血清学诊断在结核病中临床应用价值课件

血清学血清学诊断在断在结核病核病中中临床床应用价用价值血清学血清学诊诊断在断在结结核病中核病中临临床床应应用价用价值值血清学血清学诊诊断在断在结结核病中核病中临临床床应应用用结核病的历史 纪元前一万年纪元前一万年 纪元前纪元前500500年年 汉唐隋时代汉唐隋时代 1650年年 命名结命名结核核1865年年 证实结核证实结核病具有传病具有传染性染性 1882年年 发现发现结核结核菌菌1921年年 卡介苗卡介苗1944年年 1908年年 结核菌结核菌素皮试素皮试链霉素链霉素1952年年 异烟肼异烟肼1966年年 利福平利福平1971年年 短程化短程化疗疗1995年年 DOTS策略策略STOP TB策略策略2005年年 2结结核病的核病的历历史史 纪纪元前一万年元前一万年 纪纪元前元前500年年 汉汉唐隋唐隋时时代代 16结核病的今天全球范围内结核病疫情急剧恶化全球范围内结核病疫情急剧恶化结核病及艾滋病同时流行结核病及艾滋病同时流行结核菌耐药现象益发严重结核菌耐药现象益发严重人口大规模流动人口大规模流动我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率结核菌感染率44.5%新发活动性结核患者新发活动性结核患者130万万/年年死亡死亡13万万/年年早期快速诊断及治疗成为制约结核病控制的关键早期快速诊断及治疗成为制约结核病控制的关键常规实验室诊断结核病方法阳性率不到常规实验室诊断结核病方法阳性率不到60%3结结核病的今天全球范核病的今天全球范围围内内结结核病疫情急核病疫情急剧恶剧恶化化3结核病的数字结核病的数字全全世世界界约约1/3的的人人口口（近近20亿亿）携带结核菌。携带结核菌。自自1882年年以以来来已已经经有有2亿亿人人死死于于结核病。结核病。每年有每年有2000万人万人患活动性结核病。患活动性结核病。每年约有每年约有300万人万人死于结核病。死于结核病。结核病每结核病每15秒钟秒钟就杀死就杀死1人。人。预预计计未未来来20年年还还将将有有3600万万人人死死于结核病。于结核病。4结结核病的数字全世界核病的数字全世界约约1/3的人口（近的人口（近20亿亿）携）携带结带结核菌。核菌。4结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主要特点：生物学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性抗酸染色阳性5结结核分枝杆菌核分枝杆菌结结核分枝杆菌核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物生物实验室检查方法的历史实验室检查方法的历史1880sTubercle bacilli的发现 Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test(TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培养基1940sDubos agar,Ogawa 培养基1950sMiddlebrook 7H91990s核酸扩增方法2000sELISPOT,QuantiFERON20XX?6实验实验室室检查检查方法的方法的历历史史1880s Tubercle bacil当前结核研究的热点当前结核研究的热点新型抗新型抗结核核药物物(50%)新型快速新型快速诊断技断技术(40%)新型新型结核疫苗核疫苗(10%)7当前当前结结核研究的核研究的热热点新型抗点新型抗结结核核药药物物(50%)7结核病的实验室诊断结核病的实验室诊断 细菌学细菌学涂片：涂片：敏感性低敏感性低传统固体培养：传统固体培养：所需时间长，所需时间长，23月月 分子生物学分子生物学TB-DNATB-RNAHAIN技术技术Xpert MTB/RIFDNA微阵芯片微阵芯片 血清血清/免疫学免疫学IGRA：有望替代有望替代TST，但，但不能区分不能区分活动性活动性TB及潜伏感及潜伏感染染血清学：血清学：存在抗原存在抗原纯度和特纯度和特异性差等异性差等方面的问方面的问题题液体培养及药液体培养及药敏试验：平均敏试验：平均时间时间20天天8结结核病的核病的实验实验室室诊诊断断 细细菌学涂片：菌学涂片：传统传统固体培养：所需固体培养：所需时间时间血清学诊断技术血清学诊断技术血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。血清学诊断技术优势：是一种对疾病进行早期诊断的理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便操作简便结果显示快速结果显示快速目前用于血清学诊断的主要方法目前用于血清学诊断的主要方法:酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法免疫印迹法(Western Blotting)等等等等9血清学血清学诊诊断技断技术术血清学血清学诊诊断技断技术优势术优势：是一种：是一种对对疾病疾病进进行早期行早期诊诊断的断的脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是属特异性抗原，具有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结有较强的免疫原性和免疫调节功能，可刺激机体产生相应的抗体，因而是结核病的血清学诊断应用较广的抗原。核病的血清学诊断应用较广的抗原。有关有关LAM抗原的应用报道很多抗原的应用报道很多,Antunes等用美国生产的结明等用美国生产的结明(MycoDot TM)试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为试剂盒检测活动性肺结核病人的敏感性为63.0%，特异性为，特异性为92.4%，认为检，认为检测测LAM抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。