第九章-PCR技术及其在医学上的应用课件

第九章 PCR技术及其在医学上的应用第九章 PCR技术及其1The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael Smith1944-1932-2000La Jolla,CA,USA Kary B.Mullis University of British Columbia Vancouver,Canada for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based,site-directed mutagenesis and its development for protein studiesThe Nobel Prize in Physiology 2一、一、PCR基本原理基本原理DNA模板模板变性变性：95左右高温变性左右高温变性单链单链DNA模板与引物模板与引物退火退火：引物与模：引物与模板形成复合物的几率板形成复合物的几率DNA分子自身分子自身的复性的复性引物的引物的延伸延伸一个一个PCR循环循环即即“变性变性退火退火延伸延伸”经过经过30个左右的循环后，个左右的循环后，PCR的扩增的扩增倍数为倍数为(1+x)n,x=75%,n为循环数为循环数第一第一节 PCR原理与特点原理与特点一、PCR基本原理DNA模板变性：95左右高温变性第一节 3BABBABAABABABABA靶序列靶序列未扩增的未扩增的DNA循环循环1变性变性退火退火延伸延伸循环循环2变性、退火变性、退火延伸延伸A上游引物上游引物B下下游引物游引物PCR示意图示意图5 端是人工合成的引物，端是人工合成的引物，是特定的，是特定的，3 端没有固端没有固定的定的终止点止点特定的的特定的的扩增增产物在物在第第2个循个循环中出中出现，以，以后快速后快速扩增，成增，成为主主要要扩增增产物物BABBABAABABABABA靶序列未扩增的DNA循环1变4BBAABABAABBABAABBABBAABABABA循环循环3变性、退火变性、退火延伸延伸n个循个循环后，后，5 端是端是特定的人工合成的引特定的人工合成的引物，物，3 端没有固定的端没有固定的终止点的止点的DNA链扩增量增量为2n。BBAABABAABBABAABBABBAABABABA循环5Taq聚合酶的性能聚合酶的性能模板模板DNA的拷贝数的拷贝数底物底物dNTP浓度浓度其他多种因素其他多种因素30个循环后出现个循环后出现“平台效应平台效应”平台效应出现的早晚取决于：平台效应出现的早晚取决于：Taq聚合酶的性能30个循环后出现“平台效应”6二、二、PCR技术的特点技术的特点高度的敏感性：高度的敏感性：是最主要的特点，是最主要的特点，25个个循环可扩增循环可扩增106倍，它可对单拷贝、单根倍，它可对单拷贝、单根头发、一滴血等微量标本进行分析头发、一滴血等微量标本进行分析高度的特异性：高度的特异性：取决于取决于2个引物设计的个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性，好坏，依赖于引物与模板结合的正确性，退火温度退火温度操作简便、快捷操作简便、快捷适用样品的广泛性适用样品的广泛性二、PCR技术的特点高度的敏感性：是最主要的特点，25个循环7第二第二节 PCR系系统的的组成成及及PCR最适条件最适条件耐热耐热DNA聚合酶聚合酶寡核苷酸引物寡核苷酸引物dNTPPCR反应缓冲液反应缓冲液模板模板DNAPCR循环数循环数易发生的问题及解决方法易发生的问题及解决方法第二节 PCR系统的组成及PCR最适条件耐热DNA聚合8一、耐热一、耐热DNA聚合酶聚合酶必需金属离子必需金属离子 Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+3 5 外切活性外切活性 5 3 外切活性外切活性 