第三节免疫检测技术的基本原理-课件

第三节免疫检测技术的基本原理抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原.将免疫反应与现代测试技术结合超微量的检测.第三节免疫检测技术的基本原理抗原、抗体反应的原理，利用已知的1.2免疫学检测技术的优点高度的灵敏性高度的特异性.免疫学检测技术的优点高度的灵敏性.3免疫分析技术的应用常用的诊断技术血凝试验酶联免疫吸附试验胶体金免疫技术放射免疫分析技术.免疫分析技术的应用.4凝集试验概概念念：颗颗粒粒性性抗抗原原(细细菌菌、红红细细胞胞等等)与与相相应应抗抗体体结结合合，在在一一定定条条件件下下出出现现肉肉眼眼可可见见的的凝凝集集物物，称称为为凝集反凝集反应应。1.1.直接凝集反直接凝集反应应抗抗原原与与抗抗体体直直接接混混合合作作用用，出出现现凝凝集集为为阳阳性性结结果。果。玻片直接凝集法：定性玻片直接凝集法：定性试验试验试试管直接凝集法：半定量管直接凝集法：半定量试验试验.凝集试验概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在5试试试试管法半定量管法半定量管法半定量管法半定量试验试验试验试验+玻片直接凝集玻片直接凝集试验试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512.试管法半定量试验YYY+1/21/41/81/161/3262.2.间间接凝集法接凝集法先先将将可可溶溶性性抗抗原原或或抗抗体体吸吸附附在在颗颗粒粒载载体体上上(如如RBC,RBC,乳乳胶胶颗颗粒粒)，再再与与相相应应抗抗体体或或抗抗原反原反应应，出，出现现凝集凝集为为阳性阳性结结果。果。临临床床常常用用的的有有间间接接血血凝凝试试验验、乳乳胶胶凝凝集集试试验验等。等。+待待检样检样品品抗原吸附血球抗原吸附血球或乳胶或乳胶颗颗粒粒反反应应凝集物凝集物.2.间接凝集法先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如RBC73.3.间间接凝集抑制接凝集抑制试验试验先先将将待待检检抗抗原原与与已已知知的的抗抗体体反反应应，再再加加入入用用已已知知抗原吸附的抗原吸附的载载体体颗颗粒，不出粒，不出现现凝集凝集为为阳性阳性结结果。果。例：乳胶凝集抑制例：乳胶凝集抑制试验检测试验检测HCG(HCG(妊娠妊娠诊诊断断)步步骤骤1 1：将将已已知知抗抗体体与待与待检标检标本混匀本混匀 步步骤骤2 2：加加入入抗抗原原吸吸附的乳胶附的乳胶颗颗粒混匀粒混匀 抗抗原原吸吸附附乳胶乳胶颗颗粒粒结结果判断：果判断：不不凝凝集集为为阳性阳性结结果果已知抗体已知抗体待待检标检标本本.3.间接凝集抑制试验先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已8凝集反凝集反应应.凝集反应.92.沉淀反沉淀反应应 概念：可溶性抗原与相概念：可溶性抗原与相应应抗体抗体结结合后出合后出现现沉淀物称沉淀反沉淀物称沉淀反应应。类类型：型：单单向免疫向免疫扩扩散散免疫比免疫比浊浊法法双向免疫双向免疫扩扩散散对对流免疫流免疫电电泳泳.2.沉淀反应概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀10 单单向向琼琼脂脂扩扩散散试验试验.单向琼脂扩散试验11 双向双向琼琼脂脂扩扩散散试验试验.双向琼脂扩散试12 对对流免疫流免疫电电泳泳.对流免疫电泳13测测吸光度吸光度计计算抗原算抗原或抗体的或抗体的含量含量抗体抗体抗原抗原免疫复合物的免疫复合物的浓浓度与透射光度与透射光的衰减呈正相的衰减呈正相关关免疫比免疫比浊浊法原理法原理.测吸光度计算抗原或抗体的含量抗体抗原免疫复合物的浓度与透射光143.中和反中和反应应 如抗如抗“O”试验试验4.免疫免疫标记标记技技术术 概念：用概念：用荧荧光素、光素、酶酶、同位素等、同位素等标记标记抗体或抗原用以抗体或抗原用以测测定相定相应应抗原或抗原或抗体的技抗体的技术术称称为为免疫免疫标记标记技技术术。常用。常用方法有免疫方法有免疫荧荧光技光技术术、酶酶免疫技免疫技术术、放射免疫放射免疫检测检测技技术术等。等。特点：敏感、特异、快速，能定特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。性、定量、定位。.3.中和反应如抗“O”试验4.免疫标记技术15免疫标记技术酶免疫标记技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标记技术.