血栓与止血检验进展课件

血栓与止血检验进展王鸿利血栓与止血血栓与止血检验进检验进展王展王鸿鸿利血栓与止血利血栓与止血检验进检验进展王展王鸿鸿利血栓与止血利血栓与止血检检 近年，随着基础理论和实验技术的发展，血栓和止血检验及其临床应用也有了很大的进展，本文就此作一简述。2020/11/1422020/11/142（一）血小板微颗粒检测 血小板被激活后，以出芽方式形成囊泡或以伪足断裂方式形成直径为0.11.0m的血小板颗粒（Platelet Microparticle,PMP)。PMP的体积较正常血小板小，但有完整的血小板膜结构和功能。PMP膜上可表达多种血小板膜糖蛋白（GP）b/a（GP b/a）、GPb/-、血小板活化因子（PAF）、-样前体淀粉蛋白、Ca2+依赖性蛋白酶Calpainyi以及有促凝作用的磷脂等。因此检测血循环中的PMP可较完整地反映血小板参与血栓形成和血液凝固的功能。2020/11/143（一）血小板微颗粒检测（一）血小板微颗粒检测2020/11/1432020/11/1442020/11/144 检测方法流式细胞术。主要试剂为CD61 parcp:多甲藻素-叶绿素蛋白标记抗血小板GPa的单克隆抗体 参考值6617个/104血小板（山东大学齐鲁医院报道）。2020/11/145 2020/11/145 临床意义PMP主要用于动脉血栓性疾病的检测，它是动脉血栓形成的敏感和特异的分子标志物。1.急性冠脉综合征（ACS）：有证据显示，PMP参与动脉粥样硬化和血管再梗塞的病理过程。Cawaz等对急性心肌梗死（AMI）施行PTCA患者进行系列血小板功能研究，发现PTCA术后患者的血小板数因消耗增加而减少，PMP因大量形成而增多，后者又参与冠脉血栓的形成。Katopodis等对行冠脉血栓形成术的ACS患者进行观察，他们将血小板激活状态作为试验组（近期发生AMI、不稳定性心绞痛者），结果发现，试验组患者PMP水平较正常对照组明显增高。2020/11/146 临床意义临床意义PMP主要用于动脉血栓性疾病的检测主要用于动脉血栓性疾病的检测 2.脑血栓形成：对大血管血栓、小血管血栓、多发性脑梗死和阿尔茨海默病患者进行PMP检测。结果发现，阿尔茨海默病患者的PMP水平与正常对照组无统计学差异，而其他疾病组患者的PMP水平均显著高于正常对照组，且治疗后有明显的降低，而且小血管血栓组患者的PMP水平高于大血管血栓组患者。表明PMP水平的增高，主要反映小动脉的血栓形成和血栓阻塞。2020/11/147 2.脑血栓形成：对大血管血栓、小血管血栓脑血栓形成：对大血管血栓、小血管血栓（二）血小板-白细胞聚集体检测 血小板被激活后，血小板释放P-选择素（P-selectin或GMP-140）。P-选择素与白细胞和（或）单核细胞膜上的P-选择素配体糖蛋白-1（PSLG-1）结合形成血小板-白细胞聚集物（Platelet-Leucocyte Aggre-gate,PLA)和（或）血小板-单核细胞聚集物 （Platelet-Monocyte Aggregate）。该聚集体是反映动脉血栓形成的特异性标志物之一。2020/11/148（二）血小板（二）血小板-白细胞聚集体检测白细胞聚集体检测2020/11/148 检测方法流式细胞术。主要试剂为FTTC标记的鼠抗人GPIb（CD42b）单克隆抗体，藻红蛋白标记的抗人白细胞CD45单克隆抗体，FTTC标记的鼠抗人P-selectin（CD62b）单克隆抗体。参考值瑞典学者报道血小板-白细胞聚集物为15.38.5（PLA/L）。2020/11/1492020/11/149 临床意义动物实验和临床研究表明，PLA是更敏感和更特异的血栓标志物。一组93例胸痛患者，其中9例为AMI患者，其血小板-单核细胞聚集物为34.210.3，84 例非AMI胸痛患者的血小板-单核细胞聚集体为19.31.4，二组差异显著（0.05）；AMI胸痛组和非AMI胸痛组患者的血小板-单核细胞聚集物水平均较10例正常对照组的血小板-单核细胞聚集物水平为高（0.001）。2020/11/1410 临床意义动物实验和临床研究表明，临床意义动物实验和临床研究表明，PLA是更是更（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测 生理情况下，由血管内皮细胞合成的血管性血友病因子（von Willebrand Factor,vWF）主要受vWF裂解蛋白酶（vWF C-leaving Proteinase,vWF-CP）的调节。