免疫测定无需分离游离与结合无需分离游离与结合的酶标记物的酶标记物酶标记物结合后改变酶活性酶标记物结合后改变酶活性非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定需分离游离与结合的需分离游离与结合的酶标记物酶标记物液相用二抗或沉淀去除游离酶标记物液相用二抗或沉淀去除游离酶标记物固相固相ELISAELISA三、免疫酶染色试验细胞免疫酶染色38第三节 放射免疫技术Radioimmunoassay RIA利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异性相结合进行定量分析特异性相结合进行定量分析放射免疫放射免疫核素标记抗原与未标记抗原竞争性结合特异核素标记抗原与未标记抗原竞争性结合特异性抗体性抗体免疫放射免疫放射核素标记抗体结合待测抗原核素标记抗体结合待测抗原R.S.Yalow第三节 放射免疫技术Radioimmunoassay 395,其反对数是103.设立对照 区分特异性和非特异性染色如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；自发荧光寿命短:1ns10ns反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病毒失去感染力。8 0中和抗体人和豚鼠灭活温度为56；如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应抗体滴度的含义抑制CPE的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。纯化（离心、透析、过滤）短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光0 10抗体滴度的含义抑制CPE的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(BF)与Ag的量变存在着函数关系剂量反应A280mm0.铕Ed3+锝Tb3+钐Sm3+第三节 放射免疫技术125I、131I、3H、14C标记标记纯化纯化鉴定鉴定放射性放射性免疫活性免疫活性5,其反对数是103.第三节 放射免疫技术125I、13140第三节 放射免疫技术第三节 放射免疫技术41第三节 放射免疫技术放射免疫放射免疫竞争法竞争法第三节 放射免疫技术放射免疫42+BoundFreeAgAb6/8=0.756/8=0.754/8=0.54/8=0.52/8=0.252/8=0.251/8=0.1251/8=0.125B/B+F+BoundFreeAgAb6/8=0.75443第三节 放射免疫技术放射免疫放射免疫以未以未结合的合的Ag*为F，Ag*Ab复合物复合物为B，则B/F或或B/(BF)与与Ag的量的量变存在存在着函数关系着函数关系剂量量反反应曲曲线 第三节 放射免疫技术放射免疫以未结合的Ag*为F，Ag*A44第四节 血清学试验中和试验中和试验血凝血凝/血凝抑制试验血凝抑制试验补体结合试验补体结合试验第四节 血清学试验中和试验45一、中和试验neutralization test 体外将病毒与特异性抗体混合并发生反体外将病毒与特异性抗体混合并发生反应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的方法。后测定残存病毒感染力的方法。中和抗体中和抗体一、中和试验neutralization test46一、中和试验（一）原理（一）原理中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病毒失去感染力。细胞，使病毒失去感染力。当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。对宿主的感染力。一、中和试验（一）原理47一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤病毒已知滴度，并有感染力病毒已知滴度，并有感染力测滴度细胞培养，将病毒测滴度细胞培养，将病毒1010倍稀释接种敏感倍稀释接种敏感细胞或动物，观察细胞或动物，观察CPECPE或动物感染情况，确或动物感染情况，确定滴定终点以定滴定终点以CCID50CCID50或或LD50LD50表示表示标准病毒试验浓度标准病毒试验浓度100 CCID50/100 CCID50/单位体积或单位体积或100 LD50/100 LD50/单位体积单位体积一、中和试验（二）方法步骤48一、中和试验抗体抗体用细胞培养法测病毒抗体的滴度将倍比稀用细胞培养法测病毒抗体的滴度将倍比稀释的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，释的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接种敏感细胞，观察接种敏感细胞，观察CPECPE。