新技术在医学实验中的应用优质课件

新技术在医新技术在医学实验中的学实验中的应用应用新技术在医学实验中的应用1内容提纲内容提纲一实验方法介绍一实验方法介绍检测蛋白表达水平方法：检测蛋白表达水平方法：Westernblot,2D-gel,免免疫共沉淀，疫共沉淀，Shotgun，免疫组化，流式细胞测定，免疫组化，流式细胞测定，激光扫描共聚焦显微激光扫描共聚焦显微激光扫描共聚焦显微激光扫描共聚焦显微，绿荧光蛋白标记法，萤光，绿荧光蛋白标记法，萤光素酶标记法，素酶标记法，ELISA.检测检测DNA/RNA表达水平方法：表达水平方法：Southernblot,Northernblot,原位杂交原位杂交,PCR.基因操作方法基因操作方法:基因敲除，基因沉默基因敲除，基因沉默.内容提纲一实验方法介绍2内容提纲内容提纲二实用技术介绍二实用技术介绍细胞活性检测：细胞活性检测：MTT,MTS，CCK-8,Calcein-AM.细胞凋亡检测：细胞凋亡检测：Westernblot,流式，流式，TUNEL,Hoechst33258，DNAladder.活性氧自由基（活性氧自由基（ROS）检测：）检测：DCF,SOD,GSH,ESR.内容提纲二实用技术介绍3Westernblot原理：原理：原理：原理：WesternblotWesternblot利用了利用了利用了利用了蛋白质的理化性质。蛋白质的理化性质。蛋白质的理化性质。蛋白质的理化性质。在一定在一定在一定在一定pHpH的缓冲液的缓冲液的缓冲液的缓冲液中，特定的蛋白质具中，特定的蛋白质具中，特定的蛋白质具中，特定的蛋白质具有固定的电荷数。在有固定的电荷数。在有固定的电荷数。在有固定的电荷数。在电场的作用下，蛋白电场的作用下，蛋白电场的作用下，蛋白电场的作用下，蛋白质将按质将按质将按质将按电荷数电荷数电荷数电荷数及及及及蛋白蛋白蛋白蛋白质分子量大小质分子量大小质分子量大小质分子量大小在凝胶在凝胶在凝胶在凝胶中分布。中分布。中分布。中分布。SDS-PAGESDS-PAGE法的法的法的法的WesternblotWesternblot进一步简进一步简进一步简进一步简化，化，化，化，SDSSDS的应用使得所的应用使得所的应用使得所的应用使得所有的蛋白都带均匀的负有的蛋白都带均匀的负有的蛋白都带均匀的负有的蛋白都带均匀的负电荷，此时蛋白电泳的电荷，此时蛋白电泳的电荷，此时蛋白电泳的电荷，此时蛋白电泳的距离只与距离只与距离只与距离只与蛋白分子量大蛋白分子量大蛋白分子量大蛋白分子量大小小小小有关。有关。有关。有关。Westernblot原理：4Westernblot原理：原理：原理：原理：凝胶是由聚凝胶是由聚凝胶是由聚凝胶是由聚丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺丙烯酰胺组成，聚丙烯酰胺的浓组成，聚丙烯酰胺的浓组成，聚丙烯酰胺的浓组成，聚丙烯酰胺的浓度决定了胶中孔径的大度决定了胶中孔径的大度决定了胶中孔径的大度决定了胶中孔径的大小，孔径越大，蛋白运小，孔径越大，蛋白运小，孔径越大，蛋白运小，孔径越大，蛋白运动越容易，越快，对大动越容易，越快，对大动越容易，越快，对大动越容易，越快，对大分子量的蛋白的分离效分子量的蛋白的分离效分子量的蛋白的分离效分子量的蛋白的分离效果好。反之亦然。测定果好。反之亦然。测定果好。反之亦然。测定果好。反之亦然。测定大分子量蛋白（大分子量蛋白（大分子量蛋白（大分子量蛋白（）时宜用）时宜用）时宜用）时宜用低浓度低浓度低浓度低浓度胶，胶，胶，胶，测定小分子量蛋白（测定小分子量蛋白（测定小分子量蛋白（测定小分子量蛋白（）时宜用）时宜用）时宜用）时宜用高浓度高浓度高浓度高浓度胶。另有梯度胶（例如胶。另有梯度胶（例如胶。另有梯度胶（例如胶。另有梯度胶（例如），可以保），可以保），可以保），可以保证在一定范围内的蛋白证在一定范围内的蛋白证在一定范围内的蛋白证在一定范围内的蛋白都相对均匀分离。都相对均匀分离。都相对均匀分离。都相对均匀分离。Westernblot原理：5转膜方法主要分为湿转转膜方法主要分为湿转转膜方法主要分为湿转转膜方法主要分为湿转(Wettransfer)(Wettransfer)和半干转（和半干转（和半干转（和半干转（Semi-drytransferSemi-drytransfer）。湿转速度）。湿转速度）。湿转速度）。湿转速度较慢，操作难度较大，易出现气泡，但转膜效率高，特别对大分子量蛋白效果好。较慢，操作难度较大，易出现气泡，但转膜效率高，特别对大分子量蛋白效果好。较慢，操作难度较大，易出现气泡，但转膜效率高，特别对大分子量蛋白效果好。较慢，操作难度较大，易出现气泡，但转膜效率高，特别对大分子量蛋白效果好。半干转的特点与湿转正好相反，对大分子量蛋白容易转不上。半干转的特点与湿转正好相反，对大分子量蛋白容易转不上。半干转的特点与湿转正好相反，对大分子量蛋白容易转不上。半干转的特点与湿转正好相反，对大分子量蛋白容易转不上。根据实际情况选择。根据实际情况选择。根据实际情况选择。根据实际情况选择。转膜方法主要分为湿转(Wettransfer)和半干转（S6新技术在医学实验中的应用优质课件7Westernblot电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（NCNCNCNC膜或者膜或者膜或者膜或者PVDFPVDFPVDFPVDF膜）上，固膜）上，固膜）上，固膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。膜上的非特异性结合位点需使用脱脂牛奶等及其生物学活性不变。膜上的非特异性结合位点需使用脱脂牛奶等及其生物学活性不变。膜上的非特异性结合位点需使用脱脂牛奶等及其生物学活性不变。