vWF CP作用于 vWF分子量为250000多聚体的Try（842）-Met（843）之间的肽键，将它们水解成分子量为176000和140000的两个小分子肽段。此时vWF不能过度地参与血小板的粘附和聚集，因此vWF CP是 限制血栓形成的标志物之一。2020/11/1411（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测（三）血管性血友病因子裂解蛋白酶活性检测2020/11/142020/11/14122020/11/14122020/11/14132020/11/1413 检测方法ELISA。以型胶原包被酶标板，2.5BSA封闭，分别加入未透析的标本和经Slide-A-Lyzer透析过的标本，一抗为兔抗人vWF多抗，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，加入底物OPD490nm显色。结果以透析前后的OPD490比值作为该份标本的残余胶原结合活性（vWF:CBA或R-CBA）表示，R-CBA 越高，vWF-CP活性越低。参考值83例正常人血浆（n30）vWF:CBA 范围为2.140.5（21.99.2）；血清（n53）vWF:CBA范围为2.452.0（20.510.8）（苏州大学附一院）。2020/11/1414 检测方法检测方法ELISA。以。以型胶原包被酶标板型胶原包被酶标板 临床意义 1.血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：由于患者的vWF-CP基因缺陷或患者血浆中存在抗vWF-CP自身抗体，使vWF-CP血浆水平显著降低，不能正常裂解超大分子量的vWF多聚体（UL-vWF）。体内聚集的UL-vWF 易于血小板结合，促使血小板粘附和聚集，引起TTP病理过程的发生和发展。一组5例TTP患者检测vWF:CBA结果为48.196.5（78.220.2），较正常对照组明显增高，反映患者vWF-CP明显降低。2020/11/1415 临床意义临床意义2020/11/1415 2.血管性血友病（vWD）：据报道，21例vWF患者血浆vWF:CBA水平明显降于30例正常人、15例血友病患者及30例其他出血性疾病患者（0.001）。在vWF中，型患者的vWF:Ag/vWF:CBA比值1.0；型患者的vWF:Ag/vWF:CBA比值2.0；型患者的vWF:Ag/vWF:CBA都极低，其vWF:Ag/vWF:CBA比值具有可变性。2020/11/1416 2020/11/1416 3.恶性肿瘤：恶性肿瘤患者的vWF-CP活性水平显著低于正常人，伴有远处转移患者的vWF-CP活性水平更低，接受手术治疗后患者的vWF-CP可升高，导致血浆大分子多聚体增多，促使vWF参与血小板粘附和聚集，加剧恶性肿瘤患者的高凝集状态和血栓形成，反映vWF是参与恶性肿瘤血栓形成机制之一。2020/11/1417 2020/11/1417(四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测（monoclonal antibody specific immobili-zation of platelet antigen,MAIPA）将待测抗体、单抗和血小板共同温育，得到血小板膜GP、待测标本和单抗三分子复合物，然后加入酶联抗体并以微粒色被抗体固化于微孔中显色，显色深浅与待测抗体水平呈正比。参考值抗GP b/a阳性，A值0.133；抗GPb阳性，A值0.2092020/11/1418(四四)单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测单克隆抗体特异性俘获血小板抗原检测2020/11/142020/11/14192020/11/1419 临床意义检测血小板相关抗体，其敏感度和特异度高于双抗体夹心ELISA法。用于检测ITP和同种免疫血小板减少症。