病毒抗体滴度的确定抗血清保护细胞免受病毒抗体滴度的确定抗血清保护细胞免受病毒感染的最高稀释倍数的倒数。病毒感染的最高稀释倍数的倒数。抗体滴度的含义抑制抗体滴度的含义抑制CPECPE的最高稀释倍数的的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。一、中和试验抗体49一、中和试验举例举例如观察结果是如观察结果是110110至至13201320抗血清均能抑制病毒抗血清均能抑制病毒的的CPECPE，也就是当抗血清稀释到，也就是当抗血清稀释到320320倍时，倍时，0.1ml0.1ml抗血清含有抗血清含有1 1个抗体单位。个抗体单位。请问请问11601160及及140140含有几个抗体单位？含有几个抗体单位？标准抗体浓度为标准抗体浓度为2020个抗体单位个抗体单位/0.1ml/0.1ml一、中和试验举例50一、中和试验宿主宿主细胞培养细胞培养:观察观察CPECPE和空斑（最理想和常和空斑（最理想和常用）用）鸡胚观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿鸡胚观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、囊腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSVHSV）动物（小白鼠）动物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林脑炎病毒脑病毒、森林脑炎病毒一、中和试验宿主51一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤固定血清固定血清稀释抗病毒法稀释抗病毒法检测病毒及其滴度检测病毒及其滴度固定病毒固定病毒稀释抗血清法稀释抗血清法检测血清效价检测血清效价一、中和试验（二）方法步骤52一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤固定血清固定血清稀释病毒法稀释病毒法 用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清的病毒与标准的抗血清(20(20个抗体单位个抗体单位/单位体积单位体积)混混合、孵育，使二者充分反应，然后将混合液接种到合、孵育，使二者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验结果。敏感宿主体内，观察试验结果。一、中和试验（二）方法步骤53固定血清稀释病毒法试验材料试验材料宿主宿主:敏感细胞和动物、鸡胚敏感细胞和动物、鸡胚标准抗病毒血清标准抗病毒血清(20(20个抗体单位个抗体单位/0.1ml)/0.1ml)病毒分离物病毒分离物试验步骤试验步骤不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞培养液倍不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞培养液倍比稀释病毒比稀释病毒不同浓度病毒液与等量阴性血清混合不同浓度病毒液与等量阴性血清混合接种细胞接种细胞,设正常细胞对照，设正常细胞对照，CO2CO2孵箱观察孵箱观察CPECPE中和试验病毒中和试验病毒CCID50CCID50当抗血清组的当抗血清组的CCID50CCID50与阴性组之差与阴性组之差的对数大于的对数大于2,2,才说明中和试验阳性。才说明中和试验阳性。固定血清稀释病毒法试验材料54固定血清稀释病毒法 阴性血清病毒阴性血清病毒CCID50的计算的计算病毒病毒稀释度稀释度CPECPE孔数孔数/接种孔数接种孔数 累计数累计数CPECPE数数 存活数存活数CPECPE阳性比阳性比例例CPECPE阳性率阳性率（）（）10-45/510 010/10100.010-54/5 5 1 5/683.010-61/5 1 5 1/617.010-70/5 0 100/10 0固定血清稀释病毒法 阴性血55固定血清稀释病毒法距离比例（大于距离比例（大于50%50%的的CPECPE阳性率阳性率50%50%）/（大于（大于50%50%的的CPECPE阳性率小于阳性率小于50%50%的的CPECPE阳性率）（阳性率）（83835050）/（83831717）0.50.5lgCCID50=lgCCID50=大于大于50%50%的的CPECPE阳性率血清稀释度的对数阳性率血清稀释度的对数+距距离比例离比例稀释系数的对数稀释系数的对数=lg105+0.5 lg0.1=5.5,=lg105+0.5 lg0.1=5.5,其反对数是其反对数是105.5.105.5.