大肠杆菌基因工程课件

基因工程基因工程 Genetic EngineeringGenetic Engineering主讲教师：李黄金主讲教师：李黄金Email:Email:任课教师：张文峰、陈伟任课教师：张文峰、陈伟生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院1313大肠杆菌基因工程(1)1基因工程GeneticEngineering大肠杆基因工程课程内容5 2 3 4 1 6 7 基因工程概论分子克隆单元操作分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程大肠杆菌基因工程酵母基因工程酵母基因工程动物基因工程动物基因工程植物基因工程植物基因工程基因工程进展基因工程进展大肠杆菌基因工程(1)2基因工程课程内容5234167基因工程概论分子回顾：基因工程的基本目的是什么？回顾：基因工程的基本目的是什么？回顾：基因工程的基本目的是什么？回顾：基因工程的基本目的是什么？1 1、获取、整理遗传信息资源：、获取、整理遗传信息资源：破解生命之谜、利用基因资源破解生命之谜、利用基因资源2 2、生产功能蛋白或化学原料、生产功能蛋白或化学原料 研究用途：基因功能研究，工具酶、免疫分析用抗原研究用途：基因功能研究，工具酶、免疫分析用抗原/抗体抗体 医药用途：蛋白医药用途：蛋白/多肽药物、抗原（疫苗）、抗体（治疗多肽药物、抗原（疫苗）、抗体（治疗/诊诊 断）、免疫毒素等。断）、免疫毒素等。工业用途：工业用酶、工业原料工业用途：工业用酶、工业原料3 3、改良生物性状：、改良生物性状：分子育种（改良分子育种（改良/创造）、基因治疗创造）、基因治疗/免疫免疫大肠杆菌基因工程(1)3回顾：基因工程的基本目的是什么？1、获取、整理遗传信息资源：问题：如何利用基因资源？问题：如何利用基因资源？问题：如何利用基因资源？问题：如何利用基因资源？克隆目的基因克隆目的基因转入特定转入特定宿主宿主表达目的基因表达目的基因生产蛋白生产蛋白/多肽：强调高效多肽：强调高效分子育种分子育种/基因治疗基因治疗/免疫：强调可控免疫：强调可控全基因：基因文库全基因：基因文库/PCR/PCR编码序列：编码序列：cDNAcDNA文库文库/RT-PCR/RT-PCR/合成合成选择宿主（特点、优缺点？）选择宿主（特点、优缺点？）构建表达载体（关键元件、调控原理？）构建表达载体（关键元件、调控原理？）转基因（转化系统、导入方法？）转基因（转化系统、导入方法？）大肠杆菌基因工程(1)4问题：如何利用基因资源？克隆目的基因转入特定宿主表达目的基因基因工程主要宿主系统 原核细胞原核细胞(Prokaryotic)真菌（真菌（Fungus)昆虫昆虫(Baculovirus)高等真核细胞（高等真核细胞（Eukaryotic)人（基因治疗）人（基因治疗）动、植物（基因农场）动、植物（基因农场）大肠杆菌基因工程(1)5基因工程主要宿主系统原核细胞(Prokaryotic)主要的蛋白质生产宿主系统主要的蛋白质生产宿主系统I原核：原核：大肠杆菌大肠杆菌Escherichia coli*枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis*II低等真核：低等真核：酿酒酵母酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 毕赤酵母毕赤酵母Pichia pastoris*汉森酵母汉森酵母Hansenula polymopha*黑曲霉菌黑曲霉菌Aspergillus niger*III高等真核：高等真核：中国仓鼠细胞（中国仓鼠细胞（CHO）*昆虫细胞昆虫细胞杆状病毒杆状病毒*重点：各自优缺点是什么？重点：各自优缺点是什么？大肠杆菌基因工程(1)6主要的蛋白质生产宿主系统I原核：大肠杆菌Escheric表达载体的基本条件（关键元件）表达载体的基本条件（关键元件）表达载体的基本条件（关键元件）表达载体的基本条件（关键元件）1 1、高效的、可调控的表达元件、高效的、可调控的表达元件、高效的、可调控的表达元件、高效的、可调控的表达元件 1 1）转录与转录后水平：转录与转录后水平：转录与转录后水平：转录与转录后水平：DNA mRNADNA mRNA原核：启动子、终止子原核：启动子、终止子原核：启动子、终止子原核：启动子、终止子真核：启动子、终止子、增强子、真核：启动子、终止子、增强子、真核：启动子、终止子、增强子、真核：启动子、终止子、增强子、PolyAPolyA位点、内含子位点、内含子位点、内含子位点、内含子 2 2）翻译水平翻译水平翻译水平翻译水平原核：核糖体结合位点（如原核：核糖体结合位点（如原核：核糖体结合位点（如原核：核糖体结合位点（如SDSD序列）序列）序列）序列）真核：真核：真核：真核：5-5-端非翻译区（端非翻译区（端非翻译区（端非翻译区（5-UTR5-UTR）3)3)翻译后水平翻译后水平翻译后水平翻译后水平:信号肽信号肽信号肽信号肽重点：各宿主系统表达载体重点：各宿主系统表达载体的关键元件、调控原理与的关键元件、调控原理与 优化优化策略？策略？