抗体是结核病一项有效的辅助诊断方法。10脂阿拉伯甘露聚糖脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原抗原 脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌细细A60(antigen 60)A60是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，是脂质蛋白和多是从牛分枝杆菌胞浆中提取的一种大分子物质，是脂质蛋白和多糖的复合抗原。糖的复合抗原。Wu等用等用ELISA法检测了法检测了178例活动性肺结核患者和例活动性肺结核患者和151例其他疾病患例其他疾病患者血清中的者血清中的IgG A60，根据受试者工作特性曲线，根据受试者工作特性曲线(ROC)取取261.2单位为单位为截切值截切值(cutoff point)，其敏感性和特异性分别为，其敏感性和特异性分别为49.4%和和79.5%，认，认为胸部为胸部X片异常的患者结合片异常的患者结合IgG A60阳性将有助于肺结核病的准确临阳性将有助于肺结核病的准确临床诊断。床诊断。11A60(antigen 60)A60是从牛分枝杆菌胞是从牛分枝杆菌胞浆浆中提中提结核菌糖脂(TBGL)抗原 结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质，具有菌属特异性。近年结核菌糖脂抗原是分枝杆菌细胞壁上的糖脂类物质，具有菌属特异性。近年来的研究表明，糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。来的研究表明，糖脂类抗原在诊断方面有很大的优势。Maekura等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法，并做了临床评价，对痰涂等建立了糖脂类抗原抗体快速检测方法，并做了临床评价，对痰涂片阴性的活动性肺结核的灵敏度为片阴性的活动性肺结核的灵敏度为56.8，对痰培养阴性的活动性肺结核的，对痰培养阴性的活动性肺结核的灵敏度为灵敏度为51.2。将。将TBGL及核酸扩增方法及核酸扩增方法(NAA)联合用于检测，检出率比联合用于检测，检出率比两者单独使用时进一步提高。两者单独使用时进一步提高。Tiwari等用脂质体颗粒作为载体，利用纯化的等用脂质体颗粒作为载体，利用纯化的TBGL抗原特异的及结核病患者血清中的抗原特异的及结核病患者血清中的TBGL抗体结合，形成蓝色凝集颗抗体结合，形成蓝色凝集颗粒来诊断活动性结核病，其敏感性、特异性分别达粒来诊断活动性结核病，其敏感性、特异性分别达94%和和98.3%。该方法快。该方法快速速(4min)、经济，且可以区别活动性肺结核、卡介苗、经济，且可以区别活动性肺结核、卡介苗(BCG)免疫接种者及健免疫接种者及健康人群，可用于人群大规模筛选肺结核病人。康人群，可用于人群大规模筛选肺结核病人。12结结核菌糖脂核菌糖脂(TBGL)抗原抗原 结结核菌糖脂抗原是分枝杆菌核菌糖脂抗原是分枝杆菌细细胞壁上胞壁上38kDa蛋白 38kDa蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表蛋白是一定位在质膜上的磷酸盐转运蛋白，只在分枝杆菌复合体中表达，达，BCG合成合成38kDa蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。蛋白的量仅为结核分枝杆菌的十分之一。38kDa 蛋白为一分泌蛋白，可刺激蛋白为一分泌蛋白，可刺激T细胞和细胞和B细胞免疫反应，广泛应用于结核细胞免疫反应，广泛应用于结核病的血清学试验。病的血清学试验。英国公司生产的英国公司生产的OMEGA结核抗体定量检测结核抗体定量检测Myco G、A、M试剂盒联合应用试剂盒联合应用38kDa和脂多糖和脂多糖(LPS)抗原，而抗原，而TB Complex Plus试剂盒选用的是试剂盒选用的是38kDa和和16kDa抗原。抗原。Butt等对等对OMEGA试剂盒进行了评价，认为具有种特异性的试剂盒进行了评价，认为具有种特异性的TB Complex Plus和有属特异性的和有属特异性的Myco M联合应用可取得最好的效果，检测肺联合应用可取得最好的效果，检测肺结核的敏感性和特异性分别为结核的敏感性和特异性分别为87%和和93%。38kDa对活动性肺结核的诊断非对活动性肺结核的诊断非常有效，但和大肠埃希菌同源蛋白有常有效，但和大肠埃希菌同源蛋白有 30%以上的交叉，所以对不同人群的灵以上的交叉，所以对不同人群的灵敏度波动较大，尤其对涂片阴性和合并敏度波动较大，尤其对涂片阴性和合并HIV感染的结核病患者效果较差。感染的结核病患者效果较差。1338kDa蛋白蛋白 38kDa蛋白是一定位在蛋白是一定位在质质膜上的磷酸膜上的磷酸盐转盐转运蛋运蛋Ag85 抗原85复合体(Ag85)是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白，分子量约是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白，分子量约为为3032kDa。分枝杆菌各菌株均可分泌。分枝杆菌各菌株均可分泌Ag85。结核分枝杆菌。结核分枝杆菌Ag85中至少包中至少包括三种蛋白成分括三种蛋白成分Ag85A、Ag85B和和Ag85C，其中有免疫作用的主要为，其中有免疫作用的主要为Ag85A和和Ag85B。Ag85具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥必具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥必要的作用。它还能和人纤连蛋白要的作用。