阴性血清组的病毒阴性血清组的病毒CCID50CCID50为为105.5/0.1ml105.5/0.1ml。固定血清稀释病毒法距离比例（大于50%的CPE阳性率5056固定血清稀释病毒法 阳性血清病毒阳性血清病毒CCID50的计算的计算病毒病毒稀释度稀释度CPE孔数孔数/接种孔数接种孔数 累计数累计数CPE数数 存活数存活数CPE阳性阳性比例比例CPE阳性率阳性率（）（）10-25/510 010/10100.010-33/55 25/771.010-42/52 52/729.010-50/5 0 100/10 0固定血清稀释病毒法 阳57固定血清稀释病毒法距离比例（大于距离比例（大于50%50%的的CPECPE阳性率阳性率50%50%）/（大于（大于50%50%的的CPECPE阳性率小于阳性率小于50%50%的的CPECPE阳性率）阳性率）（71715050）/（71712929）0.50.5大于大于50%50%的的CPECPE阳性率血清稀释度的对数阳性率血清稀释度的对数+距离比例距离比例稀释系数稀释系数的对数的对数=lg103+0.5 lg0.1=3.5,=lg103+0.5 lg0.1=3.5,其反对数是其反对数是103.5103.5。阳性血清组的病毒阳性血清组的病毒CCID50CCID50为为103.5/0.1ml103.5/0.1ml。固定血清稀释病毒法距离比例（大于50%的CPE阳性率5058一、中和试验（二）方法步骤（二）方法步骤固定病毒固定病毒稀释血清法稀释血清法 用于血清抗体滴度的测量。用已知病毒检测位置抗用于血清抗体滴度的测量。用已知病毒检测位置抗体滴度。体滴度。100 CCID 100 CCID5050/单位体积的病毒单位体积的病毒+连续倍比稀释血清连续倍比稀释血清孵育孵育1h1h接种敏感宿主接种敏感宿主观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况一、中和试验（二）方法步骤59固定病毒稀释血清法试验材料试验材料:敏感宿主敏感宿主标准滴定的病毒标准滴定的病毒100CCID50/0.1ml100CCID50/0.1ml急性期或恢复期血清急性期或恢复期血清试验步骤试验步骤细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并3737孵育孵育1h1h取混合液取混合液0.2ml0.2ml接种细胞接种细胞,CO2,CO2孵箱观察孵箱观察CPECPE5050血清中和终点血清中和终点50%50%细胞不产生细胞病变的血清稀释细胞不产生细胞病变的血清稀释度度固定病毒稀释血清法试验材料:60固定病毒稀释血清法恢复期血清中和病毒的结果恢复期血清中和病毒的结果血清稀释度CPE孔数/接种孔数 累计数CPE数 无CPE数CPE阳性比例CPE阳性率（）1：16(10-1.2)0/40 80/80.01：32(10-1.5)1/41 41/520.01：64(10-1.8)3/44 14/580.01：128(10-2.1)4/48 08/8100.0固定病毒稀释血清法恢复期血清中和病毒的结果血清CPE孔数/接61固定病毒稀释血清法l距离比例（距离比例（50%50%小于小于50%50%的的CPECPE阳性率）阳性率）/l（大于（大于50%50%的的CPECPE阳性率小于阳性率小于50%50%的的CPECPE阳性率）阳性率）l（50502020）/（80802020）0.50.5l50%50%血清中和终点的范围血清中和终点的范围:1:32:1:32与与1:641:64之间。之间。l中和终点浓度中和终点浓度=小于小于50%50%的的CPECPE阳性率血清稀释度的对数阳性率血清稀释度的对数+距离距离比例比例稀释系数的对数稀释系数的对数=lg101.5+0.5 lg0.5=1.65,=lg101.5+0.5 lg0.5=1.65,其反对其反对数是数是1/451/45l即即50%50%血清中和终点为血清中和终点为1:451:45l 含义含义1:451:45稀释度的恢复期血清可保护稀释度的恢复期血清可保护50%50%细胞不产生细胞病细胞不产生细胞病变效应。变效应。固定病毒稀释血清法距离比例（50%小于50%的CPE阳性62二、血凝/血抑血凝血凝 HA二、血凝/血抑血凝 HA63血凝抑制 HI血凝抑制 HI64 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12血凝试验 HA试验方法试验方法选择选择9696孔板（孔板（V V型）型）病毒液倍比稀释病毒液倍比稀释稀释好后加鸡红细胞稀释好后加鸡红细胞混匀后混匀后2020室温静置室温静置30min30min+50l PBS吸出一半吸出一半1:2 1:221:231:24+100l 病毒液病毒液+50l 鸡红细胞鸡红细胞吸弃一半吸弃一半 1 2 3 4 5 6 65血凝试验 HA血凝滴度以出现血凝滴度以出现+的稀释度的倒数为判定的稀释度的倒数为判定终点终点,为为1 1个血凝单位。