标记抗体技术课件(同名1202)

标记抗体技术免疫酶标记技术v酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISAELISA）v免疫酶组织化学染色技术免疫酶组织化学染色技术v斑点斑点-酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验一一 原理原理v酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免疫检测技术。疫检测技术。v免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术抗体的制备抗体的制备标记用酶标记用酶抗体标记抗体标记vELISA：间接法，直接法，夹心法，竞争法间接法，直接法，夹心法，竞争法v免疫组化免疫组化vDot-ELISA免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术v制备结合物时所用制备结合物时所用纯度较高的纯度较高的IgGIgG，以免在与酶联结，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。时其他杂蛋白的干扰。v最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。结果本底浅淡。v在在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原抗原必须是高纯度的必须是高纯度的。Preparation of Polyclonal AntibodiesvPolyclonal antiserum is generated in animals(sheep,rabbits or goats)with the introduction of antigens into the animals bloodstream.vThe antiserum(serum from blood containing the desired antibodies)contains a mixture of antibodies,each of which may bind to different antigen binding sites(epitopes).vAntiserum contains a mixture of antibodies.vThis mixture of antibodies are called ployclonal antibodies.vAn antigen that has multiple sites for antibody binding is called a mutivalent antigen.Preparation of Monoclonal AntibodiesvMonoclonal antibodies are highly specific for a single epitope on a multivalent antigen.vThey are produced from a single cell line using hybridoma technology and mouse myeloma cell lines.抗体纯化抗体纯化v沉淀法沉淀法硫酸铵盐析硫酸铵盐析辛酸法辛酸法v层析法层析法凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析免疫亲和层析免疫亲和层析硫酸铵盐析v取取10 ml10 ml血清加血清加10 ml10 ml生理盐水，加生理盐水，加入入20 ml20 ml饱和硫酸铵，终浓度为饱和硫酸铵，终浓度为50%50%。44，3h3h以上，使其充分沉淀。以上，使其充分沉淀。v离心弃上清，以离心弃上清，以10 ml10 ml生理盐水溶解生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵20ml20ml。置置43h43h以上以上.v重复上述第二步过程重复上述第二步过程1 12 2次。次。v末次离心后所得沉淀物为末次离心后所得沉淀物为-球蛋白，球蛋白，以以PBSPBS溶解至溶解至10ml10ml装入透析袋。装入透析袋。v对对PBSPBS充分透析、换液充分透析、换液3 3次，至萘氏次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无试剂测透析外液无黄色，即无NHNH4 4+为止为止例：兔抗鸭IgG的提纯(辛酸硫酸铵沉淀法)沉淀溶解透析离心，取上清加辛酸分离鸭血清上清透析过夜加饱和硫酸铵44静置10h10h离心，取沉淀取出分装SDSSDSPAGEPAGE检测v实验结果 提纯的兔抗鸭IgG的SDS-PAGE M：蛋白Marker 1：提纯的兔抗鸭IgG 2:兔血清v凝胶过滤层析凝胶过滤层析主要是根据主要是根据蛋白质蛋白质的的大小和形状，即蛋白大小和形状，即蛋白质的质量进行质的质量进行分离分离和和纯化。纯化。层析柱层析柱中的填中的填料是某些惰性的多孔料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是网状结构物质，多是交联的聚糖交联的聚糖(如葡聚糖如葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖)类物质，使类物质，使蛋白质混合物中的物蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同质按分子大小的不同进行分离。进行分离。离子交换层析离子交换层析v是以离子交换剂为固定是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方进行分离的一种层析方法。法。免疫的亲和层析免疫的亲和层析v将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中v那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术用于标记的酶用于标记的酶v辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）v碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）v葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（glucose-oxidase，GO）三、抗体的酶标记v过碘酸钠氧化法过碘酸钠氧化法v戊二醛法戊二醛法过碘酸钠法vHRPHRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基关的多糖羟基氧化为醛基。v此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结合，形成合，形成HRPCH2NHIgGHRPCH2NHIgG。v酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4)(NaHB4)还原后，即生成稳定的酶标记物。还原后，即生成稳定的酶标记物。过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环戊二醛交联标记法v戊二醛它具有两个活性醛基，可分别与酶分戊二醛它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体子和抗体(抗原抗原)分子上的氨基结合。分子上的氨基结合。v分为一步法和二步法：分为一步法和二步法：HRP一步法一步法v将抗体将抗体(抗原抗原)、酶和戊二醛同时混合。、酶和戊二醛同时混合。HRPHRP、APAP与抗体与抗体(抗原抗原)的交联。的交联。v但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；障碍，酶和抗体容易失活；v酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。二步法二步法v先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合v除去未与酶结合的多余戊二醛后除去未与酶结合的多余戊二醛后v再加入抗体再加入抗体(抗原抗原)，形成酶，形成酶戊二醛戊二醛抗体抗体(抗原抗原)结合物。结合物。v其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。戊二醛交联法（二步法）戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH +NH2-酶酶抗体抗体-NH2 +CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶酶抗体抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶酶ELISAv免疫酶技术(enzyme immunoassay)：是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。v酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISAELISA（enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay）是一类常用的免疫酶技术。是将已知是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP）。）。常见的酶联免疫吸附试验常见的酶联免疫吸附试验v直接法直接法v间接法间接法v双夹心法双夹心法v竞争法竞争法间接间接ELISAELISA检测抗体检测抗体检测对象检测对象ELISA的一般步骤（以间接的一般步骤（以间接ELISA为例）为例）二抗二抗包被抗原包被抗原一抗：一抗：待测血清待测血清底物液底物液洗涤洗涤封闭封闭洗涤洗涤洗涤洗涤终止终止结果结果判定判定操作步骤及步骤操作步骤及步骤包被：包被：抗原非特异地吸附在抗原非特异地吸附在ELISA板上板上 次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。抗原用包被缓冲液稀释抗原用包被缓冲液稀释100ul/孔孔湿盒中，4过夜酶标板酶标板包被用缓冲液包被用缓冲液pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液ELISA板（条）板（条）包被用抗原的种类包被用抗原的种类v包被抗原的选择是间接包被抗原的选择是间接ELISA方法建立的关方法建立的关键。键。v常用的包被抗原：常用的包被抗原：克隆表达及纯化的蛋白克隆表达及纯化的蛋白全微生物：病毒和细菌全微生物：病毒和细菌纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白经过载体偶联的小分子半抗原经过载体偶联的小分子半抗原克隆表达及纯化的蛋白克隆表达及纯化的蛋白v选择合适靶点蛋白的可选择合适靶点蛋白的可以鉴别强毒与弱毒的感以鉴别强毒与弱毒的感染，以及感染与免疫引染，以及感染与免疫引起的抗体。起的抗体。v缺点：筛选合适的靶点缺点：筛选合适的靶点基因困难。基因困难。全微生物抗原：病毒和细菌全微生物抗原：病毒和细菌v包被前，均需要灭活处理。包被前，均需要灭活处理。v病毒个体较小，可以直接包被。病毒个体较小，可以直接包被。v细菌个体较大，包被前需要对细菌个体较大，包被前需要对ELISAELISA板进行致敏，如板进行致敏，如利用戊二醛。利用戊二醛。v缺点是抗原成分比较复杂，交叉反应多。缺点是抗原成分比较复杂，交叉反应多。纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白v缺点：荚膜多糖的提纯步骤多，难以质控。天然蛋白纯化难以达到理想纯化，而且产量有限。经过载体偶联的小分子半抗原经过载体偶联的小分子半抗原vHapten:Hapten is a small molecule which is not antigenic in itself but when attached to a large molecule can stimulate the formation of antibodies.vCarrier:Carrier is an immunogenic substance that,when coupled to a hapten,renders the hapten immunogenic.v缺点：制备困难缺点：制备困难 封闭封闭v封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液关蛋白质溶液再包被再包被的过程。的过程。v封闭封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥隙，从而排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再后的步骤中干扰物质的再吸附。吸附。v一般封闭的时间为一般封闭的时间为3737度度2 2小时小时v封闭可以用封闭可以用BSABSA、小牛血清、明胶、脱脂乳等。、小牛血清、明胶、脱脂乳等。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。成败。ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISAELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有工操作有流水冲洗式和流水冲洗式和浸泡式两种：浸泡式两种：加入一抗加入一抗v一抗即需要一抗即需要检测的血清检测的血清v一抗的稀释倍数根据需要有不同：一抗的稀释倍数根据需要有不同：一般一般1 1：100-400100-400v3737度作用：一般为度作用：一般为1-21-2小时，然后小时，然后洗涤洗涤加入酶标二抗加入酶标二抗v什么是二抗？什么是二抗？SPASPA为什么可以作为哺乳动物广谱性的二抗使用为什么可以作为哺乳动物广谱性的二抗使用？