2020/11/14202020/11/1420两种方法对ITP诊断的比较 ELISA法 MAIPA法PAIgGPAIgAPAIgMGPb/aGPb阳性率（）8127225413敏感性（）8866607566特异性（）5075768394诊断效率（）72272273132020/11/1421两种方法对两种方法对ITP诊断的比较诊断的比较 ELISA法法 (五)凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）检测 凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物（T-TM）将由肝脏合成的、分子量为55KD的凝血酶激活的纤溶抑制物（Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI）的Arg（92）-Ala（93）之间的肽键水解后，脱去一个活化肽，TAFI变成活化型的TAFI a。TAFI具有抑制纤溶酶原转化为纤溶酶的生物活性，但是TAFI也受蛋白C抑制物（PCI）的抑制。2020/11/1422(五五)凝血酶激活的纤溶抑制物（凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）检测）检测2020/112020/11/14232020/11/1423 检测方法 采用 ELISA测定TAFI：Ag。以鼠抗人TAFI单克隆抗体包被酶标板，加入标准品或样品后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗人TAFI抗体，充分作用后加入邻苯二胺使之显色，显色深浅与样本TAFI的含量成正比。TAFI:A采用发色底物法测定。参考值 TAFI:Ag（n34）为7728（21133）；TAFI:A（n34）为24 5g/L（1434g/L）（上海瑞金医院）2020/11/1424 检测方法检测方法 采用采用 ELISA测定测定TAFI 临床意义 1.深静脉血栓（DVT）：Tiburg等对脑74例初发DVT患者的TAFI:Ag 进行检测，发现其水平增高。口服避孕药的正常生育期妇女，若TAFI：Ag水平超过90，其水平的危险性水平2倍，此时患者的纤溶活性减低。2.动脉血栓（冠心病）：瑞金医院对19例冠心病患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现冠心病患者的TAFI:Ag和TAFI:A的水平均高于正常对照组（0.001），与Silveira报道11例冠心病的检测结果一致，表明患者的纤溶活性明显降低。此外，TAFI水平增高也见于不稳定性心绞痛。2020/11/1425 临床意义临床意义2020/11/1425 3.微血栓（DIC）：瑞金医院对15例DIC患者检测了TAFI:Ag和TAFI:A，发现患者的水平明显低于正常对照组（0.001），表明患者纤溶活性明显升高。4.其他：TAFI水平升高还见于感染、因子V Leiden突变；TAFI水平减低还见于某些凝血因子缺乏（血友病、F缺乏症）、急性早幼粒细胞白血病（TAFI:A减低66，但TAFI:Ag正常）。2020/11/1426 2020/11/1426 （六）可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测 可溶性血管内皮细胞蛋白C受体（Soluble Endothelial Protein C Receptoe,sEPCR）是由血管内皮细胞产生，部分与内皮细胞连接称膜连EPCR，一部分流离于血浆称sEPCR。克隆的膜连EPCR cDNA全长1.3kb,是一种由221个氨基酸组成跨膜糖蛋白。膜连EPCR 通过促进T-TM复合物与蛋白C（PC）的结合，进而放大PC的活性；此外，EPCR还对体内急性炎症反应河DIC的发生具有保护作用。然而，血浆中sEPCR与膜连的EPCR具有相反的作用。sEPCR也可与PC和活化蛋白C（APC）结合。抑制PC的活化和抑制APC的抗凝活性，减轻膜连EPCR的增强PC活化和APC的抗凝作用，所以血浆sEPCR水平的增高市反映血管损伤和抗APC抗凝作用的特异性标志物。2020/11/1427 （六）可溶性血管内皮细胞蛋白（六）可溶性血管内皮细胞蛋白C受体检测受体检测2020/11 检测方法采用 ELISA。以单克隆-抗包被酶标板，分别加入血浆标本和不同稀释度的sEPCR标准品后，以生物素标记的单克隆二抗作为检测抗体，加入底物后显色，绘制标准曲线。