免疫标记技术酶免疫标记技术.16酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者年瑞典学者Engvail和和Perlmann,荷荷兰兰学者学者Van Weerman和和Schuurs分分别报别报道将免疫技道将免疫技术发术发展展为检测为检测体液中微量体液中微量物物质质的固相免疫的固相免疫测测定方法，即定方法，即酶酶联联免疫吸免疫吸附附测测定法定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者Engvail和Perlm17酶酶及其底物及其底物 酶酶结结合物是合物是酶酶与抗体或抗原与抗体或抗原,半抗原半抗原在交在交联剂联剂作用下作用下联结联结的的产产物。是物。是ELISAELISA成成败败的关的关键试剂键试剂，它不，它不仅仅具有抗体抗原特异的具有抗体抗原特异的免疫反免疫反应应，还还具有具有酶酶促反促反应应，显显示出生物示出生物放大作用，但不同的放大作用，但不同的酶酶选选用不同的底物用不同的底物 ，将得到不同的将得到不同的颜颜色反色反应应.酶及其底物.18酶酶 底底 物物显显色色反反应应 测测定波定波长长 辣根辣根过过氧化物氧化物酶酶 邻邻苯二胺苯二胺四甲替四甲替联联苯胺苯胺氨基水氨基水杨杨酸酸邻联邻联苯甲胺苯甲胺2,2-2,2-连连胺基胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并并噻噻唑唑啉磺酸啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘橘红红色色黄色黄色棕色棕色兰兰色色蓝绿蓝绿色色492492460460449449425425642642碱性磷酸碱性磷酸酯酯酶酶 4-4-硝基酚磷酸硝基酚磷酸盐盐(PNP)(PNP)萘萘酚酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸磷酸盐盐+重氮重氮盐盐 黄色黄色红红色色 400400500 500 葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚甲硫酚嗪嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深深蓝蓝色色 405405420 420-半乳糖半乳糖苷苷酶酶 甲基甲基伞酮伞酮基半乳糖苷基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧荧光光黄色黄色 360,450360,450420420 .酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲192、标记方法戊二醛交联法过碘酸盐氧化法.2、标记方法.20戊二戊二醛醛交交联联法法(一步法）一步法）抗体-NH2 +COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶.戊二醛交联法(一步法）抗体-NH2+COH-（CH21戊二戊二醛醛交交联联法（二步法）法（二步法）COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗体-NH2 +CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶.戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+22过过碘酸碘酸盐盐氧化法氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环.过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+23标记标记免疫物的分离与免疫物的分离与鉴鉴定定1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度.标记免疫物的分离与鉴定1、分离.24ELISAELISA的种的种类类和和变变化化 （一）双抗体（一）双抗体夹夹心法心法（二）（二）间间接法接法（三）（三）竞竞争法争法 （四）双位点一步法（四）双位点一步法（五）捕（五）捕获获法法测测IgMIgM抗体抗体（六）（六）应应用用亲亲和素和生物素的和素和生物素的ELISAELISA .ELISA的种类和变化（一）双抗体夹心法.25.26（一）双抗体（一）双抗体夹夹心法心法此法适用于此法适用于检验检验各种蛋白各种蛋白质质等大分子抗原等大分子抗原.