膜上的非特异性结合位点需使用脱脂牛奶等封闭，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免封闭，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免封闭，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免封闭，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶疫反应，再与酶疫反应，再与酶疫反应，再与酶,同位素或者荧光标记的第二抗体起反应，经过底同位素或者荧光标记的第二抗体起反应，经过底同位素或者荧光标记的第二抗体起反应，经过底同位素或者荧光标记的第二抗体起反应，经过底物显色物显色物显色物显色,放射自显影或荧光成像以检测电泳分离的特异性目的基因放射自显影或荧光成像以检测电泳分离的特异性目的基因放射自显影或荧光成像以检测电泳分离的特异性目的基因放射自显影或荧光成像以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。表达的蛋白成分。表达的蛋白成分。表达的蛋白成分。Westernblot电泳完成后，蛋白质被转移到固相载体（8示例实验步骤：示例实验步骤：示例实验步骤：示例实验步骤：蛋白质抽提蛋白质抽提蛋白质抽提蛋白质抽提 蛋白浓度测定蛋白浓度测定蛋白浓度测定蛋白浓度测定 ：按试剂盒说明书，用按试剂盒说明书，用按试剂盒说明书，用按试剂盒说明书，用BCABCA法测定蛋白浓度法测定蛋白浓度法测定蛋白浓度法测定蛋白浓度。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGESDS-PAGE)：玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；根据浓度取适量玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；根据浓度取适量玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；根据浓度取适量玻璃板夹槽中依次加入分离胶和浓缩胶，待其凝固；根据浓度取适量待测蛋白与待测蛋白与待测蛋白与待测蛋白与5x5x上样缓冲液混匀后上样缓冲液混匀后上样缓冲液混匀后上样缓冲液混匀后,95,95度变性度变性度变性度变性1010分钟分钟分钟分钟,加入上样孔中，浸加入上样孔中，浸加入上样孔中，浸加入上样孔中，浸于电泳缓冲液，以于电泳缓冲液，以于电泳缓冲液，以于电泳缓冲液，以75V75V（浓缩胶）及（浓缩胶）及（浓缩胶）及（浓缩胶）及120V120V（分离胶）恒压电泳。（分离胶）恒压电泳。（分离胶）恒压电泳。（分离胶）恒压电泳。转膜转膜转膜转膜 ：裁切与凝胶同样大小的裁切与凝胶同样大小的裁切与凝胶同样大小的裁切与凝胶同样大小的NCNC膜和滤纸，膜和滤纸，膜和滤纸，膜和滤纸，NCNC膜置于转膜缓冲液中浸泡膜置于转膜缓冲液中浸泡膜置于转膜缓冲液中浸泡膜置于转膜缓冲液中浸泡30min30min以上。按顺序依次放置滤纸、凝胶、以上。按顺序依次放置滤纸、凝胶、以上。按顺序依次放置滤纸、凝胶、以上。按顺序依次放置滤纸、凝胶、NCNC膜、滤纸，半干法以膜、滤纸，半干法以膜、滤纸，半干法以膜、滤纸，半干法以40mA40mA恒流转膜恒流转膜恒流转膜恒流转膜 2h2h。示例实验步骤：9抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应抗原抗体反应:蛋白质以脱脂牛奶封闭蛋白质以脱脂牛奶封闭蛋白质以脱脂牛奶封闭蛋白质以脱脂牛奶封闭1h1h后，与一抗后，与一抗后，与一抗后，与一抗44孵育过夜，与二抗室温孵育孵育过夜，与二抗室温孵育孵育过夜，与二抗室温孵育孵育过夜，与二抗室温孵育1h1h，TBSTTBST洗涤洗涤洗涤洗涤4 4次，每次次，每次次，每次次，每次5min5min。显色显色显色显色:加入加入加入加入DABDAB显色显色显色显色5min5min，蒸馏水洗终止显色。凝胶分析软件，蒸馏水洗终止显色。凝胶分析软件，蒸馏水洗终止显色。凝胶分析软件，蒸馏水洗终止显色。凝胶分析软件QuantityoneQuantityone测灰度值。测灰度值。测灰度值。测灰度值。显色系统多种多样。传统的二显色系统多种多样。传统的二显色系统多种多样。传统的二显色系统多种多样。传统的二抗通常是与辣根过氧化酶结合抗通常是与辣根过氧化酶结合抗通常是与辣根过氧化酶结合抗通常是与辣根过氧化酶结合的抗体，遇的抗体，遇的抗体，遇的抗体，遇DABDAB显色或者与专显色或者与专显色或者与专显色或者与专用试剂盒试剂反应使胶片曝光。用试剂盒试剂反应使胶片曝光。用试剂盒试剂反应使胶片曝光。用试剂盒试剂反应使胶片曝光。新型二抗与荧光物质结合，在新型二抗与荧光物质结合，在新型二抗与荧光物质结合，在新型二抗与荧光物质结合，在专用的荧光成像仪下读取荧光专用的荧光成像仪下读取荧光专用的荧光成像仪下读取荧光专用的荧光成像仪下读取荧光印迹，可以方便地进行多通道印迹，可以方便地进行多通道印迹，可以方便地进行多通道印迹，可以方便地进行多通道western blot(multiplex western blot(multiplex western blot(multiplex western blot(multiplex western blotting),western blotting),western blotting),western blotting),免去切膜免去切膜免去切膜免去切膜或者抗体清除的步骤或者抗体清除的步骤或者抗体清除的步骤或者抗体清除的步骤.抗原抗体反应:显色系统多种多样。传统的二抗通常是与辣根102D-Gel2D-Gel11免疫共沉淀免疫共沉淀是一种着重检测蛋白是一种着重检测蛋白-蛋白或蛋白蛋白或蛋白-核酸间核酸间联系的方法。联系的方法。