逆转录活性逆转录活性 (Mn2+)(Mn2+)未定未定 未定未定耐受耐受100 该酶的出现使该酶的出现使PCR操作大大简化，克服了操作大大简化，克服了以前每一循环反复加以前每一循环反复加Klenow酶的缺点酶的缺点各种耐各种耐热DNA聚合聚合酶的特性的特性Taq Tth VENT Sac一、耐热DNA聚合酶必需金属离子 Mg2+9Taq DNA聚合酶的种类聚合酶的种类天然酶天然酶-嗜热水生菌分离纯化嗜热水生菌分离纯化基因工程酶基因工程酶-Amlpi TaqTM5 3 DNA聚合酶聚合酶在在Mn2+存在下，存在下，逆转录酶逆转录酶活性最佳活性最佳有有5 3 外切酶外切酶活性活性无无3 5 外切酶活性，外切酶活性，无无校正功能校正功能PCR产物末端加产物末端加1个非模板依赖性碱基，个非模板依赖性碱基，优先为优先为A，是，是TA克隆克隆的基础的基础Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性Taq DNA聚合酶的种类天然酶-嗜热水生菌分离纯化5 10TA克隆定克隆定义 利用嗜热聚合酶如利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性赖性末端转移酶活性(在在7075活性高活性高)，使，使PCR产物的产物的3末端加一个末端加一个A的粘性的粘性端，将其直接克隆至端，将其直接克隆至3粘性末端含一个粘性末端含一个T的线性克隆载体中的线性克隆载体中.35T载体体35载体体T3535AAPCR产物物TA克隆定义 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖11TA克隆方法克隆方法(一步一步PCR克隆克隆)PCR扩增+335PCR产物物AA5T载体体TT5533连接接转化化蓝白白筛选校正聚合酶校正聚合酶平端平端PCR产物产物Taq酶酶dATPTA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+335PCR12二、寡核苷酸引物二、寡核苷酸引物引物长度在引物长度在1530个碱基，人基因组有个碱基，人基因组有3109bp，19mer引物：引物：419 1011中重复中重复1次次.引物的碱基的分布是随机的引物的碱基的分布是随机的,避免避免5个以上的嘌啶个以上的嘌啶和嘧啶的连续排列和嘧啶的连续排列,尤其尤其3 不应有连续不应有连续3个个G或或C避免两引物间的互补避免两引物间的互补,特别是特别是3 端端引物自身不应有连续超过引物自身不应有连续超过3个个bp的互补序列的互补序列引物的引物的3 端不能有任何修饰端不能有任何修饰,3 决定产物的特异性决定产物的特异性引物的引物的5 端限定端限定PCR产物的长度产物的长度,5 端可进行修饰端可进行修饰引物与非扩增序列同源性应引物与非扩增序列同源性应70%或或连续连续8个互补个互补扩增编码区中扩增编码区中,引物引物3 端不要终止于密码子的第端不要终止于密码子的第3位位引物的设计直接关系到引物的设计直接关系到PCR的特异性与成败的特异性与成败引物的设计原则引物的设计原则-现有引物设计程序或软件现有引物设计程序或软件二、寡核苷酸引物引物长度在1530个碱基，人基因组有3113PCR反应引物的常用浓度范围反应引物的常用浓度范围 PCR反应中引物的浓度是反应中引物的浓度是1mol/L 在在100l中引物的量为中引物的量为25100 pmol,假如用假如用25mol/L浓度的引物贮备液只需浓度的引物贮备液只需加加1 4lPCR反应引物的常用浓度范围 PCR反应中引物的浓度是14三、三、dNTPdNTP是是dATP，dCTP，dGTP，dTTP的总称的总称dNTP在在50次循环中是稳定的次循环中是稳定的dNTP在在PCR中的常用浓度是中的常用浓度是20200mol/L试剂公司已将其试剂公司已将其pH调至调至7.0 