参考值血浆sEPCR为115.220.7g/L2020/11/1428 2020/11/1428临床意义安徽省立医院报道的结果见表1组别nsEPCR（g/L）值正常对照值20115.2020.70冠心病组30134.2069.60心绞痛17148.9087.90心肌梗死 8117.6033.80糖尿病组56177.0081.400.001败血症组30172.6043.700.001SLE合并血栓组 14144.7033.900.005SLE血栓组49165.8045.300.0012020/11/1429临床意义安徽省立医院报道的结果见表临床意义安徽省立医院报道的结果见表1组别组别nsEPCR（七）蛋白C Global试验 凝血酶（T）与血管内皮细胞的凝血酶调节蛋白（TM）形成复合物（T-TM），后者使PC转化为APC。APC在蛋白S（PS）的辅助下，灭活因子Va和因子a，还抑制纤溶酶原激活抑制物-1（PAI-1），使纤溶活性增强。然而，Agkistrodon contorix蛇毒可以取代T-TM复合物直接激活PC，使PC转化为APC，APC也受PAI的抑制。2020/11/1430 （七）蛋白（七）蛋白C Global试验试验2020/11/143 检测方法在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活PC，使PC转化为AP-C。随后在检测系统中加入APTT试剂以检测依赖PC活性的血浆凝固时间（Protein C Activ-Ity Dependent ClottingTime,PCAT）若待测血浆中的PC系统正常，则加入Ca2+后血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响，本试验设计了对照组，即在实验过程中以缓冲液代替PC激活剂，血浆不依赖PC活性的血浆凝固时（PCAT/O），其结果应短于60s。2020/11/1431 检测方法在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可检测方法在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可 参考值PCAT为85200s，PCAT/O为 3355s（n234）。临床意义本试验对PC活性低于参考值70的检出率为90；对PS活性低于参考值的60的检出率为89；对凝血因子Leiden突变的检出率为100；对凝血酶原（F）20210 CA突变的检出率为84。本试验的检出特异性为79。因此，本试验多用于PC、PS、F Leiden突变和F20210 CA突变的检测，起到蛋白C系统筛选检测作用。但是，本试验也有假阳性，见于凝血因子、活性升高、口服抗凝剂和狼疮抗凝物质等。2020/11/1432 参考值参考值PCAT为为85200s，PC （八）蛋白Z抗原检测 蛋白Z（Protein Z,PZ）是二十世纪90年代发现的一种血液凝固调节蛋白，为一种维生素K依赖的单链糖蛋白，由肝脏合成后分泌入血。人PZ的相对分子量为62KD，半寿期为2.5天，其基因位于13q34。在Ca2+和磷脂存在时，PZ可与蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物（Protein Z-Pependent ProtaseInhibItor,ZPI）结合，并进一步与Fa形成a-ZPI-PZ复合物而使因子a在一分钟内便失去95以上的凝血活性。2020/11/1433 （八）蛋白（八）蛋白Z抗原检测抗原检测2020/11/1433 检测方法 目前多采用法国Stago公司的 ELISA试剂盒检测。参考值法国学者报道1.043.57mg/L；国内潘学谊报道60例中青年人（2258480）g/L。妊娠期时PZ水平逐渐增高。2020/11/1434 2020/11/1434 临床意义目前PZ在临床上的意义尚不十分清楚。Wasse等研究发现PZ缺乏（1.0Mg/L）在缺血性脑卒中和健康对照中分别为20和5，二者具有显著性差异，PZ缺乏可使缺血性脑卒中的危险性提高4倍。Soft等报道在急性冠脉综合征病人当中PZ水平明显低于健康对照，说明PZ缺乏是导致急性冠脉综合征的独立的危险因素。此外，尚有报道认为PZ缺乏也会导致临床出血症状，故认为PZ具有血栓和出血双种作用，机制未明。此外，血透患者和口服避孕药者PZ水平升高；口服抗凝剂、流产、早产、先兆子痫、胎儿宫内发育迟缓等PZ血浆水平降低。