时间分辨荧光免疫分析课件

时间分辨分辨荧光免疫分析光免疫分析时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析开展历程开展历程19791979年，可标记抗体的年，可标记抗体的Eu3+-Eu3+-二酮体二酮体-EDTA-EDTA19831983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定定HCGHCG和磷酸酯酶和磷酸酯酶A A“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究获套研究获20032003年度国家科技进步二等奖年度国家科技进步二等奖2021/1/122开展历程1979年，可标记抗体的Eu3+-二酮体-EDT一、时间分辨荧光免疫分析特点一、时间分辨荧光免疫分析特点2021/1/123一、时间分辨荧光免疫分析特点2021/1/1231.1.荧光衰减时间长荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间2021/1/1241.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间2021/1/124常见荧光物质荧光寿命常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光物质荧光寿命荧光寿命Eu3+714 s非特异性荧光背景非特异性荧光背景1-10 ns人血清白蛋白人血清白蛋白4.1 ns人球蛋白、血红蛋白人球蛋白、血红蛋白3.0 ns细胞色素细胞色素C3.5 nsFITC4.5 ns丹磺酰氯丹磺酰氯14 ns苯胺萘磺酸苯胺萘磺酸16 ns稀土螯合物稀土螯合物104-106 ns2021/1/125常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命Eu3+714 s非特2.Stokes位移大位移大 荧光物质荧光物质激发波长激发波长发射波长发射波长Stokes位移位移Eu-(-NTA)3340 nm613 nm273 nmSm-(-NTA)3340 nm600 nm260 nmTb-(PTA)3295 nm490/543 nm195/248 nmDy-(PTA)3295 nm573 nm278 nm2021/1/1262.Stokes位移大 荧光物质激发波长发射波长Stoke镧系元素发射峰窄2021/1/127镧系元素发射峰窄2021/1/127优点优点灵敏度高10-18mol/孔原子标记多标记技术2021/1/128优点2021/1/128二、时间分辨荧光免疫分析体系二、时间分辨荧光免疫分析体系非均相时间分辨荧光免疫分析非均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析2021/1/129二、时间分辨荧光免疫分析体系2021/1/129一非均相时间分辨荧光免疫分析一非均相时间分辨荧光免疫分析时间分辨固相免疫分析时间分辨固相免疫分析解离增强荧光免疫分析解离增强荧光免疫分析酶放大免疫分析酶放大免疫分析2021/1/1210一非均相时间分辨荧光免疫分析2021/1/12101.1.时间分辨固相免疫分析时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高灵敏度一般不高2021/1/12111.时间分辨固相免疫分析灵敏度一般不高2021/1/1211实例实例加拿大加拿大Cyber Fluor的的FIAgen系统系统Eu3+-BCPDA为标记物为标记物2021/1/1212实例2021/1/12122.2.解离增强分析解离增强分析原理示意图原理示意图2021/1/12132.解离增强分析原理示意图2021/1/12131 1双功能螯合剂双功能螯合剂EDTA衍生物、衍生物、DTTA衍生物、衍生物、DTPA衍生物衍生物一端与镧系离子螯合，一端与抗原一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接抗体连接近中性时，螯合物足够稳定近中性时，螯合物足够稳定酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放酸性条件下，镧系离子迅速、彻底释放Eu-DTTA应用最广泛应用最广泛2021/1/12141双功能螯合剂EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍2 2增强液增强液增强原理图增强原理图一般增强百万倍一般增强百万倍2021/1/12152增强液增强原理图2021/1/1215-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2复合物复合物TOPO：荧光增强协同剂：荧光增强协同剂Triton X-100：外表活性剂，形成胶束：外表活性剂，形成胶束醋酸：酸性介质醋酸：酸性介质2021/1/1216-NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2复合物20213 