氨基酸工业代谢控制发酵课件

氨基酸工业代谢控制发酵氨基酸工业代谢控制发酵2021/7/131氨基酸工业代谢控制发酵2021/7/131课程教学的基本要求程教学的基本要求p了解氨基酸发酵行业发展现状与中国氨基酸行业存了解氨基酸发酵行业发展现状与中国氨基酸行业存在问题，氨基酸发酵行业发展方向在问题，氨基酸发酵行业发展方向p掌握谷氨酸的生物合成途径和谷氨酸发酵调节机制，掌握谷氨酸的生物合成途径和谷氨酸发酵调节机制，掌握谷氨酸细胞膜渗透性的控制方法掌握谷氨酸细胞膜渗透性的控制方法p了解谷氨酸生产菌的主要特征以及谷氨酸生产菌在了解谷氨酸生产菌的主要特征以及谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化，掌握谷氨酸发酵的代谢控发酵过程中的形态变化，掌握谷氨酸发酵的代谢控制育种策略制育种策略2021/7/132课程教学的基本要求了解氨基酸发酵行业发展现状与中国氨基酸行业第一节第一节 氨基酸工业现状及发展方向氨基酸工业现状及发展方向近近4040多年来，国内外在研究、开发和应用氨基酸方面多年来，国内外在研究、开发和应用氨基酸方面均取得重大进展，新发现的氨基酸种类和数量已由均取得重大进展，新发现的氨基酸种类和数量已由2020世纪世纪6060年代年代5050种左右，发展到种左右，发展到2020世纪世纪8080年代的年代的400400种，种，目前已达目前已达10001000多种。其中用于药物的氨基酸及氨基酸多种。其中用于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达衍生物的品种达100100多种。多种。氨基酸分为两大类，即蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基氨基酸分为两大类，即蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸。酸。氨基酸中有氨基酸中有8 8种氨基酸人体本身不能合成，只能从食种氨基酸人体本身不能合成，只能从食物的蛋白质中摄取，称为必需氨基酸，它们是物的蛋白质中摄取，称为必需氨基酸，它们是L-L-赖氨赖氨酸、酸、L-L-色氨酸、色氨酸、L-L-苏氨酸、苏氨酸、L-L-缬氨酸、缬氨酸、L-L-亮氨酸、亮氨酸、L-L-异亮氨酸、异亮氨酸、L-L-苯丙氨酸和苯丙氨酸和L-L-蛋氨酸。蛋氨酸。还有两种半必需氨基酸，即精氨酸和酪氨酸。还有两种半必需氨基酸，即精氨酸和酪氨酸。2021/7/133第一节 氨基酸工业现状及发展方向近40多年来，国内外在研氨基酸的生产方法氨基酸的生产方法p抽提法（水解蛋白质）抽提法（水解蛋白质）p化学合成法化学合成法p生物法（包括直接发酵法和酶转化）生物法（包括直接发酵法和酶转化）目前绝大多数氨基酸是以发酵法或酶法生产的目前绝大多数氨基酸是以发酵法或酶法生产的2021/7/134氨基酸的生产方法抽提法（水解蛋白质）2021/7/134谷氨酸发酵的历史谷氨酸发酵的历史p18661866年德国化学家里豪森利用硫酸水解小麦面筋，分年德国化学家里豪森利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，将此氨基酸离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材，将此氨基酸命名为谷氨酸命名为谷氨酸p18721872年赫拉西维茨等用酪蛋白也制取了谷氨酸年赫拉西维茨等用酪蛋白也制取了谷氨酸p18901890年沃尔夫利用年沃尔夫利用-酮戊酸经溴化后合成酮戊酸经溴化后合成DL-DL-谷氨酸。谷氨酸。日本池田菊苗教授在探讨海带汁的鲜味时，提取了谷日本池田菊苗教授在探讨海带汁的鲜味时，提取了谷氨酸，并在氨酸，并在19081908年开始制造商品味之素年开始制造商品味之素p19101910年日本味之素公司用水解法生产谷氨酸。年日本味之素公司用水解法生产谷氨酸。19361936年年美国从甜菜废液美国从甜菜废液(司蒂芬废液司蒂芬废液)中提取谷氨酸。中提取谷氨酸。2021/7/135谷氨酸发酵的历史1866年德国化学家里豪森利用硫酸水解小麦面氨基酸发酵的现状氨基酸发酵的现状p自从发酵法生产谷氨酸成功以后，世界各国纷纷自从发酵法生产谷氨酸成功以后，世界各国纷纷开展氨基酸发酵的研究与生产，产量增长很快。开展氨基酸发酵的研究与生产，产量增长很快。20002000年氨基酸产量达年氨基酸产量达237237万吨，销售额接近万吨，销售额接近4545亿美亿美元，占生物技术产品销售额的元，占生物技术产品销售额的7 7。p目前氨基酸产业发展较快的国家是美国、日本和目前氨基酸产业发展较快的国家是美国、日本和中国。中国。