2020/11/1435 临床意义目前临床意义目前PZ在临床上的意义尚不十分在临床上的意义尚不十分蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物检测(proteinZ-dependent protease inhibitor,ZPI)原理用抗ZPI的多克隆抗体色被酶标板，待测血浆中的ZPI与固相抗体结合，生物素化抗ZPI单抗与ZPI抗原结合形成固相多抗-抗原-生物素单抗夹心物。后加入链霉素亲和素-辣根过氧化物酶复合物，其中辣根过氧化物酶作用其特异性底物甲基联苯胺（TMB）生成有色物质，显色程度与ZPI含量呈正比。2020/11/1436蛋白蛋白Z依赖的蛋白酶抑制物检测依赖的蛋白酶抑制物检测2020/11/1436参考范围各室需自行建立临床意义ZPI应与PZ同时检测。PZ缺乏时，势必使ZPI抑制FXa和FXIa的作用明显减低，易形成血栓。2020/11/14372020/11/1437 （九）组织因子途径抑制物-因子Xa复合物检测（tissue factor pathway inhibitor-factor-factorXa complex,TFPI-FXa）利用双抗体夹心法检测血浆中TFPI/FXa二元和TF/Fa/TFPI/FXa四元复合物。将稀释的血浆样品加至预先用特异性抗TFPI抗体色被的酶标板中温育，抗原-抗体结合后用生物素标记的纯化鸡IgY来检测，后者可识别TFPI/FXa复合物表面的新抗原决定簇。加辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素，形成双抗体夹心酶联免疫复合物。加底物TMB，与过氧化物酶反应生成蓝色溶液，最后加0.5mol/LH2SO4终止反应，溶液变成黄色。在波长450nm处测得吸光度值。根据标准曲线，计算待测血浆中TFPI/FXa复合物的含量。2020/11/1438 （九）组织因子途径抑制物（九）组织因子途径抑制物-因子因子Xa复合物检测复合物检测2020/参考值待建立临床意义有助于DIC早期和血栓前状态的检测和诊断。2020/11/14392020/11/1439（十）抗体芯片技术 抗体芯片（Antibody Microarray）是 蛋白芯片的一种，是将能识别特异性抗原的抗体制成微阵列，检测生物样品中抗原蛋白表达模式的方法。这种抗体微阵列可以在一次简单实验中同时检测样品中的数百甚至数千种蛋白质的表达情况，并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有着广泛的应用前景。2020/11/1440（十）抗体芯片技术（十）抗体芯片技术2020/11/1440 抗体芯片的检测操作并不要求特殊的技能，一般常规的操作就可以完成以往极为复杂耗时的工作。整个检测操作流程包括：从组织或细胞、体液中提取蛋白质，并用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记被检测样品和对照样品，去除多余的标记分子后与芯片杂交孵育，最后扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成。在抗体芯片制作方面，如何获得高质量的抗体、提高特异性、减少交叉反应是制作高质量抗体芯片的主要考虑因素。2020/11/1441 抗体芯片的检测操作并不要求特殊的技能，一抗体芯片的检测操作并不要求特殊的技能，一 抗体芯片技术在血栓与止血检验领域 有着很好的应用前景。目前正在研发过程中的凝血疾病诊断抗体芯片，是将针对各种凝血因子和抗凝血因子的单克隆抗体分别固定在合适的片基上，来检测血清标本中各种凝血因子和抗凝血因子的抗原，从而可以迅速诊断遗传性易栓症和出血性疾病。2020/11/1442 2020/11/1442（十一）血栓弹力图（Thrombelastograph hemostasis system,TEG）的检测及其临床应用凝血凝血-血小板血小板-纤溶的筛选作用纤溶的筛选作用2020/11/1443（十一）血栓弹力图（十一）血栓弹力图（Thrombelastograph 参数定义参数定义2020/11/1444参数定义参数定义2020/11/1444参数定义参数定义2020/11/1445参数定义参数定义2020/11/1445-3+34854722020/11/1446-3+34854722020/11/1446高凝高凝2020/11/1447高凝高凝2020/11/1447-3+348547247742020/11/1448-3+348547247742020/11/14482020/11/14492020/11/1449-3+3EPL 015Ly30 0847742020/11/1450-3+3EPL 01547742020/11/1450纤溶亢进纤溶亢进2020/11/1451纤溶亢进纤溶亢进2020/11/14512020/11/14522020/11/14522020/11/14532020/11/1453（十二）旋转血栓弹力图（ROTEM）是在传统的TEG基础上，减少振动的干扰，增加了流动性和电脑分析系统，使测量间的波动减少，更为准确、明了。