3酶放大酶放大酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物螯合剂生成荧光强、寿命长的三元复合物ALP2021/1/12173酶放大酶催化底物，生成的产物与溶液中镧系离子、螯合剂生酶放大免疫分析示意图酶放大免疫分析示意图2021/1/1218酶放大免疫分析示意图2021/1/1218双标记测定双标记测定AFPAFP和和-hCG-hCG-NTA作为螯合剂作为螯合剂340 nm 激发，激发，Eu:615 nm,820 s；Sm:643 nm,88 s2021/1/1219双标记测定AFP和-hCG-NTA 作为螯合剂2021/1二均相免疫分析二均相免疫分析基于时间分辨荧光共振能量转移无需洗涤、别离、加增强液2021/1/1220二均相免疫分析2021/1/1220TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大发射二吡啶二胺，最大发射615nm，供体，供体APC：别藻蓝蛋白，最大发射：别藻蓝蛋白，最大发射665nm，受体，受体能量转移效率最高的供体能量转移效率最高的供体/受体对受体对2021/1/12212021/1/1221时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图2021/1/1222时间分辨荧光共振能量转移免疫分析示意图2021/1/1222三、时间分辨免疫分析方法三、时间分辨免疫分析方法夹心法夹心法竞争法竞争法间接法捕获法生物素-亲和素放大法2021/1/1223三、时间分辨免疫分析方法夹心法2021/1/12231.夹心法夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法2021/1/12241.夹心法双抗体夹心法2021/1/1224双抗原夹心法双抗原夹心法2021/1/1225双抗原夹心法2021/1/12252.竞争法竞争法2021/1/12262.竞争法2021/1/12263.间接法间接法间接法测定间接法测定HCV抗体抗体2021/1/12273.间接法间接法测定HCV抗体2021/1/12274.捕获法捕获法捕获法测定抗捕获法测定抗-CMV IgM2021/1/12284.捕获法捕获法测定抗-CMV IgM2021/1/125.生物素生物素-亲和素法亲和素法生物素生物素-亲和素检测亲和素检测PAPP-A2021/1/12295.生物素-亲和素法生物素-亲和素检测PAPP-A2021四、应用四、应用1.1.肿瘤标志物检测肿瘤标志物检测2.2.传染病检测传染病检测3.3.糖尿病检测糖尿病检测4.4.激素检测激素检测5.5.细胞活性检测细胞活性检测2021/1/1230四、应用2021/1/12301.肿瘤标志物AFP测定：双抗体夹心法固相包被抗体参加样品或标准品参加Eu标记抗体参加增强液测定荧光灵敏度：0.17 U/ml2021/1/12311.肿瘤标志物AFP测定：双抗体夹心法2021/1/12312.传染病检测梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法强阳性血清和正常人血清分别作为阴阳对照阴性对照、阳性对照和样品参加板上，孵育参加铕标记抗原，孵育参加增强液，检测荧光符合中国药品生物制品鉴定所结果2021/1/12322.传染病检测梅毒螺旋体抗体检测：双抗原夹心法2021/13.糖尿病检测C-肽检测：双抗体夹心法抗体包被微孔板参加标准品或样品参加铕标记抗体增强液，检测荧光灵敏度：2021/1/12333.糖尿病检测C-肽检测：双抗体夹心法2021/1/12334.激素检测三碘甲状腺原氨酸T3：竞争法微孔板中参加抗体标准品或样品、铕标记T3参加增强液，测定荧光灵敏度：2021/1/12344.激素检测三碘甲状腺原氨酸T3：竞争法2021/1/15.细胞活性检测测定细胞活性原理图T T：靶细胞：靶细胞E E：效应细胞：效应细胞2021/1/12355.细胞活性检测测定细胞活性原理图T：靶细胞2021/1/1NK细胞活性靶细胞：K562细胞参加EuCl3,DTPA,硫酸葡聚糖，4C孵育 向靶细胞中参加效应细胞NK细胞，孵育，离心，测上清荧光计算比释放率%2021/1/1236NK细胞活性靶细胞：K562细胞2021/1/1236谢谢谢谢内容总结时间分辨荧光免疫分析。1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A。“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究获2003年度国家科技进步二等奖22021/1/12。2021/1/12。常见荧光物质荧光寿命。104-106 ns。EDTA衍生物、DTTA衍生物、DTPA衍生物。一端与镧系离子螯合，一端与抗原/抗体连接。340 nm 激发，Eu:615 nm,820 s。谢谢内容总结时间分辨荧光免疫分析。1983年，建立时间分辨荧光免