它还能和人纤连蛋白(FN)相结合，有助于结核菌入侵宿主细胞。相结合，有助于结核菌入侵宿主细胞。Ag85可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的可能发展成为结核病的血清学诊断抗原。活动性结核病人血清中的Ag85抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高抗体平均水平比其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者高50150倍，可倍，可通过检测血循环中通过检测血循环中Ag85抗体，对活动性结核加以诊断。抗体，对活动性结核加以诊断。Kashyap等用间接等用间接ELISA法检测法检测89%疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在疑似结核性脑膜炎患者脑脊液中存在Ag85抗体，认为检测抗体，认为检测Ag85抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。抗体为结核性脑膜炎的早期和确定性诊断提供了一个更灵敏的选择。14Ag85 抗原抗原85复合体复合体(Ag85)是一是一组组具有具有较较强强细细胞免疫胞免疫ESAT-6和CFP10 ESAT-6即即6kDa早期分泌性抗原，是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯早期分泌性抗原，是从结核分枝杆菌短期培养滤液中分离纯化出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染化出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫回忆应答中起重要作用。的免疫回忆应答中起重要作用。ESAT-6仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型洲分枝杆菌以及苏尔加分枝杆菌、海水分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等非典型分枝杆菌，而分枝杆菌，而BCG及其他非致病性分枝杆菌缺失。及其他非致病性分枝杆菌缺失。CFP-10即培养滤液蛋白即培养滤液蛋白10，及，及ESAT-6位于同一基因簇上，两者分布相同，位于同一基因簇上，两者分布相同，都是都是RDl区编码的。区编码的。ESAT-6和和CFP10能刺激机体产生特异性能刺激机体产生特异性IgG，利用，利用ESAT-6和和CFP10蛋白抗原能及结核分枝杆菌感染者血中特异性蛋白抗原能及结核分枝杆菌感染者血中特异性 IgG结合的特结合的特点，采用点，采用ELISA等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种等方法可特异性区分是真正的结核分枝杆菌感染或是接种BCG后所致敏，该方法明显优于后所致敏，该方法明显优于PPD作包被抗原的作包被抗原的ELISA法。法。陈全等以陈全等以CFP10-ESAT-6融合蛋白为抗原，用融合蛋白为抗原，用ELISA法检测豚鼠血清中抗结法检测豚鼠血清中抗结核分枝杆菌抗体，核分枝杆菌抗体，11份份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应，感染豚鼠血清全部呈阳性反应，11 份份BCG免疫免疫豚鼠血清仅豚鼠血清仅1份呈阳性反应。份呈阳性反应。15ESAT-6和和CFP10 ESAT-6即即6kDa早期分泌性抗早期分泌性抗U1蛋白 Mukherjee等收集结核分枝杆菌等收集结核分枝杆菌H37Rv株静脉感染株静脉感染C57BL/6小鼠早期小鼠早期(1014d)尿尿液分离到一种结核抗原，氨基酸测序鉴定后，克隆并表达相应的基因，纯化得到液分离到一种结核抗原，氨基酸测序鉴定后，克隆并表达相应的基因，纯化得到可溶的重组蛋白命名为可溶的重组蛋白命名为U1蛋白蛋白(Urine Protein 1)，分子量大约为，分子量大约为16.8kDa。进一步用进一步用ELISA法检测肺结核病人血清中法检测肺结核病人血清中U1抗体的敏感性为抗体的敏感性为60%，检测合并，检测合并HIV感染的结核病患者其敏感性为感染的结核病患者其敏感性为 87%，而正常人血清不及，而正常人血清不及U1蛋白反应。将蛋白反应。将U1蛋白及蛋白及Mtb81联合用于检测合并联合用于检测合并HIV感染的结核病患者的敏感性为感染的结核病患者的敏感性为93.6%。同时检测了同时检测了12名名HIV感染的非结核病人，其中感染的非结核病人，其中9名患者血清中无可检测的名患者血清中无可检测的U1抗体，抗体，另外另外3名名U1抗体的水平处于抗体的水平处于ELISA法检测的临界点。因此认为，检测法检测的临界点。因此认为，检测U1抗体可增抗体可增加结核病血清学诊断的敏感性，尤其对合并加结核病血清学诊断的敏感性，尤其对合并HIV感染的结核病患者。感染的结核病患者。16U1蛋白蛋白 Mukherjee等收集等收集结结核分枝杆菌核分枝杆菌H37Rv株静株静其它抗原 Weldingh等在大肠埃希菌中克隆表达了等在大肠埃希菌中克隆表达了4种超抗原种超抗原TB9.7、TB15.3、TB16.3和和TB51，并用它们来检测痰涂片阳性和涂片阴性的结核病人，灵敏度为，并用它们来检测痰涂片阳性和涂片阴性的结核病人，灵敏度为36%93%，而特异性超过，而特异性超过97%，其中，其中TB16.3最为有效，最为有效，TB16.3及及TB9.7联合检联合检测合并测合并HIV感染的结核病患者其敏感性超过感染的结核病患者其敏感性超过85%。Bahk等基因重组表达等基因重组表达Rv3369和和Rv3874两个基因，并用它们做抗原检测结核两个基因，并用它们做抗原检测结核病患者的敏感性分别为病患者的敏感性分别为60%、74%,特异性分别为特异性分别为96%、97%，表明是有价值，表明是有价值的结核病血清学诊断抗原。