大肠杆菌基因工程(1)7表达载体的基本条件（关键元件）1、高效的、可调控的表达元件重表达载体的基本条件（关键元件）表达载体的基本条件（关键元件）表达载体的基本条件（关键元件）表达载体的基本条件（关键元件）3 3、便于筛选、便于筛选、便于筛选、便于筛选 大肠杆菌中的筛选标记（表达载体构建）大肠杆菌中的筛选标记（表达载体构建）大肠杆菌中的筛选标记（表达载体构建）大肠杆菌中的筛选标记（表达载体构建）最终宿主系统的筛选标记（转基因宿主筛选）最终宿主系统的筛选标记（转基因宿主筛选）最终宿主系统的筛选标记（转基因宿主筛选）最终宿主系统的筛选标记（转基因宿主筛选）4 4、便于目的基因亚克隆：多克隆位点、便于目的基因亚克隆：多克隆位点、便于目的基因亚克隆：多克隆位点、便于目的基因亚克隆：多克隆位点2 2、高拷贝数与遗传稳定、高拷贝数与遗传稳定、高拷贝数与遗传稳定、高拷贝数与遗传稳定 自主复制（高拷贝、不稳定）自主复制（高拷贝、不稳定）自主复制（高拷贝、不稳定）自主复制（高拷贝、不稳定）整合（低拷贝、稳定）整合（低拷贝、稳定）整合（低拷贝、稳定）整合（低拷贝、稳定）大肠杆菌基因工程(1)8表达载体的基本条件（关键元件）3、便于筛选2、高拷贝典典型型的的原原核核表表达达载载体体大肠杆菌基因工程(1)9典型的原核表达载体大肠杆菌基因工程(1)9典典型型的的原原核核表表达达载载体体大肠杆菌基因工程(1)10典型的原核表达载体大肠杆菌基因工程(1)10典典型型的的真真核核表表达达载载体体大肠杆菌基因工程(1)11典型的真核表达载体大肠杆菌基因工程(1)11第三章第三章 大肠杆菌基因工大肠杆菌基因工程程Escherichia coli（SEM，14000）大肠杆菌基因工程(1)12第三章大肠杆菌基因工程Escherichiacoli四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章第三章 大肠杆菌基因工大肠杆菌基因工程程大肠杆菌基因工程(1)13四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略二一、一、一、一、大肠杆菌表达系统的优缺点大肠杆菌表达系统的优缺点大肠杆菌表达系统的优缺点大肠杆菌表达系统的优缺点大肠杆菌基因工程(1)14一、大肠杆菌表达系统的优缺点大肠杆菌基因工程(1)14原核细胞与真核细胞的差别原核细胞与真核细胞的差别大肠杆菌基因工程(1)15原核细胞与真核细胞的差别大肠杆菌基因工程(1)15生长速度惊人的大肠杆菌生长速度惊人的大肠杆菌大肠杆菌基因工程(1)16生长速度惊人的大肠杆菌大肠杆菌基因工程(1)16遗传背景清楚（遗传背景清楚（44054405个个ORFORF），便于基因操作），便于基因操作表达水平高，遗传较稳定表达水平高，遗传较稳定 优良的工业性能：优良的工业性能：繁殖迅速、培养简单、操作方便、繁殖迅速、培养简单、操作方便、被美国被美国FDAFDA认定为安全的重组药物生产系统认定为安全的重组药物生产系统大肠杆菌表达系统的优点大肠杆菌表达系统的优点大肠杆菌表达系统的优点大肠杆菌表达系统的优点大肠杆菌基因工程(1)17遗传背景清楚（4405个ORF），便于基因操作表达水平高，遗胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善体），分泌机制不完善体），分泌机制不完善体），分泌机制不完善缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等）基化蛋白、结构复杂的蛋白等）基化蛋白、结构复杂的蛋白等）基化蛋白、结构复杂的蛋白等）细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠杆菌表达系统的缺点大肠杆菌表达系统的缺点大肠杆菌表达系统的缺点大肠杆菌表达系统的缺点大肠杆菌基因工程(1)18胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善初次尝试扫盲初次尝试扫盲乱棍打枣入门乱棍打枣入门系统优化中级系统优化中级自成一体高手自成一体高手成功的实验都是一样的，成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸失败的实验各有各的不幸大肠杆菌基因工程(1)19二、大肠杆菌系统高效表达原理启动子（转录）启动子（转录）终止子（转录）终止子（转录）核糖体结合位点（翻译）核糖体结合位点（翻译）密码子（翻译）密码子（翻译）质粒拷贝数（转录）质粒拷贝数（转录）大肠杆菌基因工程(1)20二、大肠杆菌系统高效表达原理启动子（转录）终止子（转录）核糖大肠杆菌系统表达载体的基本元件大肠杆菌系统表达载体的基本元件大肠杆菌系统表达载体的基本元件大肠杆菌系统表达载体的基本元件A A、目的基因：、目的基因：编码外源蛋白的结构基因编码外源蛋白的结构基因B B、转录元件：、转录元件：启动子、终止子启动子、终止子C C、翻译元件：、翻译元件：核糖体结合位点、翻译起始位点核糖体结合位点、翻译起始位点D D、克隆元件：、克隆元件：克隆位点、复制原点、标记基因克隆位点、复制原点、标记基因E E、翻译后元件（非必须）、翻译后元件（非必须）：信号肽、融合肽信号肽、融合肽大肠杆菌基因工程(1)21大肠杆菌系统表达载体的基本元件A、目的基因：编码外源蛋白的结大肠杆菌系统表达载体的物理图谱大肠杆菌系统表达载体的物理图谱大肠杆菌基因工程(1)22大肠杆菌系统表达载体的物理图谱大肠杆菌基因工程(1)221 1、启动子与外源基因表达、启动子与外源基因表达*是是DNADNA链上一段能与链上一段能与RNARNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始RNARNA合成的合成的 序列。