第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验ppt课件

第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导1优选第九单元免疫增殖病的免疫优选第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导学检验实验指导优选第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导2v当当临床上考床上考虑为多多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞胞恶变等免疫球蛋白病等免疫球蛋白病时，一般先以血清蛋白区，一般先以血清蛋白区带电泳、免疫球蛋白定量泳、免疫球蛋白定量检测或尿本周蛋白定性作或尿本周蛋白定性作为初初筛实验。v如果如果发现有异常球蛋白区有异常球蛋白区带，继而而进行免疫固定行免疫固定电泳、泳、免疫球蛋白免疫球蛋白亚型定量等型定量等检测做做进一步定量分析和免疫一步定量分析和免疫球蛋白分球蛋白分类鉴定。定。当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变等免3实验一一血清免疫固定血清免疫固定电泳泳实验实验一血清免疫固定电泳实验4实验目的实验目的v本本实验以血清免疫固定以血清免疫固定电泳泳实验为例例进行行实习v通通过实习，熟悉血清免疫固定，熟悉血清免疫固定电泳的泳的实验过程及注程及注意事意事项；掌握血清免疫固定；掌握血清免疫固定电泳泳检测M蛋白的基本蛋白的基本原理与原理与临床意床意义。实验目的本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习5实验原理实验原理v 将患者血清在将患者血清在琼脂糖凝胶介脂糖凝胶介质上上经电泳分离后，将固定泳分离后，将固定剂和各型和各型Ig及其及其轻链抗血清加于凝胶表面的各自泳道上，抗血清加于凝胶表面的各自泳道上，经孵孵育育让固定固定剂和抗血清在各自泳道和抗血清在各自泳道对应的凝胶内渗透并的凝胶内渗透并扩散，散，若有若有对应抗原存在，抗原存在，则在适当位置形成抗原抗体复合物并在适当位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。沉淀下来。电泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未泳凝胶在洗脱液中漂洗，去除未结合蛋白合蛋白质，仅保留保留贮存在凝胶内的抗原抗体复合物。存在凝胶内的抗原抗体复合物。经染色后蛋白染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区泳参考道和抗原抗体沉淀区带被被Acide Violet染色液着色。染色液着色。根据根据电泳移泳移动距离分离出距离分离出单克隆克隆组分。分。实验原理 将患者血清在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后，将固定剂6试剂与器材试剂与器材vAcide Violet染色液：用染色液：用1L 10%冰醋酸溶解冰醋酸溶解Acide Violet。v脱色液：用脱色液：用1L蒸蒸馏水溶解水溶解Citric Acid Destain。v清洗液清洗液：8L蒸蒸馏水溶解水溶解Tris-Buffered Saline。v电泳泳仪：spife 3000全自全自动电泳泳仪。试剂与器材Acide Violet染色液：用1L 10%冰醋7Spife 3000全自全自动电泳泳仪Spife 3000全自动电泳仪8操作步骤操作步骤v样本本处理：理：用生理用生理盐水将血清水将血清标本适当稀本适当稀释后后备用，其中同一份血清用，其中同一份血清第一泳道第一泳道样本稀本稀释3倍，第二至第六泳道倍，第二至第六泳道样本稀本稀释5倍。倍。操作步骤样本处理：9v区区带电泳泳 上上样 胶片准胶片准备 电泳泳区带电泳10v沉淀反沉淀反应 加抗血清加抗血清洗洗涤、烘干、烘干着着 色色 沉淀反应 加抗血清洗涤、烘干着 色 11结果分析结果分析 v对染色烘干后的胶片染色烘干后的胶片进行判行判读。将第一泳道作。将第一泳道作为血清蛋白血清蛋白分子量参考道，分子量参考道，观察第二至第六泳道有无察第二至第六泳道有无对应的特异性的特异性单克隆免疫球蛋白条克隆免疫球蛋白条带。如。如图12-1所示所示,其中其中sp泳道泳道为血清蛋血清蛋白参考道，由下至上分白参考道，由下至上分别为白蛋白、白蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白。第球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分泳道分别为IgG、IgA、IgM、抗血清泳道。抗血清泳道。结果分析 对染色烘干后的胶片进行判读。将第一泳道作为血清蛋白12第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验ppt课件13注意事项注意事项v标本需取新本需取新鲜血清血清进行分析，行分析，为避免抗原避免抗原过剩引起的剩引起的带现象，血清于加象，血清于加样前前应先作适当稀先作适当稀释并混匀。