的结核病血清学诊断抗原。其它抗原，如其它抗原，如MPT64、P90、TB4等，也曾被做为快速血清学检测的侯选抗等，也曾被做为快速血清学检测的侯选抗原加以研究，但大都未达到诊断灵敏度的要求。原加以研究，但大都未达到诊断灵敏度的要求。17其它抗原其它抗原 Weldingh等在大等在大肠肠埃希菌中克隆表达了埃希菌中克隆表达了4种超抗种超抗摘自：阳幼荣等结核分枝杆菌12 种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究结核分枝杆菌结核分枝杆菌12 种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究种抗原在结核病血清学诊断中应用价值的研究18摘自：阳幼荣等摘自：阳幼荣等结结核分枝杆菌核分枝杆菌12 种抗原在种抗原在结结核病血清学核病血清学诊诊断中断中1919l血清学诊断的关键是寻找灵敏度高、特异性强的理想抗原。但这方面的应用似乎并血清学诊断的关键是寻找灵敏度高、特异性强的理想抗原。但这方面的应用似乎并不理想。对于结核病的血清学诊断技术的研发，到现在已经有不理想。对于结核病的血清学诊断技术的研发，到现在已经有100多年的历史，但至今多年的历史，但至今还没有一种血清学诊断方法可以替代结核病痰涂片镜检。还没有一种血清学诊断方法可以替代结核病痰涂片镜检。lWHO对来自不同国家的对来自不同国家的19种试剂盒产品进行评估，结果表明：及痰培养相比，这些种试剂盒产品进行评估，结果表明：及痰培养相比，这些试剂盒检测的灵敏度为试剂盒检测的灵敏度为1%60%，特异度为，特异度为5399%1。原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果原因：由于所用的测定方法、使用的试剂种类或抗原、抗体的不同等，导致测定结果差异较大，并且缺乏可比性。差异较大，并且缺乏可比性。lWHO认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作认为现有的血清学诊断试剂的敏感度和特异度都有待进一步提高，不推荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用。为一种快速诊断的方法在临床使用。1WHO World Health Organization.Diagnosis evaluation series No.2:laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.血清学检测血清学检测20血清学血清学诊诊断的关断的关键键是是寻寻找灵敏度高、特异性找灵敏度高、特异性强强的理想抗原。但的理想抗原。但这这方面方面结核抗体测定存在的问题结核抗体测定存在的问题1.假阳性假阳性：3%15%。假阳性的发生原因：假阳性的发生原因：1)共同抗原所致的交叉反应；共同抗原所致的交叉反应；2)隐性结核菌感染包括初染、再染、非结核分支杆菌感染、隐性结核菌感染包括初染、再染、非结核分支杆菌感染、卡介苗接种、结核杆菌卡介苗接种、结核杆菌L型感染等，结果均可致结核抗体短型感染等，结果均可致结核抗体短期或较长时期的升高；期或较长时期的升高；3)实验操作实验操作/试剂质量。试剂质量。21结结核抗体核抗体测测定存在的定存在的问题问题1.假阳性：假阳性：3%15%。212.假阴性假阴性：30%2%。假阴性发生的假阴性发生的原因：原因：1)机体方面所致的假阴性：如某些临床确诊的活动性结核患者，而体液免疫测定结果则为机体方面所致的假阴性：如某些临床确诊的活动性结核患者，而体液免疫测定结果则为阴性，其原因可能及个体的免疫功能异常有关。上述原因均可导致机体不产生或仅产阴性，其原因可能及个体的免疫功能异常有关。上述原因均可导致机体不产生或仅产生少量特异性结核抗体，以致于无法及正常人群的结核抗体水平相区分。生少量特异性结核抗体，以致于无法及正常人群的结核抗体水平相区分。2)特异性免疫复合物的形成：由于活动性结核患者体内产生的特异性抗体，可及结核抗原特异性免疫复合物的形成：由于活动性结核患者体内产生的特异性抗体，可及结核抗原结合，形成免疫复合物，从而导致结核抗体测定为阴性。结合，形成免疫复合物，从而导致结核抗体测定为阴性。3)方法方面的因素所致的假阴性：如测定方法本身灵敏度不够、仪器不够灵敏和影响技术方法方面的因素所致的假阴性：如测定方法本身灵敏度不够、仪器不够灵敏和影响技术条件的各种因素均可导致假。条件的各种因素均可导致假。4)试剂质量和操作因素：试剂灵敏度偏低是造成假阴性的主要原因之一，操作人员的业务试剂质量和操作因素：试剂灵敏度偏低是造成假阴性的主要原因之一，操作人员的业务素质也是影响因素之一。素质也是影响因素之一。222.假阴性：假阴性：30%2%。22WHO不推荐血清学检测方法不推荐血清学检测方法诊断活动性结核病诊断活动性结核病2011年年WHO正式公告：正式公告：由于目前的商由于目前的商业血清学试剂在结核检测中存在较大差业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高比例的假阳性和假异，且检测结果很高比例的假阳性和假阴性，因此不建议使用血清学方法作为阴性，因此不建议使用血清学方法作为结核杆菌的诊断实验结核杆菌的诊断实验1。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis.http:/whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期诊断！容易漏诊、不能早期诊断！容易漏诊、误诊！误诊！