液相色谱工作原理课件

CONFIDENTIAL液相色谱工作原理液相色谱工作原理CONFIDENTIAL流动相储液瓶流动相储液瓶单元或多元泵单元或多元泵梯度混合器梯度混合器预柱预柱手动手动-进样器进样器自动自动-进样器进样器保护柱保护柱色谱柱色谱柱柱后反应器柱后反应器柱温箱柱温箱检测器检测器馏分收集器馏分收集器积分仪积分仪工作站工作站计算机计算机接口接口温度控制单元温度控制单元样品制备单元样品制备单元液相色谱仪器结构组成示意图 流动相储液瓶单元或多元泵梯度混合器预柱手动-进样器保护柱色谱2CONFIDENTIAL 溶剂传输泵溶剂传输泵的要求能在高压下连续工作 较宽的可程序控制的流速范围 耐化学腐蚀 无脉动输出 输出流量稳定、重复性好 易安装维护 溶剂传输泵溶剂传输泵的要求3CONFIDENTIAL步进电机步进电机齿轮变速箱齿轮变速箱活塞活塞液体液体到色谱柱到色谱柱密闭输液系统密闭输液系统 工作过程：工作过程：步进马达带动活塞输液优点：优点：流速恒定，无脉冲缺点：缺点：输液泵缸溶剂有限 活塞与液缸间密封要求高，更换溶剂不方便 造价高 溶剂输出泵柱塞泵步进电机齿轮变速箱活塞液体到色谱柱密闭输液系统 工作过程：步4CONFIDENTIAL工作过程：工作过程：电机带动偏心轮，驱动活塞往复运动 在高压下连续以恒定的流量输送液体优点：优点：溶剂不受限制 死体积小 溶剂混合均匀缺点：缺点：会产生脉冲 需增加脉冲阻尼器 溶剂输出泵往复泵工作过程：电机带动偏心轮，驱动活塞往复运动 溶剂输出泵5CONFIDENTIAL溶剂进入：溶剂进入：活塞收回、腔内形成低压 入口阀打开，出口阀感应压差而闭合溶剂输出：溶剂输出：活塞推出、腔内压力增加 出口阀打开，入口阀感应压差而闭合单向阀的特点：单向阀的特点：密封性能相当好 可以非常敏感地感应压差而迅速闭合 往复泵的工作原理溶剂进入：往复泵的工作原理6CONFIDENTIAL并联往复泵的工作原理并联往复泵的工作原理7CONFIDENTIAL进样阀六通阀设计六通阀设计 耐高压，低死体积 可以手动或自动旋转进样阀 自动进样的重复性优于手动进样上样(load)状态进样(inject)状态进样阀六通阀设计上样(load)状态进样(inject)状态8CONFIDENTIAL手动进样阀的进样注意：一定使用平头微量进样针手动进样阀的进样注意：一定使用平头微量进样针9CONFIDENTIAL进 样层 流 效 应当样品注入定量环时，环中的流动相将被取代样品于流动相之间的界面呈抛物线状，称为层流效应全定量环进样时，必须考虑层流效应的影响进 样层 流 效 应当样品注入定量环时，环中的流动相将被取10CONFIDENTIAL进 样层 流 效 应以定量环的体积定量 对一般样品而言，进样体积需大于定量环的2.5倍 4 倍则更加保险倍数进 样层 流 效 应以定量环的体积定量倍数11CONFIDENTIAL进 样进 样 量全定量环进样全定量环进样准确，但浪费样品至少需要2.5倍进样体积的样品部分定量环进样部分定量环进样进样量 进样环体积的一半无层流效应的影响误差来源于进样针及操作人员使用内标法将可以提高进样的准确度进 样进 样 量全定量环进样12CONFIDENTIAL检 测 器 作用：作用：检测色谱柱流出物组份浓度的变化理想的检测器：理想的检测器：灵敏度高 对所有溶质都有快速的相应 不引起柱外谱带扩展 线性范围宽 对样品无破坏性 检测器响应对流量及温度变化不敏感检 测 器 作用：检测色谱柱流出物组份浓度的变化13CONFIDENTIAL检 测 器 分 类按检测对象分类按检测对象分类 整体性检测器：检测流动相的总体物理性质 如：示差折光检测器、电导检测器 灵敏度低、易受温度影响的波动、不适合梯度洗脱 溶质性检测器：测量溶质的某种特性或物化性质的变化 如：紫外检测器、荧光检测器 流动相不能有紫外吸收按选择性分类按选择性分类 选择性检测器：紫外检测器、荧光检测器、电导检测器 通用性检测器：示差折光检测器检 测 器 分 类按检测对象分类14CONFIDENTIAL检测器的噪音和漂移 噪音和漂移反应了检测器的稳定性噪音和漂移反应了检测器的稳定性 噪音噪音 无溶剂通过检测器时，输出信号的变化 电路及泵的脉冲引起短噪音，不影响色谱 峰的分辨率，但影响检测限 长噪音来自检测器本身、或流动池有气泡，温度及流量的变化也会引起长噪音 漂移漂移 基线随时间增加朝单一方向偏移 电源电压不稳、温度及流动相发生缓慢变化 对分析误差及检测能力有影响检测器的噪音和漂移 噪音和漂移反应了检测器的稳定性15CONFIDENTIAL检测器的技术指标灵敏度灵敏度 检测器的主要性能指标，样品进入检测器的响应信号 灵敏度越高检测限越低检测限检测限 两倍噪音时所需要的样品量 检测限低、检测性能强、检测时所需要的样品少线性范围线性范围 