总RNA提取及免疫组化课件

细胞总细胞总RNA的提取的提取2015-07-21细胞总RNA的提取2015-07-211一、真核细胞的总一、真核细胞的总RNA 1、mRNA:1-5%2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%大大亚基基60S:28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小小亚基基40S:18S=1874nt总RNA提取及免疫组化课件2二、二、RNA提取的注意事项提取的注意事项 RNARNA酶酶酶酶：广泛存在：灰：广泛存在：灰尘、人体唾液、人体唾液、实验器材表面。器材表面。生物活性非常生物活性非常稳定：耐定：耐热、耐酸、耐碱。、耐酸、耐碱。1、尽量避免尽量避免外外源性源性RNase 污染染 A.操作操作环境空气境空气洁净。带手套、口罩。手套、口罩。B.用新开封的化学用新开封的化学试剂。（。（试剂应该专用）用）C.一次性塑料器材最好是新开封，一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水水处理后）高理后）高压灭菌。菌。D.玻璃器材、水都玻璃器材、水都应该经过去去RNase 处理。理。对玻璃器材玻璃器材还应该进行高温烘烤。行高温烘烤。2、抑制、抑制内内源性源性RNase 活性：活性：RNase 抑制抑制剂。RNA分离的关键因素：避免分离的关键因素：避免RNA酶的污染。酶的污染。二、RNA提取的注意事项 RNA酶：广泛31)1)样品处理：样品处理：（）培养细胞：收获细胞（）培养细胞：收获细胞 1-510 7 1-510 7，移入，移入 1.5ml 1.5ml 离心管中，加入离心管中，加入 1ml Trizol 1ml Trizol，混匀，室，混匀，室温静置温静置 1010min min。（）组织：取（）组织：取 50-100mg 50-100mg 组织（新鲜或组织（新鲜或-70 -70 及液氮中保存的组织均可）置及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 1.5ml 离心管离心管中，加入中，加入 1ml Trizol 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置充分匀浆，室温静置1010 min min。三、三、RNA提取的实验操作提取的实验操作 1)样品处理：（）培养细胞：收获细胞 1-510 42 2)加入加入200 200 l l氯仿氯仿氯仿氯仿，震荡混匀震荡混匀20-30s20-30s，室温放置室温放置5min5min（此期间液体开始（此期间液体开始分层分层分层分层，此时不要轻易搅动液体此时不要轻易搅动液体）。）。3 3)10000 rpm)10000 rpm，离心，离心5min5min。RNA(清澈透明清澈透明)DNAProtein4 4)将清澈透明的将清澈透明的上上上上层水相层水相层水相层水相 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。三、三、RNA提取的实验操作提取的实验操作 2)加入200 l氯仿，RNA DNAProtein4)55 5)沉淀沉淀RNARNA：加入加入0.5ml0.5ml异丙醇异丙醇异丙醇异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置，上下颠倒混匀，室温放置10min10min。10000rpm 10000rpm，离心，离心10min10min。弃上清。弃上清。6 6)加加1ml1ml 75%75%75%75%乙醇乙醇乙醇乙醇洗涤管壁。洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)7 7)7500rpm)7500rpm离心离心1min1min，弃上清。，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用用TriZol试剂试剂提取提取总总RNA时时，全程均在，全程均在室温室温进进行。行。当当RNA沉淀用水溶解后，沉淀用水溶解后，应该应该注意在注意在冰上冰上操作，操作要迅速。操作，操作要迅速。5)沉淀RNA：用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在68 8)室温干燥室温干燥3 35min5min。（干燥的时间由（干燥的时间由RNARNA沉淀大小决定）沉淀大小决定）（干干燥燥后后的的沉沉淀淀应应该该是是无无无无色色色色胶胶胶胶样样样样透透透透明明明明状状状状，沉沉淀淀要要充充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项注意事项：RNA:避免放在避免放在37 C孵箱中孵箱中过过度干燥以防无度干燥以防无法溶解。法溶解。RNA沉淀必沉淀必须绝对须绝对干燥，微量乙醇残留，干燥，微量乙醇残留，容易造成容易造成RT的失的失败败，但，但过过分干燥又是造成分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因不溶解的主要原因。判断判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是沉淀是否充分干燥但又不是过过分干燥是逆分干燥是逆转录转录成功的关成功的关键环节键环节。RNA pellet：透明胶：透明胶样样干燥后干燥后应该应该无色透明无色透明8)室温干燥35min。注意事项：RNA:RNA pell79 9）RNARNA的的溶溶解解：用用加加样样器器吸吸取取冰冰冷冷DEPC-HDEPC-H2 2O O 20-3020-30 l l，加加到到RNARNA上，反复吹打溶解上，反复吹打溶解RNARNA沉淀。沉淀。溶解的溶解的RNARNA应置冰上保存应置冰上保存。1010)吸出吸出 2-32-3 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用(将用于将用于电泳电泳)。1111)剩余溶液放到冰上备用剩余溶液放到冰上备用 （将用于（将用于RTRTPCRPCR）。）。v注意：注意：RNA沉淀的溶解一定要耐心充沉淀的溶解一定要耐心充分，分，一定一定要用加要用加样器器反复反复多次吹打方可。多次吹打方可。但由于溶液体但由于溶液体积非常小，要避免出非常小，要避免出现气气泡影响泡影响RNA的溶解。的溶解。避免气泡的方法：避免气泡的方法：用加用加样样器的第一器的第一挡挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：判断溶解程度：吹打吹打时时液体流液体流动动不拐弯不拐弯为为止。止。9）RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 20-8 将将 RNA 进行行 1%琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳 9 l RNA 样品品 23 l 上上样液液轻轻混匀，混匀，上上样 电泳泳:120伏，伏，1020分分钟 注意注意:电泳槽的清泳槽的清洁及新的及新的电泳液！泳液！琼脂糖凝胶要新脂糖凝胶要新鲜配制！配制！紫外透射紫外透射仪观察察电泳泳结果果总RNA提取及免疫组化课件9RNA电泳泳结果果 rRNA可以作可以作为内部内部Marker分分子，通子，通过观察察rRNA的两条的两条带（28S和和18S）的比例，可以判）的比例，可以判断所提取断所提取mRNA是否存在降解。