大肠杆菌感受态细胞的制备与转化ppt课件

实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化【实验目的】学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理与技术。学习大肠杆菌转化的原理与技术。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化【实验目的】大肠杆菌感【实验原理实验原理】在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2【实验原理】大肠杆菌感受态细胞的制备与转化2转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。其原理是细菌处于0的CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细菌表面，经42短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化3转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化4转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pUCm-T质粒（T-载体）共保温，实现转化。由于pUCm-T质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUCm-T，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUCmT。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化5本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2【设备、材料与试剂】一、设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。二、材料E.coliDH5菌株:R,M,Amp；pUCmT质粒DNA:购自上海生工生物工程有限公司。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化6【设备、材料与试剂】大肠杆菌感受态细胞的制备与转化6三、试剂1.LB固体和液体培养基2.Amp母液3.含Amp的LB固体培养基4.SOC液体培养基5.0.1mol/LCaCl2溶液大肠杆菌感受态细胞的制备与转化7三、试剂大肠杆菌感受态细胞的制备与转化7【实验步骤实验步骤】一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5单菌落,接种于20mlLB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37振荡培养1-2小时至OD6000.5左右。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化8【实验步骤】大肠杆菌感受态细胞的制备与转化8二、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分钟，然后于4下5000rpm离心10分钟。2、弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后，4下5000rpm离心10分钟，弃去上清。3、每50ml初始培养物用200l预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重悬每份细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化9二、感受态细胞的制备(CaCl2法)大肠杆菌感受态细三、转化1、取200l感受态细胞悬液，转移至无菌的微量离心管中，置冰上。2、加入连接产物10l，轻轻摇匀，冰上放置60分钟。3、42水浴中热击2分钟，热激后迅速置于冰上冷却2分钟。4、向管中加入800lSOC液体培养基(不含Amp)，混匀后37振荡培养30分钟，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。（其间可以将IPTG7l和X-Gal40l涂布于预制的Amp平板上）。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化10三、转化1、取200l感受态细胞悬液，转移至无菌的微5、将上述菌液以3000rpm离心20秒，弃大部分上清，用剩余的100l上清重悬菌体，涂布于含Amp的筛选平板上（已涂布IPTG7l和X-Gal40l），正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养16-24小时。同时做两个对照:对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化115、将上述菌液以3000rpm离心20秒，弃大部分上清，用附录：LB液体培养基：胰蛋白胨1酵母提取物0.5NaCl1用NaOH调pH至7.0，定容至1L，灭菌。含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化12附录：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化12【注意事项注意事项】为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1、细胞生长状态和密度：最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化13【注意事项】大肠杆菌感受态细胞的制备与转化132、质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化142、质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态3、试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化153、试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度【思考题】1、如何正确地设置连接和转化的各种对照？其意义何在？2、如何提高连接和转化的效率？大肠杆菌感受态细胞的制备与转化16【思考题】大肠杆菌感受态细胞的制备与转化16