要避免反复冻融要避免反复冻融,分装冻存于分装冻存于-20每种贮存液浓度为每种贮存液浓度为5 10mmol/L,一般为一般为10 mmol/L,4种合并后浓度即为种合并后浓度即为2.5 mmol/L100l的的PCR反应中反应中,假如用各假如用各2.5 mmol/L浓浓度的度的dNTP混合液贮备液只需加混合液贮备液只需加8l注意注意Mg2+浓度与浓度与dNTP浓度之间的关系浓度之间的关系三、dNTPdNTP是dATP，dCTP，dGTP，dTTP15四、四、PCR反应缓冲液反应缓冲液Tris-Cl（pH8.8)KCl(50mmol/L)或或(NH4)2SO4(25mmol/L):促使引物退火促使引物退火MgCl2(25mmol/L):影响酶活与精确度影响酶活与精确度,产产物的特异性物的特异性明胶明胶(5%)或或BSA或或Tween-20:稳定酶活性稳定酶活性甲酰胺甲酰胺(5%):使引物与模板特异性配对使引物与模板特异性配对四、PCR反应缓冲液Tris-Cl（pH8.8)16五、模板五、模板DNA来源来源：广泛：广泛要求要求：待扩增部分需部分纯化：待扩增部分需部分纯化用量用量：ng的量克隆的量克隆DNA，g水平的染色体水平的染色体DNA抽提方法抽提方法：简单的水煮沸法：简单的水煮沸法 去垢剂裂解细胞去垢剂裂解细胞蛋白酶消化蛋白蛋白酶消化蛋白有机溶剂有机溶剂抽提抽提乙醇沉淀核酸乙醇沉淀核酸扩增产物长度扩增产物长度：检测性的长度一般为：检测性的长度一般为500bp(100 300bp为好为好)；克隆片段则不受此影响；克隆片段则不受此影响五、模板DNA来源：广泛17六、六、PCR循环数循环数其他参数选定后其他参数选定后,PCR循环数循环数主要取决于主要取决于模板模板DNA的浓度的浓度PCR循环数一般为循环数一般为25 30六、PCR循环数其他参数选定后,PCR循环数主要取决于模板18七、易发生的问题及解决方法易发生的问题及解决方法假阴性假阴性假阳性假阳性PCR产物呈片状产物呈片状非特异性扩增非特异性扩增易发生的问题易发生的问题七、易发生的问题及解决方法假阴性易发生的问题19假阴性假阴性是否加入是否加入Taq聚合酶，酶活性如何？聚合酶，酶活性如何？DNA解链是否充分，解链是否充分，PCR仪在变性仪在变性可否达到解链温度可否达到解链温度样品中有酶抑制剂，样品中有酶抑制剂，95，10min使用多组分引物，作双重使用多组分引物，作双重PCR解决方法解决方法假阴性是否加入Taq聚合酶，酶活性如何？解决方法20假阳性假阳性设立阴性对照、空白对照设立阴性对照、空白对照避免操作污染避免操作污染避免阳性对照以检测样品的污染避免阳性对照以检测样品的污染解决方法解决方法假阳性设立阴性对照、空白对照解决方法21PCR产物呈片状产物呈片状减少聚合酶浓度减少聚合酶浓度增加退火温度增加退火温度减少循环数减少循环数解决方法解决方法PCR产物呈片状减少聚合酶浓度解决方法22非特异性扩增非特异性扩增增加退火温度，减少退火时间及延增加退火温度，减少退火时间及延伸时间伸时间降低引物与聚合酶浓度降低引物与聚合酶浓度改变改变Mg2+的浓度的浓度解决方法解决方法非特异性扩增增加退火温度，减少退火时间及延伸时间解决方法23第三节第三节 PCR技术的发展技术的发展外源基因的分离外源基因的分离基因重组基因重组DNA测序测序构建克隆或表达载体构建克隆或表达载体定点突变定点突变检测某基因的多态性检测某基因的多态性转座子插入位点绘图转座子插入位点绘图检测基因修饰检测基因修饰PCR及其衍生技及其衍生技术的的应用用第三节 PCR技术的发展外源基因的分离PCR及其衍生技术的24TA克隆定克隆定义 利用嗜热利用嗜热DNA聚合酶如聚合酶如Taq DNA聚合酶聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性的模板非依赖性末端转移酶活性(在在7075活性高活性高)，使，使PCR产物的产物的3末端加一末端加一个个A的粘性端，将其直接克隆至的粘性端，将其直接克隆至3粘性末粘性末端含一个端含一个T的线性克隆载体中的线性克隆载体中.35T载体体35载体体T3535AAPCR产物物TA克隆定义 