23WHO不推荐血清学不推荐血清学检测检测方法方法2011年年WHO正式公告：由于目前正式公告：由于目前2012年年4月月16日，日，SFDA发布了发布了关于进一步加强结核病血液检测试关于进一步加强结核病血液检测试剂监管有关事宜的通知剂监管有关事宜的通知（食药监办械（食药监办械【2012】48号），要求各省、号），要求各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局按照通知要求对行政区域内有关自治区、直辖市食品药品监督管理局按照通知要求对行政区域内有关结核病血液检测试剂的注册审评情况开展检查，试图通过对国内生产结核病血液检测试剂的注册审评情况开展检查，试图通过对国内生产结核病诊断血清学制品的企业进行一次背景调查。结核病诊断血清学制品的企业进行一次背景调查。分析目前国内核病血清学检测试剂在生产过程质量控制和在临床评价分析目前国内核病血清学检测试剂在生产过程质量控制和在临床评价中存在的问题及解决问题的方法。中存在的问题及解决问题的方法。242012年年4月月16日，日，SFDA发发布了关于布了关于进进一步加一步加强强结结核病血核病血我国目前结核病血清学检测试剂的情况1.我国结核病血清学检测试剂现状我国结核病血清学检测试剂现状 市场上销售的结核病血清学诊断试剂有近百家，经国家食品药品市场上销售的结核病血清学诊断试剂有近百家，经国家食品药品监督管理局批准的国产诊断制品抗体检测试剂盒监督管理局批准的国产诊断制品抗体检测试剂盒29个，其中经国家级个，其中经国家级批准的批准的26个，省级批准的个，省级批准的1个，进口制品个，进口制品1个。抗原检测试剂盒个。抗原检测试剂盒3个，个，其中省级批准的其中省级批准的1个。个。大多数未经批准的结核病血清学诊断试剂游离于国家监管范围之大多数未经批准的结核病血清学诊断试剂游离于国家监管范围之外，值得引起国家有关部门及人员的关注及重视。外，值得引起国家有关部门及人员的关注及重视。25我国目前我国目前结结核病血清学核病血清学检测试剂检测试剂的情况的情况1.我国我国结结核病血清学核病血清学检测试检测试2.结核病血清学诊断试剂生产企业背景调查情况结核病血清学诊断试剂生产企业背景调查情况 调查资料的内容主要包括试剂盒背景资料、试剂盒成品检测、试剂盒检测参调查资料的内容主要包括试剂盒背景资料、试剂盒成品检测、试剂盒检测参考品制备及标化，参考品使用情况及临床研究等方面；考品制备及标化，参考品使用情况及临床研究等方面；通过对各生产企业报送的资料进行分析，共收回调查问卷通过对各生产企业报送的资料进行分析，共收回调查问卷29份份.我国目前结核我国目前结核病血清学诊断制品的品种及近病血清学诊断制品的品种及近3年的数量见下表年的数量见下表.由于无法掌握未经批准的结核病血清学诊断试剂的非法销售情况，结果并不由于无法掌握未经批准的结核病血清学诊断试剂的非法销售情况，结果并不能代表国内实际销售状况。能代表国内实际销售状况。262.结结核病血清学核病血清学诊诊断断试剂试剂生生产产企企业业背景背景调查调查情况情况26存在的问题：1.阳性参考品的选择阳性参考品的选择 多数企业在阳性参考品选择时通常只选择菌阳患者抗体强阳性血清，如果多数企业在阳性参考品选择时通常只选择菌阳患者抗体强阳性血清，如果试剂某批次质量出现问题，敏感度偏低时，若阳性参考品中全部使用强阳性试剂某批次质量出现问题，敏感度偏低时，若阳性参考品中全部使用强阳性血清，所有阳性参考品反应均呈阳性，则无法反映该试剂的真实敏感度。如血清，所有阳性参考品反应均呈阳性，则无法反映该试剂的真实敏感度。如标准品中有弱阳性血清的反应可能呈阴性，提示试剂敏感度可能存在问题。标准品中有弱阳性血清的反应可能呈阴性，提示试剂敏感度可能存在问题。因此，血清学抗体检测试剂在质量控制中需要强、中、弱三种不同效价的血因此，血清学抗体检测试剂在质量控制中需要强、中、弱三种不同效价的血清用于敏感度的质量控制。同理，在试剂制备过程出现问题，可能产生假阳清用于敏感度的质量控制。同理，在试剂制备过程出现问题，可能产生假阳性时。如果阴性参考血清都选择本底极低的样品，可能无法检出，因此阴性性时。如果阴性参考血清都选择本底极低的样品，可能无法检出，因此阴性参考品应含有临界阴性参考血清。参考品应含有临界阴性参考血清。27存在的存在的问题问题：1.阳性参考品的阳性参考品的选择选择272.参考品的标化参考品的标化为获得阳性及阴性不同效价的血清，获得血清后应先进行初筛，再用不同的为获得阳性及阴性不同效价的血清，获得血清后应先进行初筛，再用不同的方法学对血清进行效价标定，确定血清的效价，从中选择不同反应强度的样方法学对血清进行效价标定，确定血清的效价，从中选择不同反应强度的样本，作为阳性或阴性参考品。但多数企业未进行细致的效价标化，通常以试本，作为阳性或阴性参考品。但多数企业未进行细致的效价标化，通常以试剂盒筛选后就作为检测参考品。剂盒筛选后就作为检测参考品。标准品的建立应有规范的操作细则，至少样品采集、检测及标化的过程中所标准品的建立应有规范的操作细则，至少样品采集、检测及标化的过程中所有的实验操作均需先制定有的实验操作均需先制定SOP，再，再 严严 格格 遵遵 循循SOP进行操作，并有对应的原进行操作，并有对应的原始记录。从已收到的资料来看，多数企业存在不足之处始记录。从已收到的资料来看，多数企业存在不足之处。282.参考品的参考品的标标化化283.参考品的制备参考品的制备结核病体外诊断试剂参考品通常由阳性参考品、阴性参考品、最低检出量或结核病体外诊断试剂参考品通常由阳性参考品、阴性参考品、最低检出量或最低检出限参考品和精密性或重复性参考品组成，用来控制试剂盒的敏感度、最低检出限参考品和精密性或重复性参考品组成，用来控制试剂盒的敏感度、特异度、检出限和精密度等。但部分试剂厂家仅有阳性及阴性检测参考品。特异度、检出限和精密度等。但部分试剂厂家仅有阳性及阴性检测参考品。由于参考品用于体外诊断试剂质量控制，所以参考物质原料的选择取决于诊由于参考品用于体外诊断试剂质量控制，所以参考物质原料的选择取决于诊断试剂的预期用途。原料应及试剂盒的使用要求相一致或尽可能接近，这样断试剂的预期用途。