（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原.27获获得待分析物的未得待分析物的未标标定抗体定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载载体体连连接形成固相抗体接形成固相抗体 洗洗涤涤除去未除去未结结合的合的抗体及抗体及杂质杂质 加入封加入封闭闭蛋白溶液以封蛋白溶液以封闭载闭载体体表面残留的蛋白表面残留的蛋白结结合位点合位点洗洗涤涤并除去未并除去未结结合的封合的封闭闭蛋白蛋白加受加受检标检标本（抗原）形成本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗洗涤涤除去其他除去其他未未结结合的物合的物质质 加加酶酶标标抗体生成抗体生成抗体抗体待待测测抗原抗原酶酶标记标记抗体抗体的复合物的复合物 彻彻底洗底洗涤涤未未结结合的合的 酶酶标标抗体抗体 加底物加底物进进行行酶酶催化反催化反应应 根据根据颜颜色反色反应应的的程度程度进进行行该该抗原抗原的定性或定量的定性或定量测测定定.获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相洗涤除去未结合的加28 间间接法是接法是检检测测抗体最常用的方抗体最常用的方法，其原理法，其原理为为利用利用酶酶标记标记的抗抗体以的抗抗体以检测检测已与固相已与固相结结合合的受的受检检抗体抗体，故称，故称为间为间接法。接法。（二）（二）间间接法接法.间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗29 酶酶联联免疫吸附免疫吸附试验试验(ELISA-间间接法接法).酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法).30包被固相包被固相载载体体:用已知抗原包被用已知抗原包被固相固相载载体体 加待加待检标检标本本:使相使相应应抗体与固相抗原抗体与固相抗原结结合合洗洗涤涤，除去无关的物，除去无关的物质质 加加酶酶标标抗抗体抗抗体:与固相与固相载载体上抗原抗体体上抗原抗体复合物复合物结结合；洗合；洗涤涤，除去，除去未未结结合的合的酶酶标标抗抗体抗抗体 加底物加底物显显色色 根据根据颜颜色反色反应应的程度的程度进进行行该该抗原的定性或定量抗原的定性或定量测测定定.包被固相载体:加待检标本:加酶标抗抗体:加底物根据颜色反31（三）（三）竞竞争法争法 此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于抗原和半抗原的定量量测测定，也可用于定，也可用于测测定抗体定抗体 。.（三）竞争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，32用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相固相载载体体 测测定管加待定管加待测测抗原和抗原和一定量的一定量的酶酶标标抗原使二者与抗原使二者与固相抗体固相抗体竞竞争争结结合合 对对照管只加一定量照管只加一定量酶酶标标抗原抗原与固相抗体直接与固相抗体直接结结合合 分分别别洗洗涤涤除去未除去未结结合合的成分的成分 加底物加底物显显色色分分别测别测定两管的吸光度定两管的吸光度值值，根据根据对对照管与照管与测测定管吸光度定管吸光度值值之比，之比，计计算算标标本中待本中待测测抗原含量抗原含量.用已知特异性测定管加待测抗原和对照管只加一定量酶标抗原分别洗33 对对照管由于只加照管由于只加酶酶标标抗原，与固抗原，与固相抗体充分相抗体充分结结合，故分解底物合，故分解底物显显色深；色深；测测定管的定管的显显色程度色程度则则随待随待测测抗原和抗原和酶酶标标抗原与固相抗体抗原与固相抗体竞竞争争结结合的合的结结果而果而异。如待异。如待测测抗原量多，抗原量多，竞竞争性地抑制争性地抑制酶酶标标抗原与固相抗体抗原与固相抗体结结合，使固相上合，使固相上结结合的合的酶酶标标抗原量减少。因此，加入抗原量减少。因此，加入底物后底物后显显色反色反应较应较弱。弱。.对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底34 饲饲料中料中盐盐酸克酸克伦伦特特罗罗的的测测定定 饲饲料中毒素的料中毒素的测测定（主要包括黄曲霉毒素，定（主要包括黄曲霉毒素，简简曲霉毒素曲霉毒素 ）饲饲料中有害微生物的快速料中有害微生物的快速筛检筛检 （如沙（如沙门门氏氏菌菌 ）甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析 甲基甲基对对硫磷残留分析硫磷残留分析 呋呋喃丹残留分析喃丹残留分析 ELISA在在饲饲料安全料安全检测检测中的中的应应用用ELISA用于用于农药农药残留的残留的检测检测.