序列。*是基因表达最关键调控元件（没有启动子，基因就不能是基因表达最关键调控元件（没有启动子，基因就不能转录）。转录）。*启动子有种属特异性（如真核的在原核宿主中无效）启动子有种属特异性（如真核的在原核宿主中无效）*有组成型和诱导型二大类有组成型和诱导型二大类启动子启动子 (Promoter)(Promoter)大肠杆菌基因工程(1)231、启动子与外源基因表达*是DNA链上一段能与RNA聚合组成型与诱导型启动子组成型与诱导型启动子*无需诱导无需诱导*整个生长过程一直不停地表达目的蛋白整个生长过程一直不停地表达目的蛋白*一般采用基础代谢关键酶基因的启动子一般采用基础代谢关键酶基因的启动子*不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物*表达量通常不高：过量或者有害表达影响细菌生长表达量通常不高：过量或者有害表达影响细菌生长组成型表达系统组成型表达系统大肠杆菌基因工程(1)24组成型与诱导型启动子组成型表达系统大肠杆菌基因工程(1)24组成型与诱导型启动子组成型与诱导型启动子*只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物*使生长相与表达相分开，避免表达与生长争营养使生长相与表达相分开，避免表达与生长争营养和对菌体的毒害和对菌体的毒害*可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解*特别适合解决有毒蛋白的表达特别适合解决有毒蛋白的表达*启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。诱导表达的，也属于诱导表达系统。诱导型表达系统诱导型表达系统大肠杆菌基因工程(1)25组成型与诱导型启动子*只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产原核基因启动子原核基因启动子原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：序列组成：（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游盒，位于转录起始位点上游510bp，一般，一般由由68个碱基组成，富含个碱基组成，富含A和和T，故又称为，故又称为TATA盒或盒或10区。区。（2）35区，位于转录起始位点上游区，位于转录起始位点上游35bp处，故称处，故称35区，一般由区，一般由10个碱基组成。个碱基组成。大肠杆菌基因工程(1)26原核基因启动子原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核启动子保守序列启动子保守序列启动子保守序列启动子保守序列-35-35区序列区序列-10-10区序列区序列P Pl ll lLLP PrecArecAP PtrptrpP PlaclacP PtraAtraAP Ptactac启动子启动子T T G A C AT T G A C AG A T A C TG A T A C TT T G A T AT T G A T AT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C TT A G A C AT A G A C AT A A T G TT A A T G TT T T A C AT T T A C AT A T A A TT A T A A TT T G A C AT T G A C AT A T A A TT A T A A TP Ptactac =3 3 P Ptrptrp =1111 P PlaclacP Ptactac =3 3 P Ptrptrp =1111 P Placlac大肠杆菌基因工程(1)27启动子保守序列-35区序列-10区序列PlLPrecAP启动子的筛选启动子的筛选ApAprroriorigalKgalKpKO1pKO1终止子终止子采用鸟枪法策略，将合适大小的采用鸟枪法策略，将合适大小的DNADNA片段片段克隆到启动子探针质粒克隆到启动子探针质粒pKO1pKO1上上宿主细胞染色体宿主细胞染色体DNADNA上的上的galEgalE、galTgalT与质与质粒上报告基因粒上报告基因galkgalk的表达产物联合作用，的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化转化galEgalE+、galTgalT+、galKgalK-的大肠杆菌受体菌株的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆大肠杆菌基因工程(1)28启动子的筛选AprorigalKpKO1终止子采用鸟枪法策略常用原核基因启动子常用原核基因启动子lac(乳糖启动子乳糖启动子)trp(色氨酸启动子色氨酸启动子)tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子PL和和PR(噬菌体的左向和右向启动子噬菌体的左向和右向启动子)T7T7启动子启动子大肠杆菌基因工程(1)29常用原核基因启动子lac(乳糖启动子)大肠杆菌基因工程(启动子启动子PP乳糖启动子（乳糖启动子（P