检测信号与被检测物呈线性关系的范围 下限定义为两倍噪音检测器的技术指标灵敏度16CONFIDENTIAL紫外-可见波长检测器应用范围最广泛的检测器应用范围最广泛的检测器 大约占使用的70%紫外光区：190370nm特点特点 灵敏度高、噪音低、线性范围宽 为溶质型检测器、对流速和温度的变化不敏感 为选择性检测器，必须使用无紫外吸收的溶剂作流动相为浓度型检测器 为非破坏性检测器，可与制备色谱或其他设备串联 结构简单、维护方便紫外-可见波长检测器应用范围最广泛的检测器17CONFIDENTIALI0IAbsorbedradiationTransmitted radiationIncident radiationReflectionb A=log()=a b cIoI紫外-可见波长检测器工作原理朗伯朗伯-比尔定律：比尔定律：吸光度与化合物的浓度成正比I0IAbsorbedTransmitted radiati18CONFIDENTIAL理论检测限估算摩尔吸光系数（A=b c）紫外检测器灵敏度很大程度取决于样品的 值 与物质分子结构有关 估算最低检测浓度 CminCmin=3ND/b（ND噪声）摩尔吸光系数影响检测灵敏度 估算最小检测量 MminMmin=Cmin x进样体积理论检测限估算摩尔吸光系数（A=b c）19CONFIDENTIAL 紫外-可见波长检测器的光学系统 紫外-可见波长检测器的光学系统20CONFIDENTIAL二极管阵列检测器 光学特性光电二极管阵列 汞灯波长校正 棱镜分光系统 二极管阵列检测器 光学特性21CONFIDENTIAL二极管阵列检测器的数据分析功能二极管阵列检测器的数据分析功能22CONFIDENTIAL荧光检测器原理物质吸收特征频率的辐射，跃迁到高能级 从高能级状态向低能级，发射出比吸收波 长更长的特征辐射 荧光检测器原理23CONFIDENTIAL 荧光检测器光学系统 ProStar 363 荧光检测器 荧光检测器光学系统 ProStar 363 荧光检24CONFIDENTIAL示差折光检测器 通用型检测器 溶剂选择合适几乎可测所有的物质 原理折射率：光在真空的速度和在某介 质中的速度之比光 光由一种介质进入另一种介质时发 生折射现象 折射率随温度升高而降低 同一介质对不同波长的光有不同折射率 示差折光检测器 通用型检测器 25CONFIDENTIAL示差折光检测器光学系统示差折光检测器光学系统26CONFIDENTIAL温度控制维持参比、样品池温差最小 采用热交换器、利用热平衡控制温度 避免室温变化的影响 温度控制维持参比、样品池温差最小 27CONFIDENTIAL 示差折光检测器的特点 属通用型检测器响应值取决于柱后流出液折射率变化 适合检测 无紫外吸收的物质 流动相溶剂具有高紫外吸收 浓度敏感型检测器 响应信号与溶质浓度成正比 中等灵敏度检测器 不适合痕量分析 示差折光检测器的特点 属通用型检测器28CONFIDENTIAL示差折光检测器的特点（续）对压力、温度变化相当敏感 需配置柱温箱 最常用的溶剂是水 不适合梯度洗脱 检测要求 流动相组成须恒定 控制恒温 控制压力恒定 出口处不可以加限流 装置 检测器串联时，RI应 放在最后 水甲醇和水水甲醇和水CH3CN混合物折射率混合物折射率示差折光检测器的特点（续）对压力、温度变化相当敏感 水甲醇和29CONFIDENTIAL蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器（Evaporative Light-scattering Detector）是通用型检测器，可以检测没有紫外吸收的有机物质，如如人参皂苷、黄芪甲苷等。1993才由Alltech公司商业化生产。ELSD工作原理 恒定流速的色谱仪洗脱液进入检测器后，首先被高压气流雾化，雾化形成的小液滴进入蒸发室，流动相及低沸点的组分被蒸发，剩下高沸点组分的小液滴进入散射池，光束穿过散射池时被散射，散射光被光电管接收形成电信号，电信号通过放大电路、模数转换电路、计算机成为色谱工作站的数字信号色谱图。蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器（Evaporative L30CONFIDENTIAL蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器31CONFIDENTIAL色谱柱的选择填料粒径l10um 对某些分离来说分离度已经足够l一般建议采用5uml3um 柱效非常高，但所产生的反压很高，只能适用于短柱l当填料粒径降低，其污染与阻塞的几率就升高色谱柱的选择填料粒径32CONFIDENTIALQ/A Q/A 33CONFIDENTIAL液相色谱工作原理课件34