2021/7/136氨基酸发酵的现状自从发酵法生产谷氨酸成功以后，世界各国纷纷开我国氨基酸发酵的发展我国氨基酸发酵的发展p我国氨基酸生产最早在我国氨基酸生产最早在19221922年用酸法水解面筋生产谷氨酸年用酸法水解面筋生产谷氨酸钠即味精，在上海开办了天厨味精厂，该味精的制造方法钠即味精，在上海开办了天厨味精厂，该味精的制造方法曾向美、英、法申请专利，并取得了专利权。并先后建立曾向美、英、法申请专利，并取得了专利权。并先后建立了沈阳味精厂、青岛味精厂和天津味精厂，规模均很小，了沈阳味精厂、青岛味精厂和天津味精厂，规模均很小，19491949年全国味精总产量不到年全国味精总产量不到500500吨。吨。p19651965年发酵法生产味精取得成功，带动了其他氨基酸的研年发酵法生产味精取得成功，带动了其他氨基酸的研究开发。究开发。p19651965年以后，我国味精生产全部采用以淀粉质或糖蜜为原年以后，我国味精生产全部采用以淀粉质或糖蜜为原料的微生物发酵工艺，大大的促进了生产的发展，到料的微生物发酵工艺，大大的促进了生产的发展，到19851985年全国味精生产企业达到年全国味精生产企业达到140140家。随着酶制剂的应用和生家。随着酶制剂的应用和生产工艺及装备的改进，技术水平不断提高，进一步推动了产工艺及装备的改进，技术水平不断提高，进一步推动了味精生产的快速发展。味精生产的快速发展。p发酵法发酵法L-L-赖氨酸生产起步于赖氨酸生产起步于2020世纪世纪7070年代，当时仅有上海年代，当时仅有上海天厨味精厂少量生产，以实用为主，天厨味精厂少量生产，以实用为主，19811981年在广西建成年年在广西建成年产产100100吨食品级吨食品级L-L-赖氨酸试验工厂，于赖氨酸试验工厂，于19871987年投产。年投产。2021/7/137我国氨基酸发酵的发展我国氨基酸生产最早在1922年用酸法水解氨基酸发酵的发展动向氨基酸发酵的发展动向新技术和工艺的开发应用新技术和工艺的开发应用1.现代生物技术在氨基酸工业中的应用2.生物化工技术在氨基酸工业中的应用新产品的开发、新应用领域的拓展新产品的开发、新应用领域的拓展1.医药中间体2.肽类3.多聚氨基酸4.氨基酸系表面活性剂2021/7/138氨基酸发酵的发展动向新技术和工艺的开发应用2021/7/13第二节第二节 微生物代谢控制发酵微生物代谢控制发酵p微生物代谢调节微生物代谢调节 1 1、时序调节、时序调节(temporal regulation)(temporal regulation)微生物对生长、发育、分化不同生理时期的代谢调节微生物对生长、发育、分化不同生理时期的代谢调节 2 2、适应调节、适应调节 微生物对细胞内外环境的变化作出应答性调节微生物对细胞内外环境的变化作出应答性调节p微生物的经济化学与合目的性微生物的经济化学与合目的性 Economic Biochemistry Economic Biochemistry（经济化学）：微生物利于生（经济化学）：微生物利于生存发生的所有生化反应皆有精确计算，有很高经济效益存发生的所有生化反应皆有精确计算，有很高经济效益 Telenomic Telenomic（合目的性）：微生物按需要有目的进行（合目的性）：微生物按需要有目的进行物质合成的能力物质合成的能力2021/7/139第二节 微生物代谢控制发酵微生物代谢调节2021/7/13一、代谢控制发酵的定义一、代谢控制发酵的定义代谢控制发酵：微生物正常代谢调节，不过量积累代谢控制发酵：微生物正常代谢调节，不过量积累初级代谢产物；人为解除正常代谢调节，而大量积初级代谢产物；人为解除正常代谢调节，而大量积累初级代谢产物的发酵方式。累初级代谢产物的发酵方式。代谢控制发酵方法代谢控制发酵方法：1 1、发酵条件控制、发酵条件控制 2 2、菌种遗传改造、菌种遗传改造2021/7/1310一、代谢控制发酵的定义代谢控制发酵：微生物正常代谢调节，不过1 1、分解代谢降解物阻遏、分解代谢降解物阻遏 分解代谢降解物阻遏：几种底物同时存在时，易利用对分解代谢降解物阻遏：几种底物同时存在时，易利用对难利用或利用快对利用慢底物分解的抑制作用。难利用或利用快对利用慢底物分解的抑制作用。2 2、解除分解代谢降解物阻遏的技术与方法、解除分解代谢降解物阻遏的技术与方法p 发酵条件控制发酵条件控制 加入安慰诱导物：如加入安慰诱导物：如LacLac结构类似物结构类似物IPTGIPTGp 抗降解物阻遏突变株的选育抗降解物阻遏突变株的选育 加入高浓度底物筛选仍产生大量目的产物的突变株加入高浓度底物筛选仍产生大量目的产物的突变株二、分解代谢降解物阻遏二、分解代谢降解物阻遏2021/7/13111、分解代谢降解物阻遏二、分解代谢降解物阻遏2021/7/1反馈调节作用反馈调节作用1 1、终产物反馈阻遏和反馈抑制、终产物反馈阻遏和反馈抑制 野生型菌株野生型菌株“A”“A”氨基酸合成操纵子模型氨基酸合成操纵子模型ARPOA结构基因无活性repressorARNA聚合酶反馈阻遏反馈阻遏活性A合成酶系（E1,E2）A反馈抑制反馈抑制超过生理需要量野生型菌株酶合成水平的反馈阻遏2021/7/1312反馈调节作用1、终产物反馈阻遏和反馈抑制ARPOA结构基因无 