是否存在降解。RNA电泳并不能判断泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作是否提取成功，也不作为鉴定定RNA提取提取质量的常量的常规方法，因方法，因为在在电泳泳过程中程中RNA可能可能发生生降解降解。RNA电泳结果 rRNA可以作为内部Marker分子，通过10RNA纯度的判断 280、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物的值 A260/A280 1.82.0 1.8表明有蛋白质、苯酚的污染 2.2表明RNA已经水解成单核酸 A260/A230 2.0 2.0表明酚盐离子，硫氰酸盐或其他有机化合物污染总RNA提取及免疫组化课件11免疫组化的原理及流程介绍免疫组化的原理及流程介绍2015-07-21免疫组化的原理及流程介绍2015-07-2112主要内容主要内容免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一.免疫组化的原理免疫组化的原理二二.免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程三三.免疫组化的结果分析免疫组化的结果分析主要内容免疫组化原理及流程介绍一.免疫组化的原理二.免疫组化13免疫组化的原理免疫组化的原理 应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细应用抗原与抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。胞内的抗原进行原位定位、定性及定量检测的技术。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化的原理免疫组化原理及流程介绍14直接法直接法Tissue AntigenLabeled Antibody将荧光、酶直接标记在一抗上优点：简单方便缺点：灵敏度低每种一抗都需要进行标记 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍直接法直接法直接法Tissue AntigenLabeled Antib15间接法间接法Tissue AntigenPrimary AntibodySecondary Antibody将荧光、酶等标记在二抗上优点：灵敏度高只需要少数标记的二抗可以和相应的一抗反应 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍间接法间接法间接法Tissue AntigenPrimary Antib16免疫组化SP法SPSP法法-链霉素抗生物素蛋白链霉素抗生物素蛋白-过氧化过氧化物酶法物酶法（streptavidin-peroxidase）一抗一抗生物素标记的二抗生物素标记的二抗Streptavidin-HRPStreptavidin-HRP（HRPHRP标记的链霉亲和素）标记的链霉亲和素）简化实验步骤减少非特异性背景免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化SP法免疫组化SP法SP法-链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法 17 ABC ABC法法(Avidin Biotin-peroxidase Complex)一抗一抗生物素标记的二抗生物素标记的二抗Avidin-Biotin-HRP Avidin-Biotin-HRP ComplexComplex（亲和素（亲和素-HRP-HRP标记的生物素）标记的生物素）v亲和素与HRP标记的生物素混合，放置30分钟。v一个亲和素分子具有可与生物素结合的四个部位。v大大增加了结合到生物素上的过氧化物酶，提高了显色反应的 灵敏度。免疫组化ABC法免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化ABC法 ABC法亲和素与HRP标记的生物素混合，放置318三三 免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.3.抗原修复、暴抗原修复、暴露抗原决定簇露抗原决定簇 4.4.封闭非特异性封闭非特异性蛋白蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反应反应 8.8.显色显色 9.9.复染、脱水、复染、脱水、透明、封片透明、封片 2.2.细胞通透、封细胞通透、封闭内源性过氧化闭内源性过氧化物酶物酶 三 免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化219免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化 脱蜡与水化的脱蜡与水化的目的目的是确保抗体等其是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。景着色。免疫组化原理及流程介绍1.脱蜡与水化 脱蜡与水化的目的201)60 20 minXylene：2 10 minutes；2)100%absolute ethanol：2 5 minutes；3)95%ethanol 2 minutes；4)80%ethanol 2 minutes；5)70%ethanol 2 minutes；6)distilled water:5 min；7)PBS 洗 3 3 min。具具体体操操作作60 20 minXylene：2 10 minu21免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍2.2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的是使抗体能够充分地进入胞内目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用进行结合反应。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)细胞通透细胞通透免疫组化原理及流程介绍2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶 22免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(2)(2)封闭内源性过氧化酶封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的化物酶的活性。在传统的ABCABC法和法和SPSP法中，免疫组化反应结果容易受到法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。过氧化氢等进行灭活。免疫组化原理及流程介绍(2)封闭内源性过氧化酶 其主要231)1)用封闭通透液浸润切片用封闭通透液浸润切片 30 min 30 min（RT RT 避光）。避光）。其配法是用预热其配法是用预热 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul 120ul TritonX-100 TritonX-100 加热几分钟，在临用前加加热几分钟，在临用前加 400 ul400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作具体操作:1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。