基本原理是利用抗原抗体结合基本原理是利用抗原抗体结合,以及与抗体以及与抗体相连的小珠（相连的小珠（Beads）,以物理方式将目标以物理方式将目标蛋白连同与其相结合的物质分离出来单独蛋白连同与其相结合的物质分离出来单独分析。分析。分离后，解离蛋白，以分离后，解离蛋白，以Westernblot的方式的方式检测潜在目标的水平，即可得知目标间在检测潜在目标的水平，即可得知目标间在细胞中是否有紧密联系。细胞中是否有紧密联系。免疫共沉淀是一种着重检测蛋白-蛋白或蛋白-核酸间联系的方法。12免疫共沉淀免疫共沉淀免疫共沉淀13Chromatinimmunoprecipitation（CHIP）染色质免疫沉淀，与蛋白的共沉淀相染色质免疫沉淀，与蛋白的共沉淀相似，不同之处是利用甲醛等产生似，不同之处是利用甲醛等产生DNADNA与其上蛋白质的交联，从而用带小珠与其上蛋白质的交联，从而用带小珠的抗体将蛋白质与的抗体将蛋白质与DNADNA一起一起“拉下拉下”，用，用PCRPCR检测拉下的检测拉下的DNA.DNA.Chromatinimmunoprecipitation14“猎枪猎枪”法法（Shotgunproteomic）“猎枪”法（Shotgunproteomic）15免疫组化免疫组化Immunohistochemistry原理类似原理类似Westernblot，但直接在组织切片，但直接在组织切片（或在满足一定条件的情况下，整个组织）（或在满足一定条件的情况下，整个组织）上进行，保留了原始组织结构，能提供更上进行，保留了原始组织结构，能提供更多的信息。多的信息。缺点：费时，目标蛋白表达不高时不易检缺点：费时，目标蛋白表达不高时不易检测到，量化统计不易。测到，量化统计不易。免疫组化Immunohistochemistry原理类似W16新技术在医学实验中的应用优质课件17新技术在医学实验中的应用优质课件18免疫组化样本制备免疫组化样本制备通常来讲，免疫组化用的样本为组织切片（几微米厚）通常来讲，免疫组化用的样本为组织切片（几微米厚）.足够小且能被完全通透化（足够小且能被完全通透化（Permeabilize)的组织可以直的组织可以直接做在位免疫组化，但应用不如原位杂交来得广泛。接做在位免疫组化，但应用不如原位杂交来得广泛。冷冻切片信号较好，但受时间，地点，存放条件等限制。冷冻切片信号较好，但受时间，地点，存放条件等限制。石蜡切片具有储存，使用方便等优点，但需要抗原修复方石蜡切片具有储存，使用方便等优点，但需要抗原修复方可进行免疫组化染色，且效果一般差于冷冻切片。可进行免疫组化染色，且效果一般差于冷冻切片。免疫组化样本制备通常来讲，免疫组化用的样本为组织切片（几微米19免疫组化的抗体使用免疫组化的抗体使用免疫组化中使用的一抗通常与免疫组化中使用的一抗通常与Westernblot中用的相同。中用的相同。二抗被设计成与一抗的宿主结合的抗体，一般结合有探测二抗被设计成与一抗的宿主结合的抗体，一般结合有探测用分子，免疫组化中常用的是生物素（用分子，免疫组化中常用的是生物素（biotin）。）。一抗宿主一般不能与实验所用组织同种，但必要时也有专一抗宿主一般不能与实验所用组织同种，但必要时也有专用试剂可以允许这种应用用试剂可以允许这种应用 例子：例子：MOM （MouseonMouse)Kit。免疫组化的抗体使用免疫组化中使用的一抗通常与Western20不同的探测方法不同的探测方法直接探测法：直接标记一抗，不需使用二直接探测法：直接标记一抗，不需使用二抗来探测目标蛋白表达水平，最简单但敏抗来探测目标蛋白表达水平，最简单但敏感度最差，基本已不用。感度最差，基本已不用。间接探测法：一抗没有标记，然后用抗一间接探测法：一抗没有标记，然后用抗一抗的二抗来间接探测目标蛋白表达水平。抗的二抗来间接探测目标蛋白表达水平。有信号放大作用，敏感度好，节省试剂。有信号放大作用，敏感度好，节省试剂。不同的探测方法直接探测法：直接标记一抗，不需使用二抗来探测目21间接探测法介绍：间接探测法介绍：PAP法法PAP:peroxidaseanti-peroxidasemethodPAP法使用未标记的一抗和二抗，之后加入第三层的探针：法使用未标记的一抗和二抗，之后加入第三层的探针：peroxidaseperoxidase及其抗体，且抗体的抗原性与一抗相同，都与及其抗体，且抗体的抗原性与一抗相同，都与二抗相结合。如此以二抗为中心形成二抗相结合。如此以二抗为中心形成“三明治三明治”结构。结构。间接探测法介绍：PAP法PAP:peroxidasean22Avidin-BiotinComplex(ABC)法法免疫组化最常用方法之一。免疫组化最常用方法之一。也是形成也是形成“三明治三明治”样结构，使用未标记的一抗，生物素样结构，使用未标记的一抗，生物素（biotin）标记的二抗，生物素标记的）标记的二抗，生物素标记的peroxidase以及生以及生物素结合蛋白（物素结合蛋白（Avidin）。）。需要封闭内源性的需要封闭内源性的 peroxidase。必要时，封闭内源性必要时，封闭内源性 的的biotin。Avidin-BiotinComplex(ABC)法免23LabeledStreptavidinBiotin(LSAB)法法与与ABC法相似，但使用法相似，但使用Strptavidin替换一替换一般的生物素结合蛋白，其与组织的非特异般的生物素结合蛋白，其与组织的非特异性结合较少，因此可以降低背景。性结合较少，因此可以降低背景。LabeledStreptavidinBiotin(L24新技术在医学实验中的应用优质课件25免疫组化中的注意要点免疫组化中的注意要点样本的准备样本的准备封闭（非特异性蛋白质结合位点，内源性封闭（非特异性蛋白质结合位点，内源性的的peroxidase，内源性的，内源性的biotin）抗体浓度抗体浓度培养温度培养温度显色时间显色时间 免疫组化中的注意要点样本的准备26流式细胞仪流式细胞仪1 1 1 1 实验原理实验原理实验原理实验原理:流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪(FlowCytometer)是采用流式细胞技术对细胞或颗粒悬液进行是采用流式细胞技术对细胞或颗粒悬液进行快速分析的自动化分析仪器。