饲料中盐酸克伦特罗的测定甲胺磷残留分析ELISA在饲料35河豚毒素河豚毒素植物毒素如罌粟植物毒素如罌粟硷硷、吗吗啡、藻啡、藻类类毒素毒素 苯并芘苯并芘主要有除草主要有除草剂剂与与杀杀虫虫剂剂两大两大类类 例如例如杀杀暝松（暝松（FN FN）、）、甲氟磷酸异已甲氟磷酸异已酶酶（SOMAN SOMAN）、）、草不草不绿绿（Alachor Alachor）、）、西西维维因（因（Carbaryl Carbaryl）、）、多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（Captan Captan）等）等。农药农药的的检测检测：.河豚毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘主要有除36食源性病原菌检测试剂盒大肠杆菌检测沙门氏菌检测单增李斯特菌金黄色葡萄球菌.食源性病原菌检测试剂盒.37转转基因成份的基因成份的检测检测：如：如转转基因玉米中基因玉米中中的中的cry9e蛋白蛋白转转基因大豆中的基因大豆中的CP4 EPSPS蛋白蛋白质质肉制品的肉制品的掺掺假假检测检测：以辣根以辣根过过氧化物氧化物酶酶标记标记不同不同动动物肌肉和血清球蛋物肌肉和血清球蛋A抗血清抗血清检查检查牛肉、牛肉、马马肉、猪肉、羊肉和肉、猪肉、羊肉和驼驼肉肉检测检测14种种畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马马肉等，在肉等，在掺掺假率假率为为1%时时即可即可检检出出食品其他食品其他检测检测：.转基因成份的检测：如转基因玉米中中的cry9e蛋白转基因大豆38荧荧光抗体技光抗体技术术的原理与方法的原理与方法用用荧荧光光素素标标记记抗抗原原或或抗抗体体，再再与与标标本本中中抗抗体体或或抗抗原原反反应应，然然后后在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察，形形成成的的ICIC可可散散发发出出荧荧光光，对对标标本本中中的的抗抗原原或或抗抗体体进进行行测测定定和和定位。定位。常用的常用的荧荧光素光素异硫异硫氰氰酸酸荧荧光素光素(FITC)(FITC)、藻、藻红红蛋白蛋白(PE)(PE)等。等。常用的方法常用的方法直接直接荧荧光法光法间间接接荧荧光法光法.荧光抗体技术的原理与方法用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中39 免疫免疫荧荧光技光技术术.免疫荧光技术.40免疫免疫免疫免疫荧荧荧荧光技光技光技光技术术术术直接法直接法直接法直接法Ag荧荧光素光素标记标记的的特异性抗体特异性抗体组织组织切片切片.免疫荧光技术直接法AgY荧光素标记的组织切片.41免疫免疫免疫免疫荧荧荧荧光技光技光技光技术术术术间间间间接法接法接法接法Ag荧荧光素光素标记标记的抗抗体的抗抗体组织组织切片切片待待测测抗体抗体.免疫荧光技术间接法AgYY荧光素标记组织切片.42免疫免疫免疫免疫荧荧荧荧光技光技光技光技术术术术.免疫荧光技术.43荧荧光光显显微微镜镜.荧光显微镜.44荧荧光光显显微微镜镜使用原理使用原理激发滤片（BG）吸收滤片（OG）标本FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nmBG：325-500 OG：410-650.荧光显微镜使用原理激发滤片（BG）吸收滤片（OG）标本FIT45免疫金标记技术免疫金免疫金标记标记技技术术(Immunogold labelling techique)主要利用了金主要利用了金颗颗粒具有高粒具有高电电子密度的子密度的特性，在金特性，在金标标蛋白蛋白结结合合处处，在，在显显微微镜镜下可下可见见黑褐黑褐色色颗颗粒，当粒，当这这些些标记标记物在相物在相应应的配体的配体处处大量聚集大量聚集时时，肉眼可，肉眼可见红见红色或粉色或粉红红色斑点，因而用于定性色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫或半定量的快速免疫检测检测。这这一反一反应应也可以通也可以通过过银颗银颗粒的沉粒的沉积积被放大，称之被放大，称之为为免疫金免疫金银银染色染色（immunogold silver staining，IGSS）。.免疫金标记技术免疫金标记技术(Immunogoldlabe46一、胶体金制一、胶体金制备备胶体金胶体金（colloidal gold）的制的制备备一般采用一般采用还还原法，常用的原法，常用的还还原原剂剂有有柠柠檬酸檬酸钠钠、鞣酸、抗、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼坏血酸、白磷、硼氢氢化化钠钠等。向一定等。向一定浓浓度的金度的金溶液内加入一定量的溶液内加入一定量的还还原原剂剂使金离子使金离子还还原成金原成金原子，形成金原子，形成金颗颗粒粒悬悬液，也称金溶胶液，也称金溶胶（gold solution）。.