24免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3.3.抗原修复抗原修复 暴露抗原决定簇暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。免疫组化原理及流程介绍3.抗原修复 暴露抗原决定簇 25免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。胰酶修复。抗原修复的主要方法抗原修复的主要方法:酶消化方法酶消化方法一般用于细一般用于细胞内抗原胞内抗原应用高频电磁波应用高频电磁波打开蛋白质间的打开蛋白质间的交联键交联键免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般分为26免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍将将切切片片放放入入 0.01 0.01 M M 柠柠檬檬酸酸钠钠缓缓冲冲 溶溶液液（pH6.0pH6.0）后后，在在微微波波炉炉里里高高火火 4 4 min min 至至沸沸腾腾后后，取取出出，冷冷却却至至室室温温，再再加加热热，约约4 4次次，每每次次间间隔隔补补足足液液体体，防止干片。防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。具体操作（微波修复）：具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理及流程介绍将切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲27免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍4.4.封闭特异性蛋白封闭特异性蛋白组织切片上有些组织切片上有些剩余剩余的位点可以与一的位点可以与一抗抗非特异性结合非特异性结合，造成后续结果的，造成后续结果的假假阳性阳性。封封闭闭血血清清一一般般是是和和二二抗抗同同一一来来源源的的，血血清清中中有有一一些些动动物物自自身身的的抗抗体体，预预先先能能和和组织中有交叉反应的位点发生结合。组织中有交叉反应的位点发生结合。免疫组化原理及流程介绍4.封闭特异性蛋白组织切片上有些剩余的28免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 将切片取出将切片取出,周围水分用滤纸吸干周围水分用滤纸吸干,用组化用组化笔在组织周围画上圈笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入在圆圈内组织滴入 5%5%羊羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温室温 (约约30)30)下下101030min30min。具体操作：具体操作：大一点免疫组化原理及流程介绍 将切片取出,周围水分用滤纸29免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗:可以特异结合底物，就是识别出可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。合与否用肉眼是看不出来的。免疫组化原理及流程介绍5.一抗孵育一抗:可以特异结合底物，就30 一一抗抗孵孵育育条条件件在在免免疫疫组组化化反反应应中中最最重重要要，包括孵育时间和抗体浓度。包括孵育时间和抗体浓度。一一抗抗孵孵育育温温度度有有几几种种：4 4度度、室室温温、3737度度，其其中中4 4度度效效果果最最佳佳；孵孵育育时时间间：这这与与温温度度、抗抗体体浓浓度度有有关关，一一般般3737度度1-2h1-2h，然然后后4 4度度过过夜夜和和从从冰冰箱箱拿拿出出后后3737度度复复温温45min45min。具具体体条条件件还还要要摸索。摸索。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；防止脱片；2.使抗原使抗原抗体结合更稳定。抗体结合更稳定。一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗31 甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入湿盒中室温）后，放入湿盒中室温 1 1 小时，然后小时，然后 4 4 度过夜，冰箱中取出后需度过夜，冰箱中取出后需37 37 复温复温 45 min 45 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体做法：具体做法：甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直32免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗:可以和一抗结合，并带有可以被可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记检测出的标记(如带荧光、放射性、化如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。学发光或显色基团），作用是检测一抗。免疫组化原理及流程介绍6.二抗孵育二抗:可以和一抗结合，并带33 二二抗抗孵孵育育条条件件：二二抗抗一一般般室室温温或或3737度度30min-1h30min-1h，具体时间需要摸索。，具体时间需要摸索。但但在在免免疫疫组组化化中中我我们们一一般般先先把把二二抗抗浓浓度度和和孵孵育育时时间间先先定定下下，然然后后去去摸摸索索一一抗抗浓浓度度和和孵育时间。孵育时间。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，34 1)1)将一抗倒掉并用将一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5 min5 5 min5 次；次；2)2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入稀释的二抗后放入 37 37恒温烤箱中恒温烤箱中 30 min。3)3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作：具体操作：1)将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min5 次；免疫357.SP7.SP反应反应 SP SP染色法即链霉素抗生物素蛋白染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。生物素过氧化酶连接法。该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合而后再结合POPO基。基。7.SP反应 SP染色法即链霉素抗生物素蛋白 生物素过36 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1）加加入入 SP SP 复复合合液液后后放放入入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。