2020/11/1454（十二）旋转血栓弹力图（十二）旋转血栓弹力图（ROTEM）2020/11/1454常用参数及其意义/应用 EXTEM是加入重组的TF(rTF)激活外源凝血系统，很快形成血凝块(相当于PT)，即为EXTEM-CT。EXTEM-CT的截断阈值出现在实验开始后的80s，提示需输注PCC或FFP；EXTEM-MCF：提供血凝块最大强度和稳定的信息，与血小板计数和Fg水平有关。2020/11/1455常用参数及其意义常用参数及其意义/应用应用2020/11/1455 FIBTEM-MCF：实验中加入一种血小板抑制剂（细胞松弛素D）即代表Fg对血凝块的强度；MCF截断阈值出现于实验开始后的1015分钟，其降低提示须输注Fg制品；FIBTEM-MCF值正常而EXTEM-MCF值减低提示须输注血小板，因此二者须同时检测。2020/11/1456 FIBTEM-MCF：实验中加入一种血小板抑：实验中加入一种血小板抑 INTEM是实验中加入鞣花酸活化物，激活内源凝血系统（类似APTT）；加入肝素酶（HEPTM）用肝素样抗凝物检查。比较INTEM-CT和HEPTEM-CT，可用于对肝素化和鱼精蛋白纠正的定量，二者需同时检测。2020/11/1457 INTEM是实验中加入鞣花酸活化物，激活内源是实验中加入鞣花酸活化物，激活内源 针对围手术期大出血患者床旁ROTEM检查，应包括EXTEM、FIBTEM、APTEM以及必要时用INTEM、HEPTEM等。对于心脏手术（体外循环）被肝素化的患者，推荐将INTEM-CT和HEPTEM-CT作为首选的ROTEM检查。2020/11/1458 针对围手术期大出血患者床旁针对围手术期大出血患者床旁ROTEM检查，应检查，应推荐检查的时间点手术之前有明显出血，但尚未作纠正治疗时置换一个血容之后术后检测有无高凝状态2020/11/1459推荐检查的时间点推荐检查的时间点2020/11/1459 血制品的输注和止血药的应用 1、Fg/冷沉淀输注：Fg1.0g/L，或ROTEM检测EXTEM-MCF50mm及FIBTEM-MCF12mm。应输注Fg/冷沉淀。EXTEM-MCF和FIBTEM-MCF的目标值（参考值）分别为5060mm和1620mm。若行施肝移植和心脏手术患者，其EXTEM-MCF可为45mm，FIBTEM-MCF可为8mm；若无出血EXTEM-MCF的临界值可35mm。2020/11/1460 血制品的输注和止血药的应用血制品的输注和止血药的应用2020/11/14602、血小板输注：BPC 50109/L或EXTEM-MCF45mm+FIBTEM-MCF12mm，应输血小板制品。2020/11/14612、血小板输注：、血小板输注：BPC 50109/L或或EXTEM-MC3、PPC/FFP输注：APTT/PT 正常对照值的1.5倍或EXTEM-MCF 100mm。提示F、F、F、F的血浆水平减低，应给予PPC或FFP。FFP应输注2030ml/kg（国内1015ml/kg），且可以补充F。2020/11/14623、PPC/FFP输注：输注：APTT/PT 正常对照值的正常对照值的1.4、rFa制品：在Fg 1.0 1.0g/L，BPC 50109/L和APTT/PT接近正常情况下，其疗效最佳。可以选用TEG/ROTEM检查中的R/CT、K/CFT缩短以及MA/MCF升高最能反映rFa的效果，但APTT/PT的缩短不能反映rFa的效果。2020/11/14634、rFa制品：在制品：在Fg 1.0 1.0g/L，BPC（十三）血小板功能分析仪（platelet function analyzer-100,PFA-100)体外筛选血小板黏附和聚集的仪器。