流式细胞术（快速分析的自动化分析仪器。流式细胞术（FlowCytometry)是上世纪是上世纪70年年代发展起来的一项新技术。它通过对流动液体中排成单列的细胞或颗粒进行代发展起来的一项新技术。它通过对流动液体中排成单列的细胞或颗粒进行逐个分析、测定细胞或颗粒的光散射和荧光情况，以获得其大小、内部结构、逐个分析、测定细胞或颗粒的光散射和荧光情况，以获得其大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理或化学特征。、蛋白质、抗原等物理或化学特征。要求细胞悬浮在培养基中。对于贴壁细胞，需要先将其游离出来，有一定损要求细胞悬浮在培养基中。对于贴壁细胞，需要先将其游离出来，有一定损伤。伤。流式细胞仪1实验原理:27流式细胞仪应用举例流式细胞仪应用举例流式细胞仪应用举例流式细胞仪应用举例细胞凋亡、死亡的检测细胞凋亡、死亡的检测细胞凋亡、死亡的检测细胞凋亡、死亡的检测-AnnexinV/PIAnnexinV/PI双染色法双染色法双染色法双染色法 1 1原理原理原理原理细胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性的降低使磷脂酰细胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性的降低使磷脂酰细胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性的降低使磷脂酰细胞凋亡的早期生化特征之一是氨基磷脂转移酶活性的降低使磷脂酰丝氨酸丝氨酸丝氨酸丝氨酸(Phosphatdylserine)(Phosphatdylserine)“翻到翻到翻到翻到”细胞膜的外层。荧光标记细胞膜的外层。荧光标记细胞膜的外层。荧光标记细胞膜的外层。荧光标记AnnexinAnnexinV-FITC(AV)V-FITC(AV)和碘化丙啶和碘化丙啶和碘化丙啶和碘化丙啶(propidumiodide,PI)(propidumiodide,PI)双染可区分细胞凋亡和双染可区分细胞凋亡和双染可区分细胞凋亡和双染可区分细胞凋亡和坏死坏死坏死坏死,对对对对AVAV和和和和PIPI均不染色的是正常细胞均不染色的是正常细胞均不染色的是正常细胞均不染色的是正常细胞,对对对对AVAV染色对染色对染色对染色对PIPI不染色的为早不染色的为早不染色的为早不染色的为早期凋亡细胞期凋亡细胞期凋亡细胞期凋亡细胞,对对对对AVAV和和和和PIPI均染色的为晚期凋亡细胞或坏死细胞。均染色的为晚期凋亡细胞或坏死细胞。均染色的为晚期凋亡细胞或坏死细胞。均染色的为晚期凋亡细胞或坏死细胞。2 2结果判断结果判断结果判断结果判断凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PIPI有抗染性，坏死细胞则有抗染性，坏死细胞则有抗染性，坏死细胞则有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的不能。细胞膜有损伤的细胞的不能。细胞膜有损伤的细胞的不能。细胞膜有损伤的细胞的DNADNA可被可被可被可被PIPI着染产生红色荧光，而细胞着染产生红色荧光，而细胞着染产生红色荧光，而细胞着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PIPI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-FITC-/PI-）；右上）；右上）；右上）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（象限是非活细胞，即坏死细胞，为（象限是非活细胞，即坏死细胞，为（象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+FITC+/PI+）；而右下象限为凋）；而右下象限为凋）；而右下象限为凋）；而右下象限为凋亡细胞，显现（亡细胞，显现（亡细胞，显现（亡细胞，显现（FITC+/PI-FITC+/PI-）。）。）。）。流式细胞仪应用举例28新技术在医学实验中的应用优质课件29 Ca2+iCa2+i的检测的检测的检测的检测 Fluo-3-AMFluo-3-AM荧光荧光荧光荧光 染色染色染色染色原理原理原理原理用荧光探针用荧光探针用荧光探针用荧光探针Fluo-3-AMFluo-3-AM进入细胞后经非特异性酯酶水解为进入细胞后经非特异性酯酶水解为进入细胞后经非特异性酯酶水解为进入细胞后经非特异性酯酶水解为Fluo-3,Fluo-3,后者是钙离子螯合剂后者是钙离子螯合剂后者是钙离子螯合剂后者是钙离子螯合剂,与钙离子形成的复合物经紫外激发可产生荧与钙离子形成的复合物经紫外激发可产生荧与钙离子形成的复合物经紫外激发可产生荧与钙离子形成的复合物经紫外激发可产生荧光光光光,流式细胞仪通过检测其荧光强度而间接反映胞内游离钙水平。流式细胞仪通过检测其荧光强度而间接反映胞内游离钙水平。流式细胞仪通过检测其荧光强度而间接反映胞内游离钙水平。流式细胞仪通过检测其荧光强度而间接反映胞内游离钙水平。人参皂苷人参皂苷人参皂苷人参皂苷(saponin)(saponin)降低缺氧的心肌细胞中的钙超载降低缺氧的心肌细胞中的钙超载降低缺氧的心肌细胞中的钙超载降低缺氧的心肌细胞中的钙超载。