野生型菌株酶活性水平的反馈抑制野生型菌株酶活性水平的反馈抑制过量过量A A作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活Gene编码酶效应物位点 过量A酶活中心酶活中心2021/7/1313过量A作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活Gen反馈阻遏与反馈抑制比较反馈阻遏与反馈抑制比较 反馈阻遏反馈阻遏反馈抑制反馈抑制控制对象酶合成酶活性控制量终产物浓度终产物浓度控制水平转录水平酶构象变化控制装置终产物与阻遏蛋白亲和终产物与控制酶构象的部位亲和控制装置的动作阻遏蛋白与操纵子基因结合,不转录mRNA酶构型变化，活性中心失活形成控制开关控制酶活性大小控制反应迟缓，粗控制迅速，精控制细胞经济超高效益高效益2021/7/1314反馈阻遏与反馈抑制比较 反馈阻遏反馈抑制控制对象酶合成酶活性2 2、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育野生型菌株野生型菌株诱变诱变解除反馈调节突变株解除反馈调节突变株AR-或或AO-AR-AO-酶基因突变酶基因突变 解除反馈调节突变株可以大量积累末端产物解除反馈调节突变株可以大量积累末端产物筛选方法：筛选方法：解除解除Lys反馈调节突变株筛选反馈调节突变株筛选野生型菌株野生型菌株诱变诱变菌细胞菌细胞正常反馈调节型正常反馈调节型解除反馈调节突变型解除反馈调节突变型2021/7/13152、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育野生型菌株诱变解除反馈第三节第三节 谷氨酸的生物合成途径谷氨酸的生物合成途径p生产谷氨酸的主要菌株生产谷氨酸的主要菌株p生成谷氨酸的主要酶反应生成谷氨酸的主要酶反应p谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径p谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径2021/7/1316第三节 谷氨酸的生物合成途径生产谷氨酸的主要菌株2021/GluGlu发酵常用菌种发酵常用菌种 谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌(C.glutamicumC.glutamicum)北京棒杆菌北京棒杆菌(C.peikingC.peiking AS.1229)AS.1229)黄色短杆菌黄色短杆菌(Brevibacterium flavumBrevibacterium flavum)乳糖发酵短杆菌乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentumB.lactofermentum)2021/7/1317 2021/7/1317谷氨酸的生物合成包括谷氨酸的生物合成包括pp糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（糖酵解作用（glycolysis,EMPglycolysis,EMPglycolysis,EMPglycolysis,EMP途径）途径）途径）途径）pp戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathwaypentose phosphate pathwaypentose phosphate pathwaypentose phosphate pathway，HMPHMPHMPHMP途径）途径）途径）途径）pp三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（三羧酸循环（tricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycletricarboxylic acid cycle）pp乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环乙醛酸循环(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)(glyoxylate cycle)pp丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（丙酮酸羧化支路（COCOCOCO2 2 2 2固定反应）等固定反应）等固定反应）等固定反应）等2021/7/1318谷氨酸的生物合成包括2021/7/1318由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：A？