原料应及试剂盒的使用要求相一致或尽可能接近，这样可以消除方法基体效应引入的系统误差，阳性参考品应包括痰菌阴性和痰菌可以消除方法基体效应引入的系统误差，阳性参考品应包括痰菌阴性和痰菌阳性患者的血清，但个别企业仅采用采血站筛选的抗体阳性血清作为阳性参阳性患者的血清，但个别企业仅采用采血站筛选的抗体阳性血清作为阳性参考品。考品。293.参考品的制参考品的制备备294.参考品的稳定性参考品的稳定性参考物质的均一性和稳定性：参考物质的均一性和稳定性：均一性可保证一批原料所制备的参考品均匀一致，即在不同空间检测结果的一致性和均一性可保证一批原料所制备的参考品均匀一致，即在不同空间检测结果的一致性和可比性；可比性；稳定性可使一批参考品长期分发使用，为企业或科研院所提供用于质量评价的参考品，稳定性可使一批参考品长期分发使用，为企业或科研院所提供用于质量评价的参考品，保证在不同时间检测结果的一致性和可比性。稳定性考察一般需要观察在不同温度下保证在不同时间检测结果的一致性和可比性。稳定性考察一般需要观察在不同温度下放置不同时间，或经过反复冻融后，观察效价降低的情况。通过测定不同温度，不同放置不同时间，或经过反复冻融后，观察效价降低的情况。通过测定不同温度，不同冻融次数时特征活性的降低速率，从而确定贮存的适宜温度和时间，或反复冻融的次冻融次数时特征活性的降低速率，从而确定贮存的适宜温度和时间，或反复冻融的次数。数。304.参考品的参考品的稳稳定性定性30临床检验中发现的问题：1.敏感度及特异度虚高敏感度及特异度虚高WHO评估结果显示，市售不同厂家的血液（血清学诊断）试剂的敏感度和特评估结果显示，市售不同厂家的血液（血清学诊断）试剂的敏感度和特异度变化很大，敏感度变化范围为异度变化很大，敏感度变化范围为0100%，特异度变化范围为，特异度变化范围为31100%。根据收集的各企业临床资料显示，我国血液诊断试剂的敏感度平均值为根据收集的各企业临床资料显示，我国血液诊断试剂的敏感度平均值为80%左右，高于左右，高于70%的占的占79%；特异度平均值为；特异度平均值为92%，高于，高于90%的占的占95%。2.临床评价仅采用及同类制品进行比较评价的缺陷临床评价仅采用及同类制品进行比较评价的缺陷 部分企部分企 业业 根根 据据 体体 外外 诊诊 断断 试试 剂剂 临临 床床 研研 究究 技技 术术 指指 导导 原则原则，“已已有同品种批准上市有同品种批准上市”品的临床研究可采用已批准上市品的临床研究可采用已批准上市质量较好的产品作为对质量较好的产品作为对比试剂，进行对比试验研究。比试剂，进行对比试验研究。3.临床研究的规范性临床研究的规范性 多数未规范进行临床研究，不能随机入选客观评价，数据经处理修改痕多数未规范进行临床研究，不能随机入选客观评价，数据经处理修改痕迹明显，这是导致临床研究的特异度及敏感度不真实的主要因素。迹明显，这是导致临床研究的特异度及敏感度不真实的主要因素。31临临床床检验检验中中发现发现的的问题问题：1.敏感度及特异度虚高敏感度及特异度虚高3132/45近期结核病诊断方法的相关研究近期结核病诊断方法的相关研究JID 2012:205(Suppl 2),S147.32近期近期结结核病核病诊诊断方法的相关研究断方法的相关研究JID 2012:205(Su结核感染者体内存在特异的效应结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应由于效应T细胞细胞存活时间很短存活时间很短，而且，而且具有特异性具有特异性，因此可以作为机体是否正处，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于基于IGRA原理的产品目前已被原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中。目前应用的进口目前应用的进口IGRA主要有两种商品化的试剂主要有两种商品化的试剂：1）澳大利亚澳大利亚Cellestis公司的公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tube（QFT-GIT）2）英国英国Oxford Immunotec公司的公司的T-SPOT.TB蛋白水平分子诊断:-干扰素释放实验（干扰素释放实验（IGRA)33结结核感染者体内存在特异的效核感染者体内存在特异的效应应T淋巴淋巴细细胞，效胞，效应应T淋巴淋巴细细胞再次受胞再次受-干扰素释放实验（干扰素释放实验（IGRA）干扰素干扰素检测阴性检测阴性干扰素干扰素检测阳性检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素34-干干扰扰素素释释放放实验实验（IGRA）干干扰扰素素干干扰扰素素TB抗原多抗原多肽肽T-SPOT.TB原理原理T-SPOT.TB是以拥有专利的特异抗原（是以拥有专利的特异抗原（ESAT-6/CFP-10），通过酶联免），通过酶联免疫斑点技术（疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）的新方法。结核杆菌特异抗原：结核杆菌特异抗原：早期分泌抗原靶早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培养滤液蛋白培养滤液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）35T-SPOT.TB原理原理T-SPOT.TB是以是以拥拥有有专专利的特利的特结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区ESAT-6及及CFP-10抗原抗原36结结核杆菌特异抗原由核杆菌特异抗原由结结核杆菌基因核杆菌基因组组RD1区相同的操区相同的操纵纵子子编码编码的蛋的蛋结核杆菌特异抗原结核杆菌特异抗原苏氏海堪萨斯戈登牛非洲37结结核杆菌特异抗原核杆菌特异抗原苏苏氏海堪氏海堪萨萨斯戈登牛非洲斯戈登牛非洲37酶联免疫斑点技术酶联免疫斑点技术结合了细胞培养技术及酶联免疫吸附技术（即结合了细胞培养技术及酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），技术），能够在能够在单细胞水平单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，检测细胞因子的分泌情况，灵敏度高灵敏度高。