Lietal.TheLietal.Thesaponinofredginsengprotectsthecardiacmyocytesagainstischemicsaponinofredginsengprotectsthecardiacmyocytesagainstischemicinjuryinvitroandinvivo,Phytomedicine,19(6)477-483injuryinvitroandinvivo,Phytomedicine,19(6)477-483Ca2+i的检测Fluo-3-AM荧光染色人参皂30线粒体膜电位（线粒体膜电位（线粒体膜电位（线粒体膜电位（）的测定）的测定）的测定）的测定rhodanmine123rhodanmine123荧光染色荧光染色荧光染色荧光染色原理原理原理原理氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功能改变氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功能改变氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功能改变氧化刺激诱导细胞凋亡可致线粒体两种功能改变:一是线粒体膜电位降低和一是线粒体膜电位降低和一是线粒体膜电位降低和一是线粒体膜电位降低和线粒体通透性孔开放线粒体通透性孔开放线粒体通透性孔开放线粒体通透性孔开放,二是线粒体产生活性氧。线粒体对二是线粒体产生活性氧。线粒体对二是线粒体产生活性氧。线粒体对二是线粒体产生活性氧。线粒体对rhodanmine123rhodanmine123的的的的摄取依赖其膜电位摄取依赖其膜电位摄取依赖其膜电位摄取依赖其膜电位,分析分析分析分析rhodanmine123rhodanmine123的荧光强度可反映线粒体的膜电位。的荧光强度可反映线粒体的膜电位。的荧光强度可反映线粒体的膜电位。的荧光强度可反映线粒体的膜电位。Black:control,Purple:UVBmodel,Yellow:UVB+0.25%PCF,Red:UVB+0.5%PCF,Blue:UVB+1%PCF,Green:UVB+0.1%VitC.线粒体膜电位（）的测定rhodanmine12331激光扫描共聚焦显微激光扫描共聚焦显微(ConfocalLaserScanningMicroscopy，CLSM）1 1 1 1 基本原理基本原理基本原理基本原理激光共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动分激光共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动分激光共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动分激光共聚焦显微镜是近年来发展起来的一种结合激光扫描、计算机自动分析与显微镜技术的新技术，新仪器。它采用计算机自动定量分析被激光扫析与显微镜技术的新技术，新仪器。它采用计算机自动定量分析被激光扫析与显微镜技术的新技术，新仪器。它采用计算机自动定量分析被激光扫析与显微镜技术的新技术，新仪器。它采用计算机自动定量分析被激光扫描的物体所激发出的荧光数量的变化，具有图像清晰、特异性高、敏感性强、描的物体所激发出的荧光数量的变化，具有图像清晰、特异性高、敏感性强、描的物体所激发出的荧光数量的变化，具有图像清晰、特异性高、敏感性强、描的物体所激发出的荧光数量的变化，具有图像清晰、特异性高、敏感性强、可精确定量等优点。可精确定量等优点。可精确定量等优点。可精确定量等优点。2 2 2 2 优点优点优点优点激光共聚焦显微镜做间接免疫荧光组化染色并做定量分析，利用激光聚焦激光共聚焦显微镜做间接免疫荧光组化染色并做定量分析，利用激光聚焦激光共聚焦显微镜做间接免疫荧光组化染色并做定量分析，利用激光聚焦激光共聚焦显微镜做间接免疫荧光组化染色并做定量分析，利用激光聚焦荧光标记和系统软件分析对组织进行深层与断层扫描，不破坏组织细胞的荧光标记和系统软件分析对组织进行深层与断层扫描，不破坏组织细胞的荧光标记和系统软件分析对组织进行深层与断层扫描，不破坏组织细胞的荧光标记和系统软件分析对组织进行深层与断层扫描，不破坏组织细胞的结构，可准确深层次定位和精确定量，是转化了的精确定量分析。结构，可准确深层次定位和精确定量，是转化了的精确定量分析。结构，可准确深层次定位和精确定量，是转化了的精确定量分析。结构，可准确深层次定位和精确定量，是转化了的精确定量分析。激光扫描共聚焦显微(ConfocalLaserScann32激光共聚焦显微镜一般都有激光共聚焦显微镜一般都有激光共聚焦显微镜一般都有激光共聚焦显微镜一般都有2 2 2 2个以上不同波长的激光管，因此个以上不同波长的激光管，因此个以上不同波长的激光管，因此个以上不同波长的激光管，因此只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时只要将标本标记上不同波长的荧光，就可以在同一张切片上同时分析分析分析分析2 2 2 2种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，种或更多不同指标的变化，并比较它们之间的比值变化，方便而精确。方便而精确。方便而精确。方便而精确。激光共聚焦显微镜可以根据科研需要，提供纯荧光、白光、以激光共聚焦显微镜可以根据科研需要，提供纯荧光、白光、以激光共聚焦显微镜可以根据科研需要，提供纯荧光、白光、以激光共聚焦显微镜可以根据科研需要，提供纯荧光、白光、以及荧光与白光合成的图像等多种图像。及荧光与白光合成的图像等多种图像。及荧光与白光合成的图像等多种图像。及荧光与白光合成的图像等多种图像。以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片以往免疫荧光染色多要求冰冻新鲜组织标本，如用石蜡切片做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性做免疫荧光染色，在普通荧光显微镜下观察，常因背景非特异性荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切荧光过强而影响观察结果。