以标有胶原/腺上腺素（CEPI）和胶原/ADP（CADP）两种纤维膜为诱导剂，以观察膜孔闭合时间（closure time，CT）为结果。参考范围 CEPI为61203s；CADP：48 187s2020/11/1464（十三）血小板功能分析仪（十三）血小板功能分析仪2020/11/1464In Vivo HaemostasisPFA100.avi capillary 200maperture150mepinephrine or ADPplateletvWFerythrocyteFLOW-40 mbarcollagen membranePFA-100 Test Principlelumenfibrinogenplateletcollagen fibrilserythrocyteendothelial cellvWF2020/11/1465In Vivo HaemostasisPFA100.avi 临床应用 一期止血缺陷的筛选试验。敏感性：CEPI/CADP为82.5%/66.9%特异性：CEPI/CADP为88.7%/85.5%阴性预测值：CEPI/CADP为83%/75%阳性预测值：CEPI/CADP为88%/79%2020/11/1466临床应用临床应用 一期止血缺陷的筛选试验。一期止血缺陷的筛选试验。2020/11/1466vWD：CEPI/CADP的敏感性为88%/87%；特异性为95%/95%。血小板无力症：CT延长，可替代BT，准确、可靠。服用ASA时：CEPI的CT延长，CADP可正常；与其他疾病与药物诱导血小板功能异常鉴别的敏感性和特异性分别为100%和50%。2020/11/1467vWD：CEPI/CADP的敏感性为的敏感性为88%/87%；特异性为；特异性为方法学评价 PFA-100操作简便、快速、结果准确。CEPI/CADP的变异系数为12%/8%，与PAgT有良好相关性。受PLT、贫血（Hct30%）、O型血型、3.8%枸橼酸盐和富含核黄素食物等的影响；Fg的裂解肽可影响 Fg-vWF/GPb-a的结合2020/11/1468方法学评价方法学评价2020/11/1468（十四）凝血酶生成（十四）凝血酶生成(Thrombin generation，TGT)的检测及其临床应用的检测及其临床应用 乏血小板血浆(PPP)试剂(含TF和磷脂)作用于待测血浆，激活凝血系统，最终生成凝血酶。后者将荧光底物ZGGR-AMC*转化为荧光基团AMC，AMC在390nm激发光的作用下发出460nm波长的荧光。荧光读数仪实时检测产生的荧光强度，通过电脑自动绘制凝血酶生成曲线。*ZGGR-AMC:Z-Gly-Gly-Arg-AminoMethyl coumarin凝血酶生成试验的原理2020/11/1469（十四）凝血酶生成（十四）凝血酶生成(Thrombin generationCAT检测法主要有5个指标：延迟时间(lagtime):即从反应开始到凝血酶开始生成所经历的时间(min为单位)。峰值(peak):即生成凝血酶的最大量(nM为单位)。达峰时间(ttpeak):即从反应开始到凝血酶达到最大值所经历的时间(为单位)。凝血酶生成潜力(Endogenous thrombin potential,ETP):即凝血酶生成曲线下的微积分面积，反映凝血酶的生成量(nMmin为单位)。ETP比值：即患者ETP与正常人ETP的比值(%为单位)。2020/11/1470CAT检测法主要有检测法主要有5个指标：延迟时间个指标：延迟时间(lagtime):即从即从2020/11/14712020/11/1471凝血酶生成试验的临床应用在低分子量肝素(LMWH)治疗中的凝血酶生成2020/11/1472凝血酶生成试验的临床应用在低分子量肝素凝血酶生成试验的临床应用在低分子量肝素(LMWH)治疗中的凝治疗中的凝2020/11/14732020/11/14732020/11/14742020/11/14742020/11/14752020/11/14752020/11/14762020/11/1476检测抗凝药物治疗：例如华法林治疗(n=78)。随着PT-INR值的递增，TGT的峰值下降，延长时间和达峰时间随之延长。目前认为，华法林治疗要求PT-INR为2.03.0，PT-INR1.5，华法林无效；PT-INR 2.0仍有血栓可能；PT-INR 3.0出血事件增加，PT-INR 5.0出血危险度剧增。Dieri等报道，ETP30%时可致出血倾向，要求抗凝治疗时ETP维持在50%为宜。