并混匀。v总免疫球蛋白的水平免疫球蛋白的水平20g/L稀稀释剂量加倍，当量加倍，当总免疫球蛋免疫球蛋白水平白水平5g/L稀稀释剂量减半（除了量减半（除了ELP泳道）。泳道）。v某些某些样本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝胶）冷藏或冰冻后，后，可能可能变得粘稠或混得粘稠或混浊。这种种样本可能由于本可能由于扩散障碍而存在散障碍而存在点点样问题。在。在这样情况下，加情况下，加25l液化液化剂于于75l血清中，混血清中，混匀匀15s。然后按。然后按规定程序定程序继续进行。行。注意事项标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现象14v某些某些单克隆蛋白克隆蛋白质可能因多聚体而可能因多聚体而导致所有的免疫固致所有的免疫固定泳道上均出定泳道上均出现单克隆片段。在克隆片段。在这样情况下可加情况下可加25l还原原剂（1-巯基乙醇）于基乙醇）于75l血清混匀并令其反血清混匀并令其反应至少至少15min（至多（至多3h)后按后按规定程序定程序继续进行。行。v在在电泳之前，凝胶与泳之前，凝胶与电泳槽的泳槽的贴合面充合面充满电泳介泳介质，并确保两者之并确保两者之间无气泡。无气泡。某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现15本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习某些单克隆蛋白质可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段。温州医学院 陶志华掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清IgG测定方法学的性能。本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群点。若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若b在0.参考选用检测系统中血清IgG的检测范围选择低浓度标本和高浓度标本03范围内，a较大，试着舍去某组数据，另作回归统计。脱色液：用1L蒸馏水溶解Citric Acid Destain。将第一泳道作为血清蛋白分子量参考道，观察第二至第六泳道有无对应的特异性单克隆免疫球蛋白条带。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。此范围如果超出了分析测量范围，可将标本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最后结果乘以稀释倍数。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。按实验要求，每个样品做6次重复测定，得6个实测值，它们和预期值形成6对数据。实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验v在抗血清加入血清加在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之孔后，确保血清与凝胶之间无无气泡。气泡。v染色之前的胶片一定要置于洗染色之前的胶片一定要置于洗涤液中充分洗液中充分洗涤，以出，以出去游离的血清和抗血清成分，降低染色后凝胶的背景去游离的血清和抗血清成分，降低染色后凝胶的背景色。色。本实验以血清免疫固定电泳实验为例进行实习在抗血清加入血清加样16临床应用临床应用v本法可本法可对各各类Ig及其及其轻链进行分型，最常用于行分型，最常用于临床床常常规M蛋白的分型与蛋白的分型与鉴定。通常用于定。通常用于单克隆克隆Ig增殖增殖病，病，单克隆克隆Ig病，本周蛋白和游离病，本周蛋白和游离轻链病、多病、多组份份单克隆克隆Ig病，重病，重链病、病、脑脊液寡克隆蛋白脊液寡克隆蛋白鉴别、多、多克隆克隆Ig病的病的诊断和断和鉴别诊断。断。v免疫固定免疫固定电泳的泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（周期短（仅需数小需数小时）、）、结果易于分析。果易于分析。临床应用本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M17思考题思考题v结合合实验室的免疫固定室的免疫固定电泳分析系泳分析系统，简述血述血清免疫固定清免疫固定电泳的影响因素及其克服泳的影响因素及其克服的方法。的方法。温州医学院温州医学院 陶志华陶志华思考题结合实验室的免疫固定电泳分析系统，简述血清免疫固定电泳18实验二二 血清血清IgG定量定量检测的可的可报告范告范围评价价实验 实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验 19v可可报告范告范围指可以指可以报告的所有告的所有结果范果范围，包含两种，包含两种类型型的范的范围，即分析，即分析测量范量范围和和临床可床可报告范告范围。