但如用激光共聚焦显微镜扫描石蜡切片的荧光染色，可获得清晰的图像。片的荧光染色，可获得清晰的图像。片的荧光染色，可获得清晰的图像。片的荧光染色，可获得清晰的图像。激光共聚焦显微镜一般都有2个以上不同波长的激光管，因此只要333 3应用应用应用应用定性定量定位荧光分析定性定量定位荧光分析定性定量定位荧光分析定性定量定位荧光分析:CLSMCLSM可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位可对单、双或三色标记的细胞及组织标本的荧光进行定性定量定位分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。分析，还可测定膜电位和配体结合等生化反应程度。CaCaCaCa2 2 2 2 和和和和pHpHpHpH等细胞内离子的实时定量测定等细胞内离子的实时定量测定等细胞内离子的实时定量测定等细胞内离子的实时定量测定:利用利用利用利用Fluo-3Fluo-3、Fura2Fura2等荧光探针，等荧光探针，等荧光探针，等荧光探针，CLSMCLSM可以测定可以测定可以测定可以测定CaCa22在活细胞内的浓度变在活细胞内的浓度变在活细胞内的浓度变在活细胞内的浓度变化。化。化。化。CLSMCLSM可测定单个或一群细胞内的可测定单个或一群细胞内的可测定单个或一群细胞内的可测定单个或一群细胞内的ca2ca2浓度，并提供细胞内浓度，并提供细胞内浓度，并提供细胞内浓度，并提供细胞内CaCa22分布分布分布分布的二维及至三维图像。另外，如果对细胞施加外部的刺激，的二维及至三维图像。另外，如果对细胞施加外部的刺激，的二维及至三维图像。另外，如果对细胞施加外部的刺激，的二维及至三维图像。另外，如果对细胞施加外部的刺激，CLSMCLSM就能观就能观就能观就能观察到细胞内各点的察到细胞内各点的察到细胞内各点的察到细胞内各点的CaCa2 2 浓度在外部刺激下随时间而产生的变化。这对于研浓度在外部刺激下随时间而产生的变化。这对于研浓度在外部刺激下随时间而产生的变化。这对于研浓度在外部刺激下随时间而产生的变化。这对于研究究究究CaCa2 2 等离子细胞内动力学有意义。利用等离子细胞内动力学有意义。利用等离子细胞内动力学有意义。利用等离子细胞内动力学有意义。利用SNAFLSNAFL类探针可对单个或一群细类探针可对单个或一群细类探针可对单个或一群细类探针可对单个或一群细胞内的胞内的胞内的胞内的pHpH及细胞内及细胞内及细胞内及细胞内pHpH的变化进行测定。使用双荧光探针的变化进行测定。使用双荧光探针的变化进行测定。使用双荧光探针的变化进行测定。使用双荧光探针FluoFluo一一一一3 3和和和和CNARFCNARF可进行可进行可进行可进行CaCa2 2 和和和和pHpH同时测定。同时测定。同时测定。同时测定。细胞的物理化学动态监测：细胞的物理化学动态监测：细胞的物理化学动态监测：细胞的物理化学动态监测：CLSMCLSM可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗粒数等参数进行自动测定，能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性进行自动测定，能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性进行自动测定，能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性进行自动测定，能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质、DNADNA、RNARNA、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及、酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。分布进行定量、定性、定时及定位测定。分布进行定量、定性、定时及定位测定。分布进行定量、定性、定时及定位测定。3应用34药理研究中的应用：药理研究中的应用：药理研究中的应用：药理研究中的应用：CLSMCLSM可直接观察药物在细胞内亚细胞水平的分布，并可了解药物对细胞内结可直接观察药物在细胞内亚细胞水平的分布，并可了解药物对细胞内结可直接观察药物在细胞内亚细胞水平的分布，并可了解药物对细胞内结可直接观察药物在细胞内亚细胞水平的分布，并可了解药物对细胞内结构的特殊亲和力及其药物作用，从而推断细胞内药物定位及细胞耐药的相关机制，构的特殊亲和力及其药物作用，从而推断细胞内药物定位及细胞耐药的相关机制，构的特殊亲和力及其药物作用，从而推断细胞内药物定位及细胞耐药的相关机制，构的特殊亲和力及其药物作用，从而推断细胞内药物定位及细胞耐药的相关机制，还可了解其在细胞内代谢的过程。还可了解其在细胞内代谢的过程。还可了解其在细胞内代谢的过程。还可了解其在细胞内代谢的过程。例例例例CLSMCLSM可直接观察扇贝多肽（可直接观察扇贝多肽（可直接观察扇贝多肽（可直接观察扇贝多肽（PCFPCF）在细胞的定位。）在细胞的定位。）在细胞的定位。）在细胞的定位。异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITCFITC）标记）标记）标记）标记PCFPCF，显微镜下确定，显微镜下确定，显微镜下确定，显微镜下确定PCFPCF作用位点在细胞膜上。作用位点在细胞膜上。作用位点在细胞膜上。作用位点在细胞膜上。