v二抗的稀释倍数根据需要有不同：一般二抗的稀释倍数根据需要有不同：一般1 1：1000-100001000-10000v作用一般为作用一般为1-21-2小时小时v洗涤洗涤显色显色HRPHRP的两种底物：的两种底物：vOPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是色方便，是HRPHRP结合物最常用的底物结合物最常用的底物vTMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳性质较稳定。最适吸收波长为定。最适吸收波长为450nm450nm。APAP的底物：的底物：v磷酸酯酶，一般采用对磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作为底作为底物。物。v产物为黄色的对硝基酚，在产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm波长处有吸波长处有吸收峰。收峰。酶反应终止液酶反应终止液v常用的常用的HRPHRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式及比色液的最终体积而异，在板式ELISAELISA中一中一般采用般采用2mol/L2mol/L。vAPAP的终止液用的终止液用NaOHNaOH读数和结果判断读数和结果判断 定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回答，的回答，分别用分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。表示。定量是在用酶标仪测出定量是在用酶标仪测出ODOD值后值后用公式计算，如用公式计算，如P/NP/N值大于值大于2.12.1也可以用试剂盒中要求的方法进行判定也可以用试剂盒中要求的方法进行判定酶标仪酶标仪ELISAELISA检测抗原检测抗原 Ag +Ag +Ab*Ab*Ag-Ab*Ag-Ab*夹心夹心ELISA检测抗原检测抗原检测对象检测对象ELISAELISA检测抗体检测抗体检测对象检测对象v夹心法的适应范围？夹心法的适应范围？v建立一种夹心法检测病毒颗粒的建立一种夹心法检测病毒颗粒的ELISAELISA方法。方法。竞争竞争ELISAELISA检测检测抗原抗原竞争竞争v竞争法的适应范围？竞争法的适应范围？v建立一种竞争法检测小分子抗原的建立一种竞争法检测小分子抗原的的的ELISAELISA方法。方法。免疫组化免疫组化v免疫组化，是应用免疫学基本原理免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技或免疫细胞化学技术术(immunocytochemistry)(immunocytochemistry)。Direct method免疫组化免疫组化(三步法三步法)操作步骤操作步骤v石蜡切片脱蜡至水。石蜡切片脱蜡至水。v3%3%过氧化氢室温孵育过氧化氢室温孵育 5-10 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。酶的活性。v蒸馏水冲洗，蒸馏水冲洗，PBS PBS 浸泡浸泡 5 5 分钟分钟2 2次次v5-10%5-10%正常山羊血清（正常山羊血清（PBS PBS 稀释）封闭，室温孵育稀释）封闭，室温孵育 10 10 分钟，倾去血清，勿洗。分钟，倾去血清，勿洗。v滴加滴加 一抗一抗 工作液工作液，37 37 孵育孵育 1-2 1-2 小时或小时或 4 4 过夜。过夜。vPBS PBS 冲洗，冲洗，5 5 分钟分钟 x3 x3 次。次。v滴加适量滴加适量 标记二抗标记二抗 工作液，工作液，37 37 孵育孵育 10-30 10-30 分钟。分钟。vPBS PBS 冲洗，冲洗，5 5 分钟分钟 x3 x3 次。次。v滴加适量的滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液，工作液，37 37 孵育孵育 10-30 10-30 分钟。分钟。vPBS PBS 冲洗，冲洗，5 5 分钟分钟 x3 x3 次。次。v显色剂显色显色剂显色 3-15 3-15 分钟（分钟（DAB DAB 或或 NBT/BCIP NBT/BCIP）v自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。Indirect methodFluorescence MethodTexas Red,Rodamin,Cy3AMCAFITC,Cy2免疫组织化学的临床应用v恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断v确定转移性恶性肿瘤的原发部位确定转移性恶性肿瘤的原发部位v对某类肿瘤进行进一步的病理分型对某类肿瘤进行进一步的病理分型v软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的瘤的诊断是不可缺少的v发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定括手术范围的确定Dot-ELISA斑点酶联免疫吸附检测斑点酶联免疫吸附检测 v纤维素薄膜纤维素薄膜(NC)(NC)作固相载体，代替了聚苯乙作固相载体，代替了聚苯乙烯反应板，因建立烯反应板，因建立Dot-ELISADot-ELISA的原理与常规的原理与常规ELISAELISA相同，故常规相同，故常规ELISAELISA可用可用Dot-ELISADot-ELISA代替，代替，用于抗原、抗体的定性和定量等方面的检测。用于抗原、抗体的定性和定量等方面的检测。v与常规的微量板与常规的微量板ELISAELISA比较，比较，Dot-ELISADot-ELISA具有具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：作程序为：v抗原包被抗原包被将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，彻底干燥。释后加入圈中，彻底干燥。v 封闭封闭将硝酸纤维素膜置于封闭液中，将硝酸纤维素膜置于封闭液中，3737感作感作15153030分钟。分钟。v加被检血清加被检血清3737反应一定时间，用洗涤液洗三次，反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次每次1 13 3分钟。洗涤液一般为一定浓度的分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-TweenPBS-Tween溶液。溶液。v加酶标抗体加酶标抗体，3737反应一定时间后，用洗涤反应一定时间后，用洗涤液洗三次液洗三次v 显色显色加入新鲜配制的底物液加入新鲜配制的底物液,加蒸馏水洗加蒸馏水洗涤终止反应涤终止反应v 结果判定结果判定以阳性、阴险血清作为对照，膜以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应则为阴性反应谢谢 谢谢