一、胶体金制备胶体金（colloidalgold）的制备47 胶体金的制胶体金的制备备及特性及特性胶体金粒径胶体金粒径1%1%柠柠檬酸檬酸钠钠加入量加入量胶体金特性胶体金特性（nm)nm)（ml)*ml)*呈色呈色lmax(nmlmax(nm)16162.00 2.00 橙色橙色51851824.524.51.50 1.50 橙橙红红色色52252241411.00 1.00 红红色色52552571.571.50.70 0.70 紫色紫色535535*还还原原100 ml0.01%HAuCl4 100 ml0.01%HAuCl4 所需量所需量.胶体金的制备及特性胶体金粒径1%柠檬酸钠加入量胶体金特性（48胶胶 体体 金金（Colloidal Gold）1560 nm优优 质质劣劣 质质.胶体金（ColloidalGold）1560n49胶体金胶体金结结合物合物（Conjugate）.胶体金结合物（Conjugate）.50一、免疫渗一、免疫渗滤测滤测定定(IFA).一、免疫渗滤测定(IFA).51斑点渗漏法其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边上小点为抗鼠二抗。先将待测样品滴在其中，若有抗原即被结合在中心圆点，洗去未结合抗原，再滴加金标另一株单抗，若有抗原则形成金-Ab-Ag薄膜的红色斑点，而边上是金-Ab-Ab2薄膜的质控点，是为金标二步法。.斑点渗漏法其原理与层析法相类同，中心圆点为一株单抗，边52IFA双抗体双抗体夹夹心法心法测测抗原抗原AB.IFA双抗体夹心法测抗原AB.53IFA结结果判断果判断.IFA结果判断.54二、免疫二、免疫层层析析测测定（定（ICA）.二、免疫层析测定（ICA）.55层析法将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此金标单抗即被溶解，并随尿液上行，若尿中有相应抗原，既形成Ag-Ab-金复合物，当上行至中段醋酸纤维薄膜，即与下端的另一株单抗结合并被固定下来，显示阳性结果。其上方还有一条抗鼠二抗，待红色金标单抗上行此处即被固定下来，作为金标单抗质控的提示。此种方法称金标一步法。.层析法将金标的一株单抗吸附于下端的玻璃纤维纸上，浸入尿液，此56 兔抗鼠兔抗鼠IgG鼠抗鼠抗HCG单单抗抗金金标标鼠抗鼠抗HCG单单抗抗尿液浸湿尿液浸湿标标志志线线 手持端手持端斑点金免疫斑点金免疫层层析析试验试验（一）（一）.兔抗鼠IgG鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗尿液浸湿标志线57斑点金免疫斑点金免疫层层析析试验试验（二）（二）尿尿样样阳性阳性弱阳性弱阳性阴性阴性无效无效质质控控线线测试线测试线.斑点金免疫层析试验（二）尿样阳性弱阳性阴性无效质控线测试线.58 ICA双抗体双抗体夹夹心法心法测测抗原抗原.ICA双抗体夹心法测抗原.59ICA-竞争法测抗原免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图.ICA-竞争法测抗原免疫层析试验竞争法测小分子抗原原60ICA 竟争法竟争法结结果果观观察察 阴性阴性阳性阳性无效无效.ICA竟争法结果观察阴性阳性无效.61ICA间间接法接法测测抗体抗体.ICA间接法测抗体.62ICA 结结果果观观察察 阳性阳性阴性阴性无效无效.ICA结果观察阳性阴性无效.63IFA与与ICA的比的比较较IFAIFAICAICA试剂试剂形式形式渗渗滤滤装置及附装置及附加加试剂试剂试剂试剂条条试剂试剂保存保存4 48 68 6个月个月室温一年室温一年操作步操作步骤骤3 35 51 1观观察察时间时间3 min3 min3 320 min20 min阳性反阳性反应颜应颜色色浓浓度度操作操作结结束束颜颜色色不不变变颜颜色逐色逐渐渐加深加深.IFA与ICA的比较IFAICA试剂形式渗滤装置及附加试剂试64IFA IFA 穿流（穿流（FLOW THROUGHFLOW THROUGH）ICA ICA 横流（横流（LATERAL FLOWLATERAL FLOW）.IFA.651、罗立新,缪珑,潘力,等.快速检测产单核李斯特菌免疫胶体金层析法的研究J.中国卫生检验杂志,2006,16(2):154-156.2、赖卫华,熊勇华,陈高明,等.应用胶体金试纸条快速检测赭曲霉毒素A的研究J.食品科学,2005,26(5):204-207.1、罗立新,缪珑,潘力,等.快速检测产单核李斯特菌663、谌志强,段惠莉,王新为,等.大肠埃希菌O157:H7的胶体金免疫渗滤法检测J.中国公共卫生,2005,21(4):705-706.4、谢昭聪,宋志强,吕敬章,等.应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究J.