图图图图3PCF3PCF保护保护保护保护HaCaTHaCaT细胞的最初作用靶点细胞的最初作用靶点细胞的最初作用靶点细胞的最初作用靶点药理研究中的应用：图3PCF保护HaCaT细胞的最初作35激光显微细胞外科技术：激光显微细胞外科技术：激光显微细胞外科技术：激光显微细胞外科技术：CLSMCLSMCLSMCLSM可将激光作为可将激光作为可将激光作为可将激光作为“光子刀光子刀光子刀光子刀”使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，线粒体、溶酶体等使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，线粒体、溶酶体等使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，线粒体、溶酶体等使用，完成诸如细胞膜瞬间穿孔，线粒体、溶酶体等细胞器烧灼，染色体精确切割和神经元突起切除等一系列细胞外科术。细胞器烧灼，染色体精确切割和神经元突起切除等一系列细胞外科术。细胞器烧灼，染色体精确切割和神经元突起切除等一系列细胞外科术。细胞器烧灼，染色体精确切割和神经元突起切除等一系列细胞外科术。在亚细胞定位研究中的应用：在亚细胞定位研究中的应用：在亚细胞定位研究中的应用：在亚细胞定位研究中的应用：经荧光探针标记细胞器，经荧光探针标记细胞器，经荧光探针标记细胞器，经荧光探针标记细胞器，CLSMCLSM可探测光敏剂和探针荧光图像，实现对光敏剂在细可探测光敏剂和探针荧光图像，实现对光敏剂在细可探测光敏剂和探针荧光图像，实现对光敏剂在细可探测光敏剂和探针荧光图像，实现对光敏剂在细胞内的亚细胞定位，并进行定性和定量分析。胞内的亚细胞定位，并进行定性和定量分析。胞内的亚细胞定位，并进行定性和定量分析。胞内的亚细胞定位，并进行定性和定量分析。在药物抗肿瘤活性研究中的应用：在药物抗肿瘤活性研究中的应用：在药物抗肿瘤活性研究中的应用：在药物抗肿瘤活性研究中的应用：利用利用利用利用CLSMCLSM观察细胞形态，记录细胞的荧光程度，以细胞的荧光程度反映观察细胞形态，记录细胞的荧光程度，以细胞的荧光程度反映观察细胞形态，记录细胞的荧光程度，以细胞的荧光程度反映观察细胞形态，记录细胞的荧光程度，以细胞的荧光程度反映DNADNA的含的含的含的含量，从而判断药物的抗癌活性。量，从而判断药物的抗癌活性。量，从而判断药物的抗癌活性。量，从而判断药物的抗癌活性。在释药过程研究中的应用：在释药过程研究中的应用：在释药过程研究中的应用：在释药过程研究中的应用：由于由于由于由于CLSMCLSM的实时观测能力，可对控释药物的释药过程中药物损耗变化进行观察。的实时观测能力，可对控释药物的释药过程中药物损耗变化进行观察。的实时观测能力，可对控释药物的释药过程中药物损耗变化进行观察。的实时观测能力，可对控释药物的释药过程中药物损耗变化进行观察。4 4 4 4 缺点：缺点：缺点：缺点：不能观察到大部分的膜结构特征，尤其是不能观察到大部分的膜结构特征，尤其是不能观察到大部分的膜结构特征，尤其是不能观察到大部分的膜结构特征，尤其是ultrafiltrationultrafiltration膜结构。膜结构。膜结构。膜结构。成像质量与扫描速度始终是一对矛盾。成像质量与扫描速度始终是一对矛盾。成像质量与扫描速度始终是一对矛盾。成像质量与扫描速度始终是一对矛盾。扫描过程耗时较长，且只能扫描不动的微生物，许多活动的大型微生物因运动扫描过程耗时较长，且只能扫描不动的微生物，许多活动的大型微生物因运动扫描过程耗时较长，且只能扫描不动的微生物，许多活动的大型微生物因运动扫描过程耗时较长，且只能扫描不动的微生物，许多活动的大型微生物因运动比较剧烈而对成像造成一定影响。比较剧烈而对成像造成一定影响。比较剧烈而对成像造成一定影响。比较剧烈而对成像造成一定影响。某些荧光染料可能会对某些活体细胞的活性造成一定的负面影响，因此宜选择合某些荧光染料可能会对某些活体细胞的活性造成一定的负面影响，因此宜选择合某些荧光染料可能会对某些活体细胞的活性造成一定的负面影响，因此宜选择合某些荧光染料可能会对某些活体细胞的活性造成一定的负面影响，因此宜选择合适的荧光染料，同时适当地调整激光的光强，宜用最弱的光对标本进行照射扫描。适的荧光染料，同时适当地调整激光的光强，宜用最弱的光对标本进行照射扫描。适的荧光染料，同时适当地调整激光的光强，宜用最弱的光对标本进行照射扫描。适的荧光染料，同时适当地调整激光的光强，宜用最弱的光对标本进行照射扫描。激光显微细胞外科技术：36ReporterAssay为检测特定基因能否在目标生物体内表达为检测特定基因能否在目标生物体内表达及表达水平，及表达水平，Reporterassay常被使用。常被使用。PromoterPromoterTargetGeneTargetGeneReporterGeneReporterGenePromoterPromoterTargetGeneTargetGeneProductsProductsReporterReporterProductsProductsEasyDetectionEasyDetectionReporterAssay为检测特定基因能否在目标生物体内37绿荧光蛋白标记绿荧光蛋白标记OsamuShimomura,MartinChalfie及及RogerTsien于于20082008年因绿荧光蛋白年因绿荧光蛋白的发现，获诺贝尔化学奖。的发现，获诺贝尔化学奖。绿荧光蛋白标记OsamuShimomura,Martin38荧光素酶标记荧光素酶标记荧光素酶标记39直接直接ELISA:直接使用酶标记的一抗探测固定的抗原。最直接使用酶标记的一抗探测固定的抗原。最为简单，避免二抗可能的交叉反应，但敏感性较差，需要为简单，避免二抗可能的交叉反应，但敏感性较差，需要大量昂贵的标记抗体。大量昂贵的标记抗体。间接间接ELISA:不直接标记一抗，而是标记抗一抗的二抗。不直接标记一抗，而是标记抗一抗的二抗。信号可以被有效放大，且一抗免疫活性不会受标记的影响。信号可以被有效放大，且一抗免疫活性不会受标记的影响。但二抗可能发生交叉反应。但二抗可能发生交叉反应。