Placlac）负调控（负调控（lacIlacI）：）：OOPPOO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的PPlaclac与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基基底水平转录基底水平转录底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱导物可以使启动子启动子PPlaclac介导的转录大幅介导的转录大幅提高提高大肠杆菌基因工程(1)30启动子P乳糖启动子（Plac）OPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖PP乳糖启动子乳糖启动子P PlaclaclaclacOOPPOO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的PPlaclac与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基基底水平转录基底水平转录底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱导物可以使启动子启动子PPlaclac介导的转录大幅介导的转录大幅提高提高lacI负调控负调控转录受转录受CAP正调控和正调控和lacI负调控负调控大肠杆菌基因工程(1)31P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基PP乳糖启动子乳糖启动子P PlaclaclaclacOOPPOO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的PPlaclac与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基基底水平转录基底水平转录底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱导物可以使启动子启动子PPlaclac介导的转录大幅介导的转录大幅提高提高转录受转录受CAP正调控和正调控和lacI负调控负调控lacI负调控负调控大肠杆菌基因工程(1)32P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基PP乳糖启动子乳糖启动子P PlaclaclaclacOOPPOO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的PPlaclac与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基高水平转录高水平转录底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱导物可以使启动子启动子PPlaclac介导的转录大幅介导的转录大幅提高提高转录受转录受CAP正调控和正调控和lacI负调控负调控lacI负调控负调控大肠杆菌基因工程(1)33P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基PP乳糖启动子乳糖启动子P PlaclaclaclacOO高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白诱导诱导乳糖乳糖异丙基异丙基-bb-D-D-硫硫代半乳糖苷（代半乳糖苷（IPTGIPTG）野生型的野生型的PPlaclac与其控制区与其控制区OOlaclac偶联在一起，在没有诱导物偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使底水平表达；诱导物可以使启动子启动子PPlaclac介导的转录大幅介导的转录大幅提高提高转录受转录受CAP正调控和正调控和lacI负调控负调控lacI负调控负调控大肠杆菌基因工程(1)34P乳糖启动子PlacO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b问题问题1 1：葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏，葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏，不便于发酵培养基设计不便于发酵培养基设计 对策：对策：采用突变型采用突变型Plac UV5（不受葡萄糖阻遏）（不受葡萄糖阻遏）P Placlac -lacI-lacI-lacI-lacI 调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略大肠杆菌基因工程(1)35Plac-lacI调控模式的问题与策略大肠杆菌基因工程(PPlaclacCAPCAP正调控正调控OOPPlaclacOO高效转录高效转录葡萄糖代谢葡萄糖代谢野生型的野生型的PPlaclac上游附近拥有上游附近拥有代谢激活蛋白（代谢激活蛋白（CAPCAP）结合结合区，区，cAMPcAMP激活激活CAPCAP，CAPCAP基底水平转录基底水平转录结合启动子控制区，进而促结合启动子控制区，进而促进进PPlaclac介导的转录。