B？谷氨酸生物合成的理想途径谷氨酸生物合成的理想途径2021/7/1319由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径：A？B？谷氨酸生物合成的理谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径p生成的丙生成的丙酮酸，一部分在丙酸，一部分在丙酮酸脱酸脱氢酶酶系的作用下氧化脱系的作用下氧化脱羧生成乙生成乙酰CoA，另一部分，另一部分经CO2固定反固定反应生成生成草草酰乙酸或苹果酸，催化乙酸或苹果酸，催化CO2固定反固定反应的的酶酶有丙有丙酮酸酸羧化化酶酶、苹果酸、苹果酸酶酶和磷酸和磷酸烯醇式丙醇式丙酮酸酸羧化化酶酶。p草草酰乙酸与乙乙酸与乙酰CoA在在柠檬酸合成檬酸合成酶酶催化作用下，催化作用下，缩合成合成柠檬酸，檬酸，进入三入三羧酸循酸循环，柠檬酸在檬酸在顺乌头酸酸酶酶的作用下生成异的作用下生成异柠檬酸，异檬酸，异柠檬檬酸再在异酸再在异柠檬酸脱檬酸脱氢酶酶的作用下生的作用下生成成-酮戊二酸，戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸戊二酸是谷氨酸合成的直接前体合成的直接前体。p-酮戊二酸在谷氨酸脱戊二酸在谷氨酸脱氢酶酶作用下作用下经还原氨基化反原氨基化反应生成谷氨酸生成谷氨酸2021/7/1320谷氨酸发酵的代谢途径生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作CO2固定固定酶酶系系活力活力强强Citrate synthase,Aconitase,ICDH,GDH酶酶活力活力强强乙乙醛酸循酸循环弱弱异异柠檬酸裂解檬酸裂解酶酶活力欠缺或微弱活力欠缺或微弱-酮戊二酸氧化戊二酸氧化能力缺失或微弱能力缺失或微弱谷氨酸脱谷氨酸脱氢酶酶能能力力强强l控制谷氨酸合成的重要措施控制谷氨酸合成的重要措施2021/7/1321CO2固定酶系活力强Citrate synthase,Acl乙乙醛酸循酸循环的作用的作用谷氨酸发酵的代谢途径谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径乙醛酸循环途径可看作三羧酸循可看作三羧酸循环的支路和中间环的支路和中间产物的补给途径产物的补给途径在菌体生长期之在菌体生长期之后，进入谷氨酸后，进入谷氨酸生成期，为了大生成期，为了大量生成、积累谷量生成、积累谷氨酸氨酸 ，最好没有，最好没有异柠檬酸裂解酶异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭催化反应，封闭乙醛酸循环乙醛酸循环2021/7/1322乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作三羧第四节第四节 谷氨酸生物合成的调节机制谷氨酸生物合成的调节机制p优先合成与反馈调节优先合成与反馈调节p生物素的调节作用生物素的调节作用2021/7/1323第四节 谷氨酸生物合成的调节机制优先合成与反馈调节2021l优先合成先合成 谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸氨酸l柠檬酸合成檬酸合成酶酶的的调节 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和顺乌头酸的反馈抑制一、优先合成与反馈调节一、优先合成与反馈调节2021/7/1324优先合成一、优先合成与反馈调节2021/7/1324l-酮戊二酸脱戊二酸脱氢酶酶的的调节在谷氨酸产生菌中，在谷氨酸产生菌中，-酮戊二酸脱氢酶活性微弱酮戊二酸脱氢酶活性微弱l谷氨酸脱谷氨酸脱氢酶酶的的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏-酮戊二酸合成后由于酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸2021/7/1325-酮戊二酸脱氢酶的调节2021/7/1325Glc丙酮酸丙酮酸草酰乙酸草酰乙酸CO2天门冬氨酸天门冬氨酸（Asp）AC-coACO2羧化酶羧化酶柠檬酸柠檬酸顺乌头酸顺乌头酸异柠檬酸异柠檬酸-酮戊二酸酮戊二酸Glu反馈抑制反馈抑制谷氨酸谷氨酸脱氢酶脱氢酶-酮戊二酸酮戊二酸脱氢酶脱氢酶合成酶合成酶反馈阻遏反馈阻遏2021/7/1326Glc丙酮酸草酰乙酸CO2天门冬氨酸（Asp）AC-coACpGluGlu产生菌主要生理生化特性产生菌主要生理生化特性 需氧，生物素缺陷型需氧，生物素缺陷型biobio-,有乙醛酸循环，有乙醛酸循环，羧化酶活性强（羧化酶活性强（biobio作为辅酶）作为辅酶）柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性高，GluGlu合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑制。