“三明治三明治”ELISA:先在盘中固定一层捕获抗体先在盘中固定一层捕获抗体（Captureantibody），以之将目标抗原捕获，之后再使），以之将目标抗原捕获，之后再使用一层标记的探测抗体。两种抗体必须小心选择以避免相用一层标记的探测抗体。两种抗体必须小心选择以避免相互之间的反应。此法不需纯化抗原，同时具有极高的敏感互之间的反应。此法不需纯化抗原，同时具有极高的敏感性和特异性。但对抗原有要求：至少有两个结合位点。性和特异性。但对抗原有要求：至少有两个结合位点。竞争性竞争性 ELISA:样本和纯化并事先固定的目标抗原对标记样本和纯化并事先固定的目标抗原对标记的抗体进行竞争，如果样本中存在目标抗原，最终得到的的抗体进行竞争，如果样本中存在目标抗原，最终得到的信号就会下降。此法可用于不纯的样本，重复性可靠，但信号就会下降。此法可用于不纯的样本，重复性可靠，但敏感性和特异性都较低。敏感性和特异性都较低。ELISA（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,酶酶联免疫吸附试验联免疫吸附试验）ELISA（Enzyme-LinkedImmunoSor40ELISA（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,酶酶联免疫吸附试验联免疫吸附试验）ELISA（Enzyme-LinkedImmunoSor41酶标仪酶标仪1 1 1 1 原理原理原理原理酶标仪（酶标仪（酶标仪（酶标仪（MicroplateReaderMicroplateReader）是对用专用反应盘进行的，建立）是对用专用反应盘进行的，建立）是对用专用反应盘进行的，建立）是对用专用反应盘进行的，建立在吸光度改变基础上的各种实验进行读取的设备，因其主要用途之在吸光度改变基础上的各种实验进行读取的设备，因其主要用途之在吸光度改变基础上的各种实验进行读取的设备，因其主要用途之在吸光度改变基础上的各种实验进行读取的设备，因其主要用途之一是读取一是读取一是读取一是读取酶联免疫吸附试验结果而得名。但其也可读取其他实验结酶联免疫吸附试验结果而得名。但其也可读取其他实验结果，如蛋白定量，各种酶活性检测，果，如蛋白定量，各种酶活性检测，MTT等。等。新式酶标仪除读取一般吸光度外，还可以读取荧光数据：实验者新式酶标仪除读取一般吸光度外，还可以读取荧光数据：实验者指定激发光波长及放射光波长，带荧光读取功能的酶标仪即可读取指定激发光波长及放射光波长，带荧光读取功能的酶标仪即可读取该数据。同时还有的酶标仪带加温，该数据。同时还有的酶标仪带加温，振荡，定时重复读取等等功能，极大振荡，定时重复读取等等功能，极大地方便了实验。地方便了实验。酶标仪1原理42SouthernBlottingSouthernBlotting43EdwinEdwinSouthern,Southern,SouthernSouthernBlottingBlotting的发的发的发的发明者。左图明者。左图明者。左图明者。左图为他在为他在为他在为他在NatureNature上关上关上关上关于于于于SouthernSouthernBlottingBlotting的文的文的文的文章中的例图。章中的例图。章中的例图。章中的例图。EdwinSouthern,SouthernBlott44NorthernBlottingNorthernBlotting45Insituhybridization(原位杂交技术原位杂交技术)1 1 1 1 原理原理原理原理原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。原有位置上显示出来。原有位置上显示出来。原有位置上显示出来。Insituhybridization(原位杂交技术)46新技术在医学实验中的应用优质课件47举例：原位杂交检测举例：原位杂交检测p21mRNA将用将用将用将用DEPCDEPC处理后的无菌盖玻片（细胞飞片）置处理后的无菌盖玻片（细胞飞片）置处理后的无菌盖玻片（细胞飞片）置处理后的无菌盖玻片（细胞飞片）置入入入入6 6孔培养板中，接种细胞于孔内，孔培养板中，接种细胞于孔内，孔培养板中，接种细胞于孔内，孔培养板中，接种细胞于孔内，3737、5%5%CO2CO2培养至细胞培养至细胞培养至细胞培养至细胞8080融合，处理同融合，处理同融合，处理同融合，处理同1.21.2细胞培养。细胞培养。细胞培养。细胞培养。将细胞飞片用中性树胶粘于载玻片上，将细胞飞片用中性树胶粘于载玻片上，将细胞飞片用中性树胶粘于载玻片上，将细胞飞片用中性树胶粘于载玻片上，4 4多聚甲多聚甲多聚甲多聚甲醛固定醛固定醛固定醛固定20min20min，PBSPBS洗洗洗洗5min25min2次，系列酒精脱次，系列酒精脱次，系列酒精脱次，系列酒精脱水。蛋白酶水。蛋白酶水。蛋白酶水。蛋白酶KK消化细胞，经消化细胞，经消化细胞，经消化细胞，经PBSPBS清洗，多聚甲醛固清洗，多聚甲醛固清洗，多聚甲醛固清洗，多聚甲醛固定及酒精系列脱水后于定及酒精系列脱水后于定及酒精系列脱水后于定及酒精系列脱水后于3737用不含探针的杂交液用不含探针的杂交液用不含探针的杂交液用不含探针的杂交液预杂交预杂交预杂交预杂交45min45min。加入含探针。加入含探针。加入含探针。加入含探针9090gL-1gL-1的杂交液，的杂交液，的杂交液，的杂交液，置于密闭湿盒中，置于密闭湿盒中，置于密闭湿盒中，置于密闭湿盒中，6060过夜。杂交结束后，过夜。杂交结束后，过夜。杂交结束后，过夜。杂交结束后，NBTNBT显色，中性树胶封片。显色，中性树胶封片。显色，中性树胶封片。显色，中性树胶封片。举例：原位杂交检测p21mRNA48新技术在医学实验中的应用优质课件49PCR(PolymeraseChainReaction)聚合酶链式反应，是研究工作中最常用到聚合酶链式反应，是研究工作中最常用到的技术之一。的技术之一。P