v分析分析测量范量范围指指对没有没有进行任何行任何预处理（稀理（稀释，浓缩等）等）的的标本，分析方法能本，分析方法能够直接直接测定出的待定出的待测物范物范围，也就，也就是系是系统最最终的的输出出值（活性或（活性或浓度）与被分析物的活性度）与被分析物的活性或或浓度成度成线性比例的范性比例的范围，它反映整个系，它反映整个系统的的输出特性。出特性。概述概述可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分20v临床可床可报告范告范围 是指是指对临床床诊断、治断、治疗有意有意义的待的待测物物浓度范度范围。此范。此范围如果超出了分析如果超出了分析测量范量范围，可将，可将标本通本通过稀稀释、浓缩等等预处理使待理使待测物物浓度度处于分析于分析测量范量范围内，内，最后最后结果乘以稀果乘以稀释倍数。倍数。临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围21实验目的实验目的v掌握血清掌握血清IgG定量定量检测的可的可报告范告范围评价的原理和方价的原理和方法学，了解血清法学，了解血清IgG测定方法学的性能。定方法学的性能。实验目的掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学22实验原理实验原理v由于抗原抗体反由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学的特殊性，免疫学检测项目目应使用多点使用多点定定标绘制制标准曲准曲线，在，在绘制的制的标准曲准曲线上上查阅结果。由于果。由于计算机技算机技术的的发展，展，仪器可器可对反反应响响应呈不同表呈不同表现的的结果果做适当的做适当的处理，直接以最理，直接以最终计量量单位方式位方式报告告检验结果，果，在此情况下，在此情况下，评价患者价患者结果可果可报告范告范围时，可不必再去，可不必再去评价响价响应结果的真果的真实曲曲线状状态，只要将，只要将样品作不同程度的稀品作不同程度的稀释或配制后，将或配制后，将预期期值和和实际检测值作比作比较，绘制在坐制在坐标纸上上应呈一条通呈一条通过原点、斜率原点、斜率为1的直的直线。直。直线所达的限所达的限值即即为该方法的患者方法的患者结果可果可报告范告范围。实验原理由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学检测项目应使用多点定23试剂与器材试剂与器材v选用与用与检测仪器相配套的器相配套的试剂、校准品及其他、校准品及其他辅助助试剂v参考参考选用用检测系系统中血清中血清IgG的的检测范范围选择低低浓度度标本和高本和高浓度度标本本试剂与器材选用与检测仪器相配套的试剂、校准品及其他辅助试剂24操作步骤操作步骤v按按标本操作本操作规程做好程做好项目校准、常目校准、常规质控，保控，保证检测系系统处于良好状于良好状态。v实验标本的配制，将血清本的配制，将血清IgG的高（的高（H）和低（）和低（L）样品按：品按：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H关系各自配关系各自配制混合，形成系列制混合，形成系列评价的价的实验样品。并品。并计算各算各样品的品的预期期值。v将系列将系列评价的价的实验样品上机品上机检测，每，每标本重复本重复检测24次，次，结果果记录于下表。于下表。v依照稀依照稀释关系，关系，计算各算各实验样品的品的预期期值。按。按实验要求，要求，每个每个样品做品做6次重复次重复测定，得定，得6个个实测值，它，它们和和预期期值形形成成6对数据。数据。操作步骤按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处25结果分析结果分析结果分析26v观察察结果有无明果有无明显的数据差异，若有明的数据差异，若有明显差异差异时，应判断判断是否是否为离群点。离群点。v在坐在坐标纸上，以上，以X表示各表示各样品的品的预期期值，以，以Y表示各表示各样品的品的实测值，将，将实验结果点在果点在图上。上。v若所有若所有实验点在坐点在坐标纸上呈明上呈明显直直线趋势，用直，用直线回回归对数据数据进行行统计，得直，得直线回回归方程方程Y=bX+a，若，若b在在0.971.03范范围内，内，a接近于接近于0，则可直接判断可直接判断测定方法可定方法可报告范告范围在在实验已涉及已涉及浓度。度。v若若b不在不在0.971.03范范围内，内，a较大，大，试着舍去某着舍去某组数据，另数据，另作回作回归统计。若。若缩小分析范小分析范围后，回后，回归式有明式有明显改善，若改善，若b接近于接近于1，a趋于于0。此。此时，缩小的分析范小的分析范围可作可作为真真实的可的可报告范告范围。观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群27注意事项注意事项v进行可行可报告范告范围实验评价的价的样品必品必须与真与真实标本尽可能本尽可能相似，也要与真相似，也要与真实标本具有相同的基本具有相同的基质状状态。