38酶酶联联免疫斑点技免疫斑点技术结术结合了合了细细胞培养技胞培养技术术及及酶酶联联免疫吸附技免疫吸附技术术（即（即EL准确准确T-SPOT.TB临床性能指标临床性能指标 特异性特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，及绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306)国内临床数据：特异性94.1%(478/508)灵敏度灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)39准确准确T-SPOT.TB临临床性能指床性能指标标 特异性特异性39灵灵 敏敏 度度ReferenceSensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0%(12/12)Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3%(20/24)Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6%(84/87)Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91.3%(21/23)Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9%(70/73)Kang et al Chest.2007 Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3%(57/58)Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90.0%(27/30)Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9%(26/28)Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-70392.9%(26/28)Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56*80.8%(80/99)Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71*85.7%(36/42)Chee et al J Clin Microbiol.2008 Apr 9*94.1%(254/270)Vincenti et al Clin Exp Immunol.2007 Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-887.2%(34/39)Losi et al Eur Respir J.2007 Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259100.0%(22/22)Connell et al PLoS ONE 2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashi et al.Scand J Infect Dis 2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashi et al.J Infect.2008 Epub ahead of print.*90.0%(36/40)Domnguez et al.Diagn Microbiol Infect Dis.2008.*Epub ahead of print84.2%(32/38)Goletti et al.PLoS ONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshard et al.Respir Med.2008.Epub ahead of print98.4%(62/63)Higuchi Med Microbiol Immunol.2008.Epub ahead of print*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)40灵灵 敏敏 度度ReferenceSensitivity Jaf特特 异异 性性41特特 异异 性性41可信可信 T-SPOT.TB国外指南国外指南T-SPOT.TB是采用是采用-干扰素释放试验（干扰素释放试验（IGRA）原理，获得美国）原理，获得美国FDA认证、欧盟认证、欧盟CE认证和中国认证和中国SFDA认证的唯一商业化产品认证的唯一商业化产品列入美国、英国等欧美列入美国、英国等欧美25个国家结核诊疗指南个国家结核诊疗指南 2011年英国NICE指南、2010年美国最新结核诊疗指南、2010年加拿大结核指南美国美国CDC推荐推荐卡介苗（卡介苗（BCG）接种人群结核感染检测首选）接种人群结核感染检测首选42可信可信 