利用嗜热DNA聚合酶如Taq DNA聚合25TA克隆方法克隆方法(一步一步PCR克隆克隆)PCR扩增+335PCR产物物AA5T载体体TT5533连接接转化化蓝白白筛选校正聚合酶校正聚合酶平端平端PCR产物产物Taq酶酶dATPTA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+335PCR26PCR克隆技术克隆技术PCR直接测序技术直接测序技术定量定量PCRPCR体外定点突变体外定点突变PCR与突变的分子与突变的分子水平分析水平分析修饰修饰PCR不对称不对称PCR反转录反转录PCR通用引物通用引物PCR套式套式PCRPCR及其衍生技及其衍生技术的种的种类单一特异性引物单一特异性引物PCR随机引物随机引物PCR倒向倒向PCR免疫免疫PCR碱基替代碱基替代PCR锚式锚式PCRmRNA差别显示差别显示原位原位PCR膜结合膜结合PCR简并引物简并引物PCRPCR克隆技术PCR及其衍生技术的种类单一特异性引物PCR27第四节第四节 PCR技术在医学上的应用技术在医学上的应用感染性疾病病原体的诊断和研究感染性疾病病原体的诊断和研究遗传病相关基因的检测遗传病相关基因的检测恶性肿瘤的诊断和研究恶性肿瘤的诊断和研究法医学研究法医学研究在骨髓移植配型中的应用在骨髓移植配型中的应用第四节 PCR技术在医学上的应用感染性疾病病原体的诊断和研28一、感染性疾病病原体的诊断和研究一、感染性疾病病原体的诊断和研究对形态和生化反应不典型的微生物病原对形态和生化反应不典型的微生物病原体的鉴定体的鉴定解决混合标本问题解决混合标本问题生长缓慢或难于培养的病原体的鉴定生长缓慢或难于培养的病原体的鉴定难于鉴定的病原体诊断难于鉴定的病原体诊断HIVHCV与与HEVHPV结核杆菌结核杆菌其他病原微生物其他病原微生物鉴定新病毒鉴定新病毒一、感染性疾病病原体的诊断和研究对形态和生化反应不典型的微生29二、遗传病相关基因的检测二、遗传病相关基因的检测巴氏水肿胎儿的产前诊断巴氏水肿胎儿的产前诊断镰形细胞贫血镰形细胞贫血杜氏营养不良症（杜氏营养不良症（DMD）甲型血友病甲型血友病胎儿性别鉴定胎儿性别鉴定二、遗传病相关基因的检测巴氏水肿胎儿的产前诊断30巴氏水肿胎儿综合征巴氏水肿胎儿综合征-地中海贫血中最严重的一种。地中海贫血中最严重的一种。4个个-珠蛋白基因全部缺失（珠蛋白基因全部缺失（1条染条染色体应有色体应有2个珠蛋白基因），个珠蛋白基因），-珠蛋珠蛋白形成白形成4，即，即Hb Barts，对氧亲和力，对氧亲和力极高，常致胎儿窒息死亡。极高，常致胎儿窒息死亡。广东、广西多发广东、广西多发巴氏水肿胎儿综合征-地中海贫血中最严重的一种。31巴氏水肿胎儿的产前诊断巴氏水肿胎儿的产前诊断设计设计1对引物对引物PCR扩增扩增-珠蛋白基因珠蛋白基因。同时增加同时增加1对引物扩增对引物扩增-珠蛋白基因珠蛋白基因作作内对照内对照正常胎儿正常胎儿可扩增出可扩增出136bp片段片段巴氏水肿胎儿巴氏水肿胎儿不能扩增不能扩增136bp片段片段巴氏水肿胎儿的产前诊断设计1对引物PCR扩增-珠蛋白基因。32镰形细胞贫血镰形细胞贫血原因：原因：-珠蛋白链第珠蛋白链第6位的位的GAGGTG，造，造成成GluVal所致。所致。