v评价价样品要品要5个或以上系列个或以上系列浓度的度的实验样品，品，浓度范度范围遍遍及整个及整个预期可期可报告范告范围。最高。最高浓度的度的样品品应达到可达到可报告告范范围的上限。的上限。v若收不到低若收不到低值样品，可收集高品，可收集高值样品，品，经系列不同程度系列不同程度稀稀释，形成系列，形成系列评价价样品。品。v一天内做完本一天内做完本实验，一般每个，一般每个实验样品做品做24次重复次重复测定。定。综合所有合所有结果作果作统计学学处理。理。注意事项进行可报告范围实验评价的样品必须与真实标本尽可能相28实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清IgG测定方法学的性能。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。标本需取新鲜血清进行分析，为避免抗原过剩引起的带现象，血清于加样前应先作适当稀释并混匀。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验若所有实验点在坐标纸上呈明显直线趋势，用直线回归对数据进行统计，得直线回归方程Y=bX+a，若b在0.进行可报告范围实验评价的样品必须与真实标本尽可能相似，也要与真实标本具有相同的基质状态。临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。临床可报告范围的评价要对分析标本进行最大稀释度的评价实验，以此作为临床可报告范围的上限；免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。若收不到低值样品，可收集高值样品，经系列不同程度稀释，形成系列评价样品。免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。Acide Violet染色液：用1L 10%冰醋酸溶解Acide本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群点。临床可报告范围 是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。在这样情况下可加25l还原剂（1-巯基乙醇）于75l血清混匀并令其反应至少15min（至多3h)后按规定程序继续进行。本法可对各类Ig及其轻链进行分型，最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。由于抗原抗体反应的特殊性，免疫学检测项目应使用多点定标绘制标准曲线，在绘制的标准曲线上查阅结果。参考选用检测系统中血清IgG的检测范围选择低浓度标本和高浓度标本上样免疫固定电泳的优点是分辨率高、敏感度高、操作周期短（仅需数小时）、结果易于分析。在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。对染色烘干后的胶片进行判读。清洗液：8L蒸馏水溶解Tris-Buffered Saline。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。优选第九单元免疫增殖病的免疫学检验实验指导按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。通常用于单克隆Ig增殖病，单克隆Ig病，本周蛋白和游离轻链病、多组份单克隆Ig病，重链病、脑脊液寡克隆蛋白鉴别、多克隆Ig病的诊断和鉴别诊断。经染色后蛋白质电泳参考道和抗原抗体沉淀区带被Acide Violet染色液着色。观察结果有无明显的数据差异，若有明显差异时，应判断是否为离群点。可报告范围指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围和临床可报告范围。在抗血清加入血清加样孔后，确保血清与凝胶之间无气泡。掌握血清IgG定量检测的可报告范围评价的原理和方法学，了解血清IgG测定方法学的性能。总免疫球蛋白的水平20g/L稀释剂量加倍，当总免疫球蛋白水平5g/L稀释剂量减半（除了ELP泳道）。按标本操作规程做好项目校准、常规质控，保证检测系统处于良好状态。应仔细阅读试剂说明书，某些检测项目不适宜用稀释方法获取系列浓度的临床新鲜血清标本，可采用商品质控物、校准品等。v应仔仔细阅读试剂说明明书，某些，某些检测项目不适宜用稀目不适宜用稀释方法方法获取系列取系列浓度的度的临床新床新鲜血清血清标本，可采用商品本，可采用商品质控物、控物、校准品等。校准品等。v 临床可床可报告范告范围的的评价要价要对分析分析标本本进行最大稀行最大稀释度的度的评价价实验，以此作，以此作为临床可床可报告范告范围的上限；如果低限有的上限；如果低限有临床意床意义时，可增加分析，可增加分析标本反本反应量来量来进行行检测下限下限评价价实验，并以此作，并以此作为临床可床可报告范告范围下限。下限。实验二 血清IgG定量检测的可报告范围评价实验在这样情29