个血凝单位。凝集效价能使血球产生凝集效价能使血球产生+凝集的病毒最高凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，即稀释度为病毒的凝集效价，即0.5ml0.5ml病毒液病毒液含含1 1个血凝单位。个血凝单位。血凝试验 HA血凝滴度以出现+的稀释度的倒数为判定终点66三、补体结合试验补体正常人和动物血清与组织液中的一组经活化补体正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，辅助抗体介导免疫溶菌后具有酶活性的蛋白质，辅助抗体介导免疫溶菌和溶血作用。对热不稳定。和溶血作用。对热不稳定。绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体（溶血素）作用绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体（溶血素）作用形成溶血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致形成溶血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致敏红细胞溶解。敏红细胞溶解。补体可结合任何病毒抗原抗体复合物补体可结合任何病毒抗原抗体复合物三、补体结合试验补体正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后67三、补体结合试验如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。统时，而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。三、补体结合试验如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗68三、补体结合试验有有3 3个系统个系统反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；抗体（或抗原）；补体系统；补体系统；指示系统，即指示系统，即SRBCSRBC与相应溶血素，形成致敏红与相应溶血素，形成致敏红细胞。细胞。三、补体结合试验有3个系统69三、补体结合试验病毒抗原l从组织培养、鸡胚和动物试验中获得病毒抗原l应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强l如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应三、补体结合试验病毒抗原70三、补体结合试验抗体l免疫用的病毒抗原最好不是同一细胞或动物，以免发生交叉反应l血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性l人和豚鼠灭活温度为56；家兔和马灭活温度为65三、补体结合试验抗体71三、补体结合试验补体检测人和哺乳动物血清应用豚鼠新鲜血清补体临用前使用1SRBC制备绵羊颈静脉采血，生理盐水洗涤溶血素用绵羊红细胞免疫家兔获得效价达到1:4000可获得5630分钟灭活，加甘油后长期保存稀释液l含钙镁离子的生理盐水，可维持补体的稳定三、补体结合试验补体72三、补体结合试验溶血素的滴定先将溶血素稀释成1:1001:1000,再依次加入溶血素0.1ml，钙镁盐水0.2ml，1:60补体0.2ml、1绵羊红细胞0.1ml，混匀后再水浴结果判定完全溶血的试管液体红色透明，离心后见少许细胞;不溶血的试管液体混浊，放置后见红细胞沉淀，上清无色透明溶血素效价的测定;以完全溶血的最高稀释倍数确定为1个单位本例1个单位的溶血素的效价为14000；正式使用2个单位三、补体结合试验溶血素的滴定73三、补体结合试验补体的滴定补体的滴定补体不稳定，每次试验前需滴定管号1：60补体钙镁盐水（ml)2U抗原(ml)1致敏SRBC(ml)结果10.040.260.10.2不溶20.060.240.10.2不溶30.080.220.10.2微溶40.100.200.10.2微溶50.120.180.10.2全溶60.140.160.10.2全溶70.140.140.10.2全溶三、补体结合试验补体的滴定管号1：60补体钙镁盐水（ml)274