设计一对引物设计一对引物PCR扩增可得扩增可得294bp，Oxa NI消化，电泳消化，电泳294191103bpAA：正常人：正常人BB：纯合子病人：纯合子病人CC：杂合子病人：杂合子病人镰形细胞贫血原因：-珠蛋白链第6位的GAGGTG，造成G33杜氏营养不良症杜氏营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD）男性常见的致死性男性常见的致死性X性连锁隐性遗传病性连锁隐性遗传病以往检测基因缺陷方法以往检测基因缺陷方法：Southern 印迹杂交印迹杂交缺点：缺点：须用须用10余种探针，操作费时，同位素余种探针，操作费时，同位素用量大，所需用量大，所需 DNA量多，难于适应产前诊量多，难于适应产前诊断的要求断的要求PCR方法：方法：设计设计9对引物，用于扩增对引物，用于扩增9个易缺个易缺失区，一次失区，一次PCR同时扩增，某个片段无扩增同时扩增，某个片段无扩增则说明该段外显子缺失。针对可疑的男性胎则说明该段外显子缺失。针对可疑的男性胎儿进行儿进行DNA检测。检测。优点：优点：方法简单，快速，便于临床使用。方法简单，快速，便于临床使用。杜氏营养不良症（Duchenne muscular dys34甲型血友病甲型血友病最常见最常见的遗传病凝血功能障碍所致的出的遗传病凝血功能障碍所致的出血性疾病，为血性疾病，为X性连锁隐性遗传病性连锁隐性遗传病，是，是F基因缺陷基因缺陷所致所致临床无满意治疗措施，临床无满意治疗措施，检出携带者及产检出携带者及产前诊断，前诊断，防止婴儿出生是降低发病率的防止婴儿出生是降低发病率的主要措施。主要措施。首先明确胎儿性别首先明确胎儿性别，女性不必作基因诊，女性不必作基因诊断，断，男性可作下列男性可作下列PCR检测检测甲型血友病最常见的遗传病凝血功能障碍所致的出血性疾病，为X性35甲型血友病甲型血友病PCR方法：方法：设计设计1对引物，扩增对引物，扩增F 第第18外显子内外显子内142bp，内含，内含Bcl I。1429943bpAA：正常胎儿：正常胎儿BB：男性有病胎儿：男性有病胎儿PCR产物的物的Bcl I酶切后切后电泳泳结果果甲型血友病PCR方法：设计1对引物，扩增F 第18外显子内36胎儿性别鉴定胎儿性别鉴定预防性连锁遗传病胎儿的出生预防性连锁遗传病胎儿的出生应用应用切不可滥用，切不可滥用，以免导致胎儿出生性别比例失调！以免导致胎儿出生性别比例失调！性连锁遗传病的分析性连锁遗传病的分析法医学的个人鉴定（如犯罪人员）法医学的个人鉴定（如犯罪人员）性器官发育异常的基因检测（包括一些运动员性器官发育异常的基因检测（包括一些运动员的性别鉴定）的性别鉴定）指导性矫形手术指导性矫形手术出生后的性别鉴定应用出生后的性别鉴定应用胎儿性别鉴定预防性连锁遗传病胎儿的出生应用切不可滥用，性连371990年确定决定人类性别的基因位于年确定决定人类性别的基因位于Y染色体短染色体短臂的臂的1A1上，即上，即SRY基因（基因（sex-determining region of the Y），染色体上如缺），染色体上如缺SRY，即发展，即发展成女性。成女性。设计扩增人设计扩增人SRF基因和基因和X、Y同源序列的同源序列的2对引物对引物进行进行PCR355289bpMM：maleFF：female590鉴定诊断率鉴定诊断率100%1990年确定决定人类性别的基因位于Y染色体短臂的1A1上，38三、恶性肿瘤的诊断和研究三、恶性肿瘤的诊断和研究恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测留细胞的监测癌基因、抗癌基因缺失与点突变的癌基因、抗癌基因缺失与点突变的研究研究肿瘤相关病毒基因的研究肿瘤相关病毒基因的研究三、恶性肿瘤的诊断和研究恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞391.恶性肿瘤分子标记的检测恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测及肿瘤残留细胞的监测某些白血病与特定的染色体的易位或基某些白血病与特定的染色体的易位或基因重排有关因重排有关如如95%CML都存在都存在ph染色体染色体,产生产生t(9:22),形成形成ber/abl融合基因融合基因,转录成嵌转录成嵌合合mRNAPCR检测检测:设计设计1对引物扩增对引物扩增ber/abl嵌合嵌合mRNA.