葡萄糖介导的转录。葡萄糖代谢使代谢使cAMPcAMP减少，也能阻减少，也能阻遏遏PPlaclac介导的转录。因此，介导的转录。因此，可采用突变手段构建抗葡萄可采用突变手段构建抗葡萄糖代谢阻遏的糖代谢阻遏的突变型，突变型，即即PPlac lac UV5UV5CAPCAPcAMPcAMPcAMPcAMP浓度降低浓度降低PPlac lac UV5UV5OO高效转录高效转录突变型乳糖启动子突变型乳糖启动子P Plac lac UV5UV5大肠杆菌基因工程(1)36PlacCAP正调控OPlacO高效转录葡萄糖代谢野生型的P问题问题2 2乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作为诱导剂乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作为诱导剂对策对策采用采用“安慰诱导剂安慰诱导剂”IPTGIPTG（不被降解和代谢）（不被降解和代谢）P Placlac -lacI-lacI-lacI-lacI 调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略 IPTG：异丙基D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thio galactoside)大肠杆菌基因工程(1)37问题2Plac-lacI调控模式的问题与策略IPTG：问题问题3 3：宿主宿主lacI lacI 阻遏蛋白表达量不高，无法满足多拷贝质粒的需求，阻遏蛋白表达量不高，无法满足多拷贝质粒的需求，导致较高的本底表达（即无诱导表达）导致较高的本底表达（即无诱导表达）对策对策 A A、采用能过量表达、采用能过量表达 lacI lacI 阻遏蛋白的阻遏蛋白的 lacI q lacI q 突变菌株突变菌株 B B、在、在 载体上引入载体上引入 lacI q lacI q 基因基因P Placlac -lacI-lacI-lacI-lacI 调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略调控模式的问题与策略大肠杆菌基因工程(1)38问题3：Plac-lacI调控模式的问题与策略大肠杆菌基启动子启动子PPtrptrp色氨酸启动子（色氨酸启动子（P Ptrptrp）OOtrptrp除去除去色氨酸色氨酸色氨酸启动子色氨酸启动子PPtrptrp受色氨酸受色氨酸-阻阻遏遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录基底水平转录或者加入或者加入3-3-吲哚丙烯酸（吲哚丙烯酸（IAAIAA），），便可有效地解除阻遏抑制作用。便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加中往往添加IAAIAA诱导诱导PtrpPtrp介导的目介导的目基因的表达基因的表达色氨酸色氨酸或加或加3-3-吲哚丙烯酸吲哚丙烯酸高效转录高效转录阻遏蛋白阻遏蛋白（IAAIAA）OOtrptrpPPtrptrp高效转录高效转录OOtrptrpPPtrptrp大肠杆菌基因工程(1)39启动子Ptrp色氨酸启动子（Ptrp）Otrp除去色氨酸色氨nn受受受受 lacI lacI 阻遏蛋白调控阻遏蛋白调控阻遏蛋白调控阻遏蛋白调控杂合型启动子杂合型启动子P PtactactactacnnP Ptactac =P Ptrptrp 的的的的-35-35区区区区 +P Placlac的的的的-10-10区区区区nnP Ptactac =3 3 P Ptrptrp =1111 P Placlac（T T G A C AT T G A C A）（T A T A A TT A T A A T）受什么诱导？受什么诱导？大肠杆菌基因工程(1)40受lacI阻遏蛋白调控杂合型启动子PtacPtac=l l噬菌体启动子噬菌体启动子PL PL/PR PRnn受受CICI阻遏蛋白阻遏阻遏蛋白阻遏nnCICI为组成型表达为组成型表达nn常采用温度敏感型突变常采用温度敏感型突变cIcI857857nncIcI857857阻遏蛋在阻遏蛋在4242时失活脱落，时失活脱落，PPLL便可介导目的基因的表达便可介导目的基因的表达nn实践中，实践中，228-378-37培养，培养，4242诱导。诱导。3030/37/37？大肠杆菌基因工程(1)41l噬菌体启动子PL/PR受CI阻遏蛋白阻遏cI857阻遏发酵罐中大规模升温困难发酵罐中大规模升温困难如何解决？如何解决？常使常使PtrpPtrp控制的控制的CICI用一个双质粒控制系统，用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的用色氨酸间接控制目的基因表达（不是加基因表达（不是加3-3-吲吲哚丙烯酸，哚丙烯酸，IAAIAA）。