菌体细合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑制。菌体细胞膜通透性差，不利于胞膜通透性差，不利于GluGlu胞外分泌。胞外分泌。二、生物素对代谢的调控作用二、生物素对代谢的调控作用2021/7/1327Glu产生菌主要生理生化特性二、生物素对代谢的调控作用202l 生物素对生物素对CO2CO2固定反应的影响固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2CO2固固定反应，据报道，生物素大过量时（定反应，据报道，生物素大过量时（100100 g/Lg/L以以上），上），CO2CO2固定反应可提高固定反应可提高30%30%。2021/7/1328 生物素对CO2固定反应的影响2021/7/1328l 生物素对糖代谢速率的影响生物素对糖代谢速率的影响 生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽生物素充足条件下，丙酮酸以后的氧化活性虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出l 生物素对乙醛酸循环的影响生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。在低浓度生物素条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸环基本上是封闭的，代谢流向异柠檬酸-酮戊酮戊二酸二酸谷氨酸的方向高效率地移动。谷氨酸的方向高效率地移动。2021/7/1329 生物素对糖代谢速率的影响2021/7/1329l生物素控制磷脂的合成生物素控制磷脂的合成使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成从而控制磷脂的合成作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰反应的关键酶乙酰CoACoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到的合成，进而影响磷脂的合成。当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中出，积累于发酵液中2021/7/1330生物素控制磷脂的合成2021/7/1330p控制生物素添加量使菌种生产控制生物素添加量使菌种生产GluGlu 高浓度高浓度biobio增强羧化酶活性，促进羧化反应利增强羧化酶活性，促进羧化反应利于于GluGlu合成。低浓度合成。低浓度biobio降低裂解酶活性，使菌体降低裂解酶活性，使菌体生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向生长后关闭乙醛酸循环，使底物流向GluGlu合成，低合成，低浓度浓度biobio使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于使膜磷脂合成缺陷，增加膜通透性，利于GluGlu胞外分泌，解除反馈调节，利于胞外分泌，解除反馈调节，利于GluGlu合成并大合成并大量积累。量积累。添加亚适量，添加亚适量，5-10g/L 5-10g/L 培养基，生产培养基，生产GluGlu2021/7/1331控制生物素添加量使菌种生产Glu2021/7/1331 培养前期，培养前期，bio充足，存充足，存在乙醛酸循环，中间物质在乙醛酸循环，中间物质和能量充足，长细胞，膜和能量充足，长细胞，膜磷脂合成正常，正常反馈磷脂合成正常，正常反馈调节，不积累调节，不积累Glu，细胞，细胞形态正常。形态正常。8hrGlu非积累型细胞非积累型细胞Glu积累型细胞积累型细胞 培养中后期，培养中后期，bio浓度渐浓度渐低，乙醛酸途径减弱直至低，乙醛酸途径减弱直至关闭，膜磷脂合成缺陷，关闭，膜磷脂合成缺陷，膜透性增强，分泌膜透性增强，分泌Glu，解除反馈调节，大量积累解除反馈调节，大量积累Glu，细胞形态异常，未，细胞形态异常，未溶解。溶解。2021/7/1332 培养前期，bio充足，存在乙醛酸循环，中间物质和能量第五节第五节 Lys Lys代谢控制发酵代谢控制发酵1.1.