本法可检测本法可检测1个个ph阳性细胞阳性细胞/105正常细胞正常细胞该法也可用于淋巴瘤该法也可用于淋巴瘤t(14:18)、(q32:q21)1.恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测某些白血病401.恶性肿瘤分子标记的检测恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测及肿瘤残留细胞的监测PCR法可检测法可检测15个肿瘤残留细胞个肿瘤残留细胞/104105正常细胞正常细胞PCR为肿瘤的诊断、预后判断、微量残为肿瘤的诊断、预后判断、微量残留细胞提供了快捷、正确的方法留细胞提供了快捷、正确的方法1.恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测PCR法可41以往检测缺失方法以往检测缺失方法：较大缺失在显微镜下分析；：较大缺失在显微镜下分析；微小缺失用印迹杂交微小缺失用印迹杂交PCR法检测法检测：简单简单引物设计方法引物设计方法：小缺失，设计小缺失，设计1对引物分别对引物分别与缺失两侧的序列互补；与缺失两侧的序列互补；大缺失，在缺失区大缺失，在缺失区内设计内设计1对对PCR检测缺失检测缺失：小缺失样品，扩增片段长小缺失样品，扩增片段长度变短；度变短；大缺失样品，无靶大缺失样品，无靶DNAPCR扩增扩增产物产物PCR检测突变方法：检测突变方法：PCR-SSCP、引物竞争、引物竞争PCR和和PCR直接测序法直接测序法2.癌基因、抗癌基因缺失癌基因、抗癌基因缺失与点突变的研究与点突变的研究以往检测缺失方法：较大缺失在显微镜下分析；微小缺失用印迹杂交422.癌基因、抗癌基因缺失癌基因、抗癌基因缺失与点突变的研究与点突变的研究小缺失小缺失大缺失大缺失AA：正常：正常BB：缺失：缺失AA：正常：正常BB：缺失：缺失缺失区缺失区缺失区缺失区2.癌基因、抗癌基因缺失与点突变的研究小缺失大缺失AA：433.肿瘤相关病毒基因的研究肿瘤相关病毒基因的研究HBV-与原发性肝癌与原发性肝癌HPVEBV-鼻咽癌、鼻咽癌、Burkills淋巴瘤、传染性淋巴瘤、传染性单核细胞增多症、何杰金氏病单核细胞增多症、何杰金氏病HCMV-在宫颈癌、前列腺癌、肠癌和在宫颈癌、前列腺癌、肠癌和Koposi肉肉瘤瘤中可检测到中可检测到HTLV-1(人类嗜人类嗜T细胞白血病病毒细胞白血病病毒)慢慢性进行性脊髓病和性进行性脊髓病和T淋巴细胞白血病淋巴细胞白血病HTLV-PCR可用于：淋巴细胞增生性疾可用于：淋巴细胞增生性疾病和神经系统的病人和携带者的检测病和神经系统的病人和携带者的检测与肿瘤相关的病毒与肿瘤相关的病毒3.肿瘤相关病毒基因的研究HBV-与原发性肝癌44四、法医学研究四、法医学研究以往检测待测样品以往检测待测样品DNA的多态性方法：的多态性方法：RFLP缺点：较难获得量多且未降解的缺点：较难获得量多且未降解的DNAPCR法扩增特定的法扩增特定的DNA序列序列PCR法标本：头发、血斑、精斑或其他分泌法标本：头发、血斑、精斑或其他分泌物或组织块物或组织块PCR法结合指纹图谱分析和法结合指纹图谱分析和RFLP进行个体识进行个体识别、亲子鉴定、性别鉴定别、亲子鉴定、性别鉴定四、法医学研究以往检测待测样品DNA的多态性方法：RFLP45五、在骨髓移植配型中的作用五、在骨髓移植配型中的作用供者与受体之间的供者与受体之间的HLA必须相合才可进行必须相合才可进行BMT经典的经典的HLA配型方法：血清学或混合淋巴细配型方法：血清学或混合淋巴细胞培养法分析胞培养法分析HLA基因型基因型PCR法可特异性扩增法可特异性扩增DNA序列，用于基因的序列，用于基因的多态性分析多态性分析五、在骨髓移植配型中的作用供者与受体之间的HLA必须相合才可46本章思考题试述PCR的基本原理和技术的特点本章思考题试述PCR的基本原理和技术的特点47