PPtrptrpAABBcIcI857857PPLL目的基因目的基因阻遏作用阻遏作用PPtrptrpAABBPPLL表达表达色氨酸色氨酸大肠杆菌基因工程(1)42发酵罐中大规模升温困难常使Ptrp控制的CIPtrpABcIT7T7T7T7启动子启动子启动子启动子来自来自来自来自T7T7噬菌体的噬菌体的噬菌体的噬菌体的异源启动子异源启动子异源启动子异源启动子大肠杆菌基因工程(1)43T7启动子大肠杆菌基因工程(1)43T7T7T7T7启动子启动子启动子启动子最成功的启动子最成功的启动子最成功的启动子最成功的启动子 *只有只有T7 RNA T7 RNA 聚合酶才能识别聚合酶才能识别 T7 T7 启动子启动子*T7 RNA T7 RNA 聚合酶合成聚合酶合成 mRNA mRNA 的速度比大肠杆菌的速度比大肠杆菌RNA RNA 聚合聚合 酶的快酶的快 5 5 倍倍 *由于大肠杆菌本身不含由于大肠杆菌本身不含 T7 RNA T7 RNA 聚合酶聚合酶 ，需要将外源的，需要将外源的 T7 RNA T7 RNA 聚聚 合酶引入宿主菌。合酶引入宿主菌。*通过调控通过调控T7 RNA T7 RNA 聚合酶聚合酶 的表达间接调控外源基因的表达的表达间接调控外源基因的表达*以以 Novagen Novagen 公司的公司的 pET pET 系统为杰出代表。系统为杰出代表。大肠杆菌基因工程(1)44T7启动子最成功的启动子*只有T7T7T7T7T7启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式 1.1.IPTGIPTG诱导诱导T7RNAT7RNA聚合酶表达聚合酶表达 噬菌体噬菌体 DE3 DE3（lambda lambda 噬菌体的衍生噬菌体的衍生株）含有株）含有 lacI lacI 抑制基因和位于抑制基因和位于 lacUV5 lacUV5 启动启动子下的子下的 T7 RNA T7 RNA 聚合酶基因。聚合酶基因。DE3 DE3 溶源化的菌溶源化的菌株如株如 BL21(DE3)BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和调控方式和 lac lac 一样都是一样都是 IPTG IPTG 诱导。诱导。大肠杆菌基因工程(1)45T7启动子调控模式IPTG诱导T7RNAT7T7T7T7启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式 2.2.热诱导热诱导T7RNAT7RNA聚合酶聚合酶 用不含用不含 T7 RNA T7 RNA 聚合酶的宿主菌克隆目聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用的基因，用 CE6 CE6 噬菌体侵染宿主细胞噬菌体侵染宿主细胞 CE6 CE6 是是 lambda lambda 噬菌体含温度敏感突变噬菌体含温度敏感突变 (cI857ts)(cI857ts)和和 pL/pR pL/pR 启动子控制启动子控制 T7 RNA T7 RNA 聚合聚合酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活 T7 RNA T7 RNA 聚合酶的合成。聚合酶的合成。大肠杆菌基因工程(1)46T7启动子调控模式2.热诱导T7RNA聚T7T7T7T7启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式 3.3.溶氧诱导溶氧诱导T7RNAT7RNA聚合酶聚合酶 通过共转化质粒提供通过共转化质粒提供 T7 RNA T7 RNA 聚合酶。用受聚合酶。用受溶氧浓度控制的启动子调控溶氧浓度控制的启动子调控 T7 RNA T7 RNA 聚合酶合成，聚合酶合成，以适合工业化发酵的条件控制。以适合工业化发酵的条件控制。大肠杆菌基因工程(1)47T7启动子调控模式3.溶氧诱导T7RNT7T7T7T7启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式启动子调控模式 4.4.抑制本底表达方法抑制本底表达方法 1 1）培养基外加葡萄糖，有助于控）培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。制本底表达水平。2)2)向宿主细胞引入向宿主细胞引入T7 T7 融菌酶质粒融菌酶质粒（pLysS pLysS），结合并抑制），结合并抑制 T7 RNA T7 RNA 聚合酶的基因。聚合酶的基因。大肠杆菌基因工程(1)48T7启动子调控模式4.抑制本底表达方法2 2、终止子、终止子外源基因本身的转录效率下降；外源基因本身的转录效率下降；干扰质粒的复制及抗性，导致重组质粒干扰质粒的复制及抗性，导致重组质粒 的不稳定性；的不稳定性；产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编 码产物的翻译效率。码产物的翻译效率。转录过头现象：转录过头现象：RNA RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA DNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNAmRNA混合物。