2 2）用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具体操作：具体操作：SPSP染色法的特点染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。灵敏特异性低，成本低。免疫组化原理及流程介绍1）加入 SP 复合液后放入 3737免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8.8.显色显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助于其他某些化直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察有利于显微镜下观察。免疫组化原理及流程介绍8.显色 在免疫组化中，由于抗原抗38免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（通常在过氧化物酶（HRPHRP）法中，显）法中，显色剂为色剂为DABDAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液二氨基联苯胺显色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（HRP）法中39免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍9 9、复染、脱水、透明、封片、复染、脱水、透明、封片 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。振洗，在放入氨水中返蓝即可。免疫组化原理及流程介绍9、复染、脱水、透明、封片 复401)1)用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用双蒸水洗后，用双蒸水洗 5 min 5 min；加；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染蛋白染 20 s 20 s），自来水冲洗，双蒸水洗），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min 5 min，再，再用用 PBS PBS 返蓝返蓝 5 min 5 min。2)2)脱水脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absolute ethanol:(1-2)min；100%absolute ethanol:(1-2)min。3)3)透明：透明：Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min 4)4)封片：中性树胶。封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1)用 PBS 3 次3min 后，用双蒸水洗 5 m41免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四四 免疫组化结果分析免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。免疫组化原理及流程介绍四 免疫组化结果分析免疫组化结果的判断42免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1阳性染色特点阳性染色特点 AgAg定位，胞浆、胞核、胞膜、间质定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色具有结构性。（非特异性染色 细胞与细胞与组织无区别）组织无区别）染色强度不同：颜色深浅不一（非染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色特异性染色 弥散性均匀）。弥散性均匀）。须从以下几个方面综合评价：须从以下几个方面综合评价：免疫组化原理及流程介绍1阳性染色特点须从以下几个方面综合43 2 2组织切片制作过程的影响组织切片制作过程的影响 固定不良固定不良非特异性染色，显示不均。非特异性染色，显示不均。边边缘缘干干燥燥非非特特异异性性染染色色（常常见见），加抗体时勿干片。加抗体时勿干片。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3 3人工假象与特异性结果显示不在同一人工假象与特异性结果显示不在同一 平平面上。面上。2组织切片制作过程的影响免疫组化原理及流程介绍441.1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。性染色的位置。2.2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但液前甩干洗涤液，但又防止干片又防止干片 。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍注意事项：注意事项：1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。免疫组453.3.以下原因可能导致片子着色不均匀：以下原因可能导致片子着色不均匀：脱蜡不充分。可以脱蜡不充分。可以 60 60 烤烤 20 min 20 min，立即放入新鲜，立即放入新鲜的的 二甲苯中；二甲苯中；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；二抗等试剂；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育后抗体孵育后 PBS PBS 冲洗不充分。冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍3.以下原因可能导致片子着色不均匀：免疫组化原理及流程介绍465.PBS5.PBS的的PHPH和离子强度的使用。和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍建议建议PH在在7.4-7.6浓度是浓度是0.01M。中中性性及及弱弱硷硷性性条条件件（PH7-8PH7-8）有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而酸酸性性条条件件则则有有利利于于分分解解；低低离离子子强强度度有有利利于于免免疫疫复复合合物物的的形形成成，而而高高离离子子强强度度则则有有利利于分解。于分解。5.PBS的PH和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍建议474.4.一抗的清洗：一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（1 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；用浸洗方式；（3 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。结合的物质。4.一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍（1）单独冲洗，防止交48免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍谢 谢免疫组化原理及流程介绍谢 谢49