T-SPOT.TB国外指南国外指南T-SPOT.TB是采是采各国对潜伏感染风险人群的筛查指南各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群风险人群美国指南美国指南加拿大指南加拿大指南英国指南英国指南免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用强的松或TNF-抑制剂治疗）TST或IGRA；如果是阴性或高度怀疑的，TST和IGRA都要检查TST，如果TST阴性要用IGRA确认TST或IGRABCG接种者（如果也属于其它风险人群）推荐用IGRA没有特定的推荐TST或IGRA及传染性肺结核患者密切接触TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性医务工作者TST或IGRA推荐用TSTTST或IGRA，视情况而定无法再来确认TST结果的人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）推荐用IGRA没有特定的推荐推荐用IGRA国外出生的人群只筛查过去5年内移民的人群；TST或者IGRA只筛查过去2年内小于15岁的移民；TST，用IGRA进一步确认TST阳性只筛查新移民；TST筛查5至15岁移民，用IGRA进一步确认TST阳性；IGRA筛查16至35岁移民其它风险人群TST或IGRATST，用IGRA进一步确认TST阳性TST，用IGRA进一步确认TST阳性43各国各国对对潜伏感染潜伏感染风险风险人群的人群的筛查筛查指南指南风险风险人群美国指南加拿大指南英人群美国指南加拿大指南英快速快速T-SPOT.TB的实验步骤的实验步骤用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌-干扰素效应T淋巴细胞分泌的-干扰素及膜板预包被的抗-干扰素抗体结合并固定在细胞周围1个斑点=1个效应T细胞加入显色液，观察结果过夜孵育，洗板，加入酶标二抗44快速快速T-SPOT.TB的的实验实验步步骤骤用用BD CPT 管或管或Fi快速快速实验效果图实验效果图阴性阴性结果果阳性阳性结果果空白空白对对照照抗原抗原AESAT-6抗原抗原BCFP10阳性阳性对对照照（PHA）45快速快速实验实验效果效果图图阴性阴性结结果阳性果阳性结结果空白果空白对对照照45方法学的方法学的优点优点检测特异性的提高帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引起的“假阳性”，避免了临床的无效用药检测灵敏度的提高有利于临床对结核病的早发现、早治疗，避免了疾病的传播及扩散快速48小时出结果46方法学的方法学的优优点点检测检测特异性的提高特异性的提高46方法学的方法学的局限局限不能区分活动性TB及潜伏感染不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者检测收费高（800元/次）47方法学的局限不能区分活方法学的局限不能区分活动动性性TB及潜伏感染及潜伏感染47实验结果解释实验结果解释 阴性结果阴性结果提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。假阴性结细胞。假阴性结果：果：感染阶段不同；感染阶段不同；少数免疫系统功能不全少数免疫系统功能不全/疾病；疾病；实验非正实验非正常操作。常操作。阳性结果阳性结果提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结细胞，患者存在结核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果：指标综合判断。假阳性结果：4种环境分枝杆菌感染时：种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、（苏氏）、M.marinum（海）、（海）、M.gordonae（戈登）（戈登）48实验结实验结果解果解释释 阴性阴性结结果果48假阴性假阴性/假阳性结果的原因分析假阳性结果的原因分析假阴性结果分析：假阴性结果分析：方法学局限性方法学局限性受试者因素：免疫力受试者因素：免疫力实验：人员、设备问题实验：人员、设备问题假阳性结果分析：假阳性结果分析：判断标准判断标准环境分枝杆菌感染环境分枝杆菌感染实验污染实验污染49假阴性假阴性/假阳性假阳性结结果的原因分析假阴性果的原因分析假阴性结结果分析：果分析：49武汉武汉海吉力公司开发的结核杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒是准海吉力公司开发的结核杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒是准确、快速诊断结核感染的新结核诊断方法和技术确、快速诊断结核感染的新结核诊断方法和技术HGN-IGRA.TB二项专利授权二项专利授权1、一种诊断结核病的检测试剂盒、一种诊断结核病的检测试剂盒授权公告号授权公告号 CN 102175875 B2、全血、全血INF-的特异性抗原蛋白、其制备方法及用的特异性抗原蛋白、其制备方法及用途途授权公告号授权公告号 CN 102174114 B50武武汉汉海吉力公司开海吉力公司开发发的的结结核杆菌特异性核杆菌特异性细细胞免疫反胞免疫反应检测试剂应检测试剂盒是盒是第一天：体外全血刺激第一天：体外全血刺激第二天：第二天：ELISA定量检测定量检测IFN-含量含量HGN-IGRA.TBHGN-IGRA.TB操作流程概况操作流程概况51第一天：体外全血刺激第二天：第一天：体外全血刺激第二天：ELISA定量定量检测检测IFN-含量含量1.现现有有的的血血清清学学诊诊断断试试剂剂的的厂厂家家良良莠莠不不齐齐，试试剂剂的的敏敏感感度度和和特特异异度度都都有有待待进进一一步步提提高高，不不推推荐荐其作为一种快速诊断的方法在临床使用；其作为一种快速诊断的方法在临床使用；2.结结核核感感染染T细细胞胞检检测测（IGRA/TSPOT）是是目目前前MTB感染最好的筛查手段。感染最好的筛查手段。3.临床医生谨慎对待结核抗体阳性患者!小 结521.现现有的血清学有的血清学诊诊断断试剂试剂的厂家良莠不的厂家良莠不齐齐，试剂试剂的敏感度和特异度的敏感度和特异度感感 谢 聆聆 听！听！53感感 谢谢 聆聆 听！听！53谢谢大家！结结 语语谢谢谢谢大家！大家！结结 语语