生产菌种生产菌种 谷氨酸棒杆菌（谷氨酸棒杆菌（C.glutamicumC.glutamicum）黄色短杆菌黄色短杆菌(B.flavum)(B.flavum)乳糖发酵短杆菌乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)(B.lactofermentum)2 2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌LysLys合成途径及正常合成途径及正常调控机制调控机制 2021/7/1333第五节 Lys代谢控制发酵生产菌种2021/7/1333Asp 天冬氨酸Asp 激酶天冬氨酸-P天冬氨酸-半醛高丝氨酸二氢吡啶-2,6-二羧酸O-琥珀酰-高丝氨酸蛋氨酸(Met)高丝氨酸-P苏氨酸（Thr）异亮氨酸（Ile）Thr脱氢酶赖氨酸(Lys)Hse脱氢酶DDP合成酶合成酶2021/7/1334Asp 天冬氨酸Asp 激酶天冬氨酸-P天冬氨酸-半醛(1)Asp三分支途径优先合成三分支途径优先合成Met，后合成，后合成Thr、Ile，最后合成，最后合成Lys(2)Thr和和Lys对对Asp激酶有协同反馈抑制激酶有协同反馈抑制(3)Thr对对Hse脱氢酶有反馈抑制脱氢酶有反馈抑制(4)Ile对对Thr脱氢酶有反馈抑制脱氢酶有反馈抑制(5)Met对对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻遏2021/7/1335Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、Ile，最后合3.Lys 3.Lys 代谢控制发酵代谢控制发酵 菌种的遗传改造菌种的遗传改造(1)(1)切断支路代谢切断支路代谢HseHse营养缺陷型营养缺陷型(Hse(Hse-)菌株筛选菌株筛选 选育选育HseHse脱氢酶缺失的脱氢酶缺失的HseHse-菌株，使代谢流向菌株，使代谢流向LysLys合成，控制合成，控制HseHse添加量，既满足菌体对添加量，既满足菌体对MetMet、ThrThr和和IleIle生长需要又不形生长需要又不形ThrThr和和LysLys对对AspAsp激酶的协激酶的协同反馈抑制，积累同反馈抑制，积累LysLys(2)(2)用用HseHse-菌株选育解除菌株选育解除LysLys反馈抑制突变株反馈抑制突变株Hse-诱变诱变Hse-Lys反馈抑制反馈抑制Hse-抗抗Lys反馈抑制反馈抑制长出菌落长出菌落 (Hse-,AECr)基本培养基基本培养基Hse(高浓度高浓度)AEC(Lys结构类似物结构类似物)Hse-,AECr：解除：解除Lys对对Asp激酶反馈抑制的激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型营养缺陷型双突变株，不论添加双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协同协同反馈抑制，大量积累反馈抑制，大量积累Lys2021/7/13363.Lys 代谢控制发酵Hse-诱变Hse-Lys反馈抑制(3)Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株脱氢酶渗漏缺陷型突变株日本椎尾等人日本椎尾等人 黄色短杆菌黄色短杆菌 突变株突变株 亚硝基胍Hse脱氢酶活性仅为脱氢酶活性仅为 野生型菌株的野生型菌株的1/30Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长合成量很少，仅满足菌体生长代谢流转向代谢流转向Lys大量合成大量合成Thr合成量少，和合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，形不成协同反馈抑制，大量积累大量积累Lys，产量达，产量达25g/L2021/7/1337亚硝基胍Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/302021/(4)Lys 生产菌种遗传标记及生产菌种遗传标记及Lys产量产量谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌 Hse K.Nakyama 13g/LHseAECR 中山清（日本）中山清（日本）42g/L黄色短杆菌黄色短杆菌 HseAECRCSIFps I.shiio 51g/L(CSI:柠檬酸合成酶抑制；柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感：氟代丙酮酸敏感)黄色短杆菌黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维徐所维 50-55g/L钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌 pI-3-2 Hse-AECr 陈琦陈琦 50g/L2021/7/1338(4)Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量2021/7/1(5)乳糖发酵短杆菌乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、黄色合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌。短杆菌。特殊调控：代谢互锁调控机制特殊调控：代谢互锁调控机制 互锁调节：互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径产物反合成受其它氨基酸合成途径产物反馈调节馈调节Lys生产菌种遗传标记和产量：生产菌种遗传标记和产量：HseAECRLeu 110g/L（加（加Hse，限量加，限量加Leu，免除，免除Leu对对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节）合成酶反馈阻遏互锁调节）HseAECRLeu-TARAla 110g/L（加（加Hse、Leu，限量加，限量加Ala，-TA是是Leu结构类似物）结构类似物）2021/7/13392021/7/1339AspAsp激酶Asp-PAsp-半醛半醛HseMetThrLysIleDDP协同反馈抑制协同反馈抑制DDP还原酶DDP合成酶反馈抑制AlaLeu反馈阻遏2021/7/1340AspAsp激酶Asp-PAsp-半醛HseMetTh第六节第六节 产氨基酸菌种的分离、检测原理与方法产氨基酸菌种的分离、检测原理与方法1、营养缺陷型补充营养检测法、营养缺陷型补充营养检测法影印接种影印接种His产生菌产生菌大量大量UV照射照射细胞死亡细胞死亡鉴定生长区鉴定生长区丰富细菌丰富细菌培养基平板分离培养基平板分离产氨基酸培养基产氨基酸培养基基本培养基基本培养基E.coli His混合上层培养基混合上层培养基鉴定菌：鉴定菌：E.coli各种氨基酸营养缺陷型各种氨基酸营养缺陷型2021/7/1341第六节 产氨基酸菌种的分离、检测原理与方法影印接种His2、可逆抑制测定法、可逆抑制测定法-2-噻吩丙氨酸（噻吩丙氨酸（抑制剂抑制剂）L-苯丙氨酸（解除抑制剂）苯丙氨酸（解除抑制剂）培养基培养基枯草杆菌枯草杆菌（指示菌）（指示菌）生长生长不生长不生长 原理：指示菌在抑制剂存在条件下生长，证明存在解除抑制剂；原理：指示菌在抑制剂存在条件下生长，证明存在解除抑制剂；指示菌不生长，证明不存在解除抑制剂。用氨基酸的结构类似物作指指示菌不生长，证明不存在解除抑制剂。用氨基酸的结构类似物作指示菌生长抑制剂，通过指示菌是否生长而判断是否存在解除抑制剂氨示菌生长抑制剂，通过指示菌是否生长而判断是否存在解除抑制剂氨基酸。基酸。上层培养基上层培养基有指示菌有指示菌影印接种影印接种有抑制剂有抑制剂L-丙氨酸产生菌丙氨酸产生菌枯草杆菌生长区枯草杆菌生长区丰富细菌丰富细菌培养基平板分离培养基平板分离产氨基酸培养基产氨基酸培养基枯草杆菌生长区对枯草杆菌生长区对应菌落目的菌应菌落目的菌2021/7/13422、可逆抑制测定法-2-噻吩丙氨酸（抑制剂）培养基枯草杆可逆抑制测定方法：可逆抑制测定方法：根据特异性解除抑制剂对指示菌生长抑制，让指示菌生长而根据特异性解除抑制剂对指示菌生长抑制，让指示菌生长而检测氨基酸的方法检测氨基酸的方法 适用于检测氨基酸的可逆性抑制剂测定法适用于检测氨基酸的可逆性抑制剂测定法被被检测氨氨基酸基酸抑制抑制剂指示菌指示菌AlaL-氨基乙基磺酸氨基乙基磺酸普通普通变形杆菌形杆菌Arg高高丝氨酸氨酸E.coli BAsp羟基天冬氨酸基天冬氨酸胚芽乳杆菌胚芽乳杆菌ATCC 8014Leu2-氨基氨基-4-甲基乙酸甲基乙酸E.coli ATCC 9723Ser氨基氨基丝氨酸氨酸啤酒足球菌啤酒足球菌ATCC 80422021/7/1343可逆抑制测定方法：被检测氨基酸抑制剂指示菌AlaL-氨基乙基总总 结结 氨基酸高产菌株代谢控制发酵基本规律氨基酸高产菌株代谢控制发酵基本规律1 1、以合成途径与代谢调控为理论依据、以合成途径与代谢调控为理论依据2 2、三类常用突变株、三类常用突变株 营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株 解除反馈调节突变株解除反馈调节突变株 膜透性突变株膜透性突变株 生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素或生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素或生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素或生物素缺陷型、甘油缺陷型、油酸缺陷型、青霉素或 表面活性剂处理表面活性剂处理表面活性剂处理表面活性剂处理2021/7/1344总 结 氨基酸高产菌株代谢控制发酵基本规律1、以合思考题思考题p控制代谢发酵的基本方法控制代谢发酵的基本方法2021/7/1345思考题控制代谢发酵的基本方法2021/7/1345问题？问题？问题？