混合物。大肠杆菌基因工程(1)492、终止子转录过头现象：大肠杆菌基因工程(1)49防止转录过头策略防止转录过头策略 大肠杆菌大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT11T T22T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T Tf fA、采用强终止子、采用强终止子B、二聚体终止子串联的特殊结构、二聚体终止子串联的特殊结构大肠杆菌基因工程(1)50防止转录过头策略大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT终止子终止子强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌止子是来自大肠杆菌rRNArRNA操纵子上的操纵子上的rrnTrrnT11T T22以及以及T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T Tf f。对对于一些终止作用较弱的终止子，通常于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组组DNADNA中克隆筛选中克隆筛选pCP1pCP1ApAprrorioriTcTcrr筛选筛选ApAprr、TcTcss的转化子的转化子大肠杆菌基因工程(1)51终止子强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的3 3、核糖体结合位点、核糖体结合位点核糖体结合位点（核糖体结合位点（RBSRBS）:mRNAmRNA5 5 端非翻译序列端非翻译序列,包括包括SDSD、起始、起始密码子、密码子、SDSD与起始密码子间的序列、起始密码子下游序列。与起始密码子间的序列、起始密码子下游序列。商品化大肠杆菌表达质粒均含有与启动子来源商品化大肠杆菌表达质粒均含有与启动子来源相同的相同的RBSRBS，序列和间隔是最佳的，序列和间隔是最佳的 大肠杆菌基因工程(1)523、核糖体结合位点核糖体结合位点（RBS）:mRNA5核糖体结合位点核糖体结合位点SDSD序列（序列（Shine-DalgarnoShine-Dalgarno）：位位于于翻翻译译起起始始密密码码子子上上游游的的6-86-8个个核核苷苷酸酸序序列列（55UAAGGAGGUAAGGAGG33），它它通通过过识识别别大大肠肠杆杆菌菌核核糖糖体体小小亚亚基基中中的的1616SSrRNArRNA33端端区区域域33AUUCCUCCAUUCCUCC55并并与与之之专专一一性性结结合合，将将mRNAmRNA定定位位于于核核糖糖体体上上，从从而而启动翻译。启动翻译。大肠杆菌基因工程(1)53核糖体结合位点SD序列（Shine-Dalgarno）：大肠核糖体结合位点核糖体结合位点SDSD序列与起始密码子之间的距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响：SDSD序列与起始密码子之间的精确距离保证了序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNAmRNA在核糖体在核糖体上定位后，翻译起始密码子上定位后，翻译起始密码子AUGAUG正好处于核糖体复合物结构中的正好处于核糖体复合物结构中的P P位，这是翻译启动的前提条件。位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，在很多情况下，SDSD序列位于序列位于AUGAUG之前大约七个碱基处，在此之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低度的降低大肠杆菌基因工程(1)54核糖体结合位点SD序列与起始密码子之间的距离的影响：核糖体结合位点核糖体结合位点SDSD序列与起始密码子之间的序列的影响序列与起始密码子之间的序列的影响：SDSD序列下游的碱基若为序列下游的碱基若为AAAAAAAA或或UUUUUUUU，翻译效率最高；而翻译效率最高；而CCCCCCCC或或GGGGGGGG的翻译效率则分别是最高值的的翻译效率则分别是最高值的50%50%和和25%25%。紧邻紧邻AUGAUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌杆菌b b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNAmRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合而言，在这个位置上最佳的碱基组合是是UAUUAU或或CUUCUU，如果用如果用UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG取代之，则酶的表达取代之，则酶的表达水平低水平低2020倍倍大肠杆菌基因工程(1)55核糖体结合位点SD序列与起始密码子之间的序列的影响：核糖体结合位点核糖体结合位点翻译起始密码子及其下游序列翻译起始密码子及其下游序列 大大肠肠杆杆菌菌绝绝大大部部分分基基因因以以AUGAUG作作为为阅阅读读框框架架的的起起始始位位点点，但但有有些些基因也使用基因也使用GUGGUG或或UUGUUG作为翻译起始密码子。