中国国境卫生检疫杂志,2005,28(3):163-165.3、谌志强,段惠莉,王新为,等.大肠埃希菌O157675、王中民,李君文,王新为,等.免疫金渗滤试验检测食品中沙门氏菌的研究J.微生物学免疫学进展,2001,29(4):45-47.6、刘永德,汪毅,陈禹雷,免疫金探针快速检测禽流感病毒研究J.上海交通大学学报:农业科学版,2005,23(3):321-324.5、王中民,李君文,王新为,等.免疫金渗滤试验检测68斑点金免疫渗斑点金免疫渗滤试验滤试验ADCB阴性（未阴性（未怀怀孕）孕）阳性（阳性（怀怀孕）孕）加尿加尿样样除去除去滤滤器器加胶体金加胶体金标记标记抗体抗体加洗加洗涤涤液液结结果判定果判定.斑点金免疫渗滤试验ADCB阴性（未怀孕）阳性（怀孕）加尿样除69免疫印迹法免疫印迹法图图解解SDS裂解裂解病毒病毒聚丙聚丙酰酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳-+95 68 45 12KD电转电转印至印至NC膜上膜上置待置待测测血清中，漂洗；血清中，漂洗；加加酶酶标标抗抗体，漂洗；抗抗体，漂洗；加底物加底物 显显色色120 41 24KD.免疫印迹法图解SDS裂解病毒聚丙酰胺凝胶电泳-+70 第四第四节节 放射性核素放射性核素标记标记技技术术一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化.第四节放射性核素标记技术一、常用标记方法.71R：放射性核素示踪高灵敏高灵敏不直接探不直接探测测待待测测物，而探物，而探测测待待测测物上的物上的标记标记信信号号(标记标记物的放大效物的放大效应应)I：免疫学反应高特异高特异废废除以往沿用的无机或有机除以往沿用的无机或有机试剂试剂，代之以抗体，代之以抗体为结为结合合剂剂.R：放射性核素示踪.72常用常用标记标记方法方法1、常用放射性核素2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法）间接法（连接法）.常用标记方法1、常用放射性核素.73直接法（直接法（氯氯胺胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T.直接法（氯胺T法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCH74间间接法（接法（连连接法）接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP.间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H75间间接法（接法（连连接法）接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHH-C-C-N-蛋白质H O H+NH2-蛋白质125I125I.间接法（连接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H76标记标记免疫物的分离与免疫物的分离与鉴鉴定定1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）.标记免疫物的分离与鉴定1、分离.77结合相游离相放射免疫分析法的原理与方法放射免疫分析法的原理与方法.结合相游离相放射免疫分析法的原理与方法.78液液闪仪闪仪.液闪仪.79计计数器数器.计数器.80化学发光标记免疫技术直接化学直接化学发发光光酶酶促化学促化学发发光特点光特点电电化学化学发发光特点光特点.化学发光标记免疫技术直接化学发光.81标记免疫分析三方式与四环节三个方式 A、直接法 B、间接法 C、夹心法四四环节为环节为：11、抗体生、抗体生产产22、标记试剂标记试剂制制备备33、分析方式分析方式设计设计44、分析信号、分析信号检测检测.标记免疫分析三方式与四环节三个方式.82免疫测定分类均相免疫测定 HOMOGENOUS IA HOMOGENOUS IA 在测定中结合的反应物(B)与游离的反应物(F)不需要分离 异相免疫测定 HETEROGENOUS IA HETEROGENOUS IA 在测定中需要分离(B)和(F).免疫测定分类均相免疫测定.83小结常用免疫测定方法标记免疫法测定的方法及原理标记免疫测定法的特点ELISA的方法及原理.小结常用免疫测定方法.84作业1、何谓沉淀反应？何谓凝集反应？其抗原有特点？2、抗原抗体反应有何特性？3、抗原抗体反应的影响因素有哪些？4、常用的免疫标记技术有哪些？5、设计一ELISA试验来检测牛奶中黄曲霉毒素M1。.作业1、何谓沉淀反应？何谓凝集反应？其抗原有特点？.85