若以PT-INR与ETP同时用于华法林观察，能更全面反映凝血状态。2020/11/1477检测抗凝药物治疗：例如华法林治疗检测抗凝药物治疗：例如华法林治疗(n=78)。随着随着P附：血管性血友病（vWD）的实验诊断 血管性血友病（von Willebrand dise-ase,vWD）是由于血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）合成的量或质异常所致的以皮肤、粘膜出血为特征的遗传性或获得性出血病。2020/11/1478附：血管性血友病（附：血管性血友病（vWD）的实验诊断）的实验诊断 血管性血管性2020/11/14792020/11/1479诊断vWD的常用检测筛选试验：BT，APTT，BPC诊断试验：F:C，vWF:Ag，vWF:Rcof分型试验：vWF多聚体，vWF-胶原结合试验 （vWF:CB），vWF-因子结合 （试验（vWF-F:BT）2020/11/14802020/11/1480 vWF-胶原结合试验（vWF-Collagen binding assay,vWF:CB）原理ELISA法。以胶原为色被抗原，以抗vWF抗体为检测抗体，主要检测可与胶原结合的中、中分子量的vWF。参考范围62165。2020/11/1481 2020/11/1481 临床意义 vWF:CB是反映vWF的粘附功能。多数vWD患者的vWF:CB。本试验可用于区分1型和2型vWD（2型vWD vWF:Ag/vWF:CB比值2.0）。vWF:CB还用于检测TTP或DDAVP治疗后血中存在的超大分子vWF，后者作为监测DDAVP的治疗反应。2020/11/14822020/11/1482 vWF-F结合试验（vWF-F binding test,vWF-F:BT）原理用抗vWF多克隆抗体色被，加入一定量的血浆vWF，并用高浓度的CaCl2去除结合的内源性的F，再加入重组F（rF),通过酶标记的F单抗显色，可以检测与F结合量。再与vWF:Ag含量比较，从而计算出F的结合率（F:BC）2020/11/1483 vWF-F结合试验结合试验2020/11/1483 参考范围 F:BT为924216/L；F:BT/vWF:Ag比值为1.100.34。临床意义在血友病A和vWD1型和3型中，F:BT/vWF:Ag比值正常；2N型vWD的F:BT/vWF:Ag比值。本试验是鉴别血友病A和2N型vWD的重要试验。2020/11/14842020/11/1484 表表1 vWD 的的 临临 床床 分分 型型 及及 其其 诊诊 断断异常率异常率1型型2 型型3型型（）（）(量减少量减少)2A亚型亚型2B亚型亚型2N亚型亚型2M亚型亚型(量如缺量如缺)发病率（）发病率（）7080101235?1遗传方式遗传方式ADADADARADARBT(min)30/NNAPTT(s)70/N/NF:C70/N/N似似(HA)vWF:Ag40/NNOvWF:Rcof50NORIPA/N NOvWF多聚体多聚体N缺乏大中缺乏大中缺乏大缺乏大NNOvWF:CBNvWF-F:BTN(确诊确诊)N治疗治疗DDAVPvWF浓缩剂浓缩剂同左同左同左同左同左同左 注注:AD常染色体显性；常染色体显性；AR常染色体隐性；常染色体隐性；N正常正常;降低；降低；显著降低；显著降低；O缺如；缺如；HA血友病血友病A2020/11/1485 2020/11/14862020/11/1486鉴鉴 别别 点点血小板型血小板型2B 型型主要缺陷主要缺陷GPbvWF血小板计数血小板计数通常减少，有波动通常减少，有波动正常或减少正常或减少血小板体积血小板体积增大增大正常正常RIPA增高增高增高增高患者患者PRP+正常正常vWF或或聚集聚集无反应无反应冷沉淀冷沉淀vWF结合反应结合反应患者患者vWF+正常血小板正常血小板正常或减少正常或减少增加增加患者血小板患者血小板+正常正常vWF增高增高减低减低vWF高分子多聚物血浆高分子多聚物血浆异常异常异常异常血小板血小板正常正常正常正常血小板血小板GPb质和量异常质和量异常正常正常vWD血小板型与血小板型与2B型的鉴别型的鉴别2020/11/1487鉴鉴 别别 点血小板型点血小板型2B 型主要缺陷型主要缺陷GPbvWF血小板计数通血小板计数通谢谢！请指导!2020/11/1488谢谢！请指导谢谢！请指导!2020/11/1488谢谢大家！结结 语语谢谢谢谢大家！大家！结结 语语