作为翻译起始密码子。起始效率差异：起始效率差异：GUGGUG为为AUGAUG的的50%50%而而UUGUUG只及只及AUGAUG的的25%25%。从从AUGAUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与能与mRNAmRNA的的55端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNAmRNA在核糖体上的准确定位。在核糖体上的准确定位。大肠杆菌基因工程(1)56核糖体结合位点翻译起始密码子及其下游序列起始效率差异：4 4、质粒拷贝数、质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的目前实验室里广泛使用的克隆用克隆用质粒在每个大肠杆菌细胞中可达质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 策略：较低拷贝质粒（几个至数十个）策略：较低拷贝质粒（几个至数十个）调控重组质粒的扩增调控重组质粒的扩增大肠杆菌基因工程(1)574、质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验质粒拷贝数质粒拷贝数质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制pCP3pCP3拥有一个拥有一个温度可诱导型的复制子温度可诱导型的复制子pCP3pCP3PPLLMCSMCSOriOri28 28 4242ApAprr在在2828时，每个细胞的质粒拷贝数为时，每个细胞的质粒拷贝数为6060在在4242时，拷贝数迅速增至时，拷贝数迅速增至300-600300-600在此温度下，受体细胞染色体上的在此温度下，受体细胞染色体上的CICI基基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一种手段同时控制质粒拷因此，用一种手段同时控制质粒拷贝数和基因的表达贝数和基因的表达大肠杆菌基因工程(1)58质粒拷贝数质粒扩增时序的控制pCP3拥有一个温度可诱导型的复5 5、密码子、密码子宿主对密码子的偏爱性宿主对密码子的偏爱性 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。外源基因全合成外源基因全合成同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因编码基因满足宿主对密码子偏爱性的策略满足宿主对密码子偏爱性的策略大肠杆菌基因工程(1)595、密码子宿主对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生密码子密码子 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子。不适宜的相应简并密码子。外源基因全合成（最常用）外源基因全合成（最常用）大肠杆菌基因工程(1)60密码子按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换密码子密码子 选择相关选择相关tRNAtRNA编码基因同步克隆表达。例如，在编码基因同步克隆表达。例如，在人尿激酶原人尿激酶原cDNAcDNA的的412412个密码子中，共含有个密码子中，共含有2222个精氨酸密码子个精氨酸密码子，其中，其中7 7个个AGGAGG、2 2个个AGAAGA，而大肠杆菌受体细胞中而大肠杆菌受体细胞中tRNAtRNAAGGAGG和和tRNAtRNAAGAAGA的丰度较低的丰度较低。为了。为了提高人尿激酶原提高人尿激酶原cDNAcDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNAtRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因（外源基因较大、且只有少数偏爱时）编码基因（外源基因较大、且只有少数偏爱时）大肠杆菌基因工程(1)61密码子选择相关tRNA编码基因同步克隆表达。例如，在人思考题（思考题（思考题（思考题（1.1.1.1.大肠杆菌表达系统高效表达原理）大肠杆菌表达系统高效表达原理）大肠杆菌表达系统高效表达原理）大肠杆菌表达系统高效表达原理）1、大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？2、启动子为何需要具有可控性？3、IPTG诱导Plac启动子的分子机制是什么？4、PlacUV5启动子与Plac启动子的区别是什么？5、cI857与cI的区别是什么？6、T7启动子使用时为什么要选用大肠杆菌DE3株？7、什么是RBS和SD序列？8、什么是密码子的偏爱性？其影响因素有那些？9、怎样纠正大肠杆菌对外源基因密码子的偏爱性？大肠杆菌基因工程(1)62思考题（1.大肠杆菌表达系统高效表达原理）1、大肠杆菌作为基