感染性疾病的分子诊断 课件

第八、九章第八、九章感染性疾病的分子感染性疾病的分子诊断断.第八、九章感染性疾病的分子诊断.1感染的慨念感染的慨念 感染是病原体和人体之感染是病原体和人体之间的相互作用的相互作用过程程病原微生物：致病菌（条件致病菌）病原微生物：致病菌（条件致病菌）微生物人体微生物人体不不同同的的感感染染状状态共共生生状状态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生.感染的慨念 感染是病原体和人体之间的相互作用过程微人微人不共2感染性疾病感染性疾病：由某种病原体所致，：由某种病原体所致，通通过不同方式引起人体不同方式引起人体发生感染并生感染并出出现临床症状的疾病。床症状的疾病。病原体病原体：病毒、：病毒、细菌、原虫、支原菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫寄生虫。.感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并3常常规检测方法：方法：免疫学方法免疫学方法 微生物学方法微生物学方法 受敏感性、特异性限制，不易早期受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，断，并且不易提供病原体分型及耐并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信性方面的信息。息。.常规检测方法：.4感染性疾病的分子感染性疾病的分子诊断策略断策略一般性策略（一般性策略（检出病原体）：出病原体）：判断有无感染判断有无感染是何种病原体感染是何种病原体感染常用方法：常用方法：PCR 杂交交完整性策略：完整性策略：检出出病原体病原体分型（分分型（分类）亚型耐型耐药性性常用方法：常用方法：杂交、交、PCR、基因芯片、基因芯片、DNA测序序.感染性疾病的分子诊断策略一般性策略（检出病原体）：.5感染性疾病分子感染性疾病分子诊断断标志物志物病原体核酸分子（病原体核酸分子（DNA/RNA）基因表达基因表达产物物代代谢物物免疫免疫应答分子答分子细胞胞免免疫疫体体液液免免疫疫TT致敏致敏T细胞胞淋巴因子淋巴因子B浆细胞胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出感染早期出现临近恢复期出近恢复期出现与原虫和蠕虫感染有关与原虫和蠕虫感染有关.感染性疾病分子诊断标志物病原体核酸分子（DNA/RNA）细体6二、感染性疾病分子诊断的常用方法 根据目的基因是否被放大，可分为杂交法和扩增法。信号放大技术检测方法 靶分子数目不变，而检测的探针信号放大 采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大。靶分子扩增技术检测方法 靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增PCR、替代扩增、LCR等.二、感染性疾病分子诊断的常用方法 根据目的基因是否被放大7引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 355535353cDNA cDNA模板 553353引物B RNAseH RT T7RNA聚合酶 100-1000 RNA扩增子 53533535引物A 355RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 图图8-3 NASBA8-3 NASBA8-3 NASBA8-3 NASBA原理示意原理示意原理示意原理示意图图 引物引物引物引物A A A A 5端带有T7RNA聚合酶结合位点，3端碱基与靶RNA 3端序列互补;引引引引物物物物B B B B的碱基序列与cDNA 3端序列互补.引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 3558nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA).nucleic acid sequence-based am9NASBA的特点的特点为操作操作简便，不需特殊便，不需特殊仪器，器，不需温度循不需温度循环。整个反。整个反应过程由三种程由三种 酶控制，控制，循循环次数少，忠次数少，忠实性高性高,其其扩增效率高于增效率高于PCR，特异性好。，特异性好。.NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个10引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 355535353cDNA cDNA模板 553353引物B RNAseH RT T7RNA聚合酶 100-1000 RNA扩增子 53533535引物A 355RNAseH RNA RNA cDNA cDNA 图图8-3 NASBA8-3 NASBA8-3 NASBA8-3 NASBA原理示意原理示意原理示意原理示意图图 引物引物引物引物A A A A 5端带有T7RNA聚合酶结合位点，3端碱基与靶RNA 3端序列互补;引引引引物物物物B B B B的碱基序列与cDNA 3端序列互补.引物A 靶RNA 引物B RNAcDNA RT 35511nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA).nucleic acid sequence-based am12NASBA的特点的特点为操作操作简便，不需特殊便，不需特殊仪器，器，不需温度循不需温度循环。整个反。整个反应过程由三种程由三种 酶控制，控制，循循环次数少，忠次数少，忠实性高性高,其其扩增效率高于增效率高于PCR，特异性好。，特异性好。.NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个13三、感染性疾病分子诊断的标本处理标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。.三、感染性疾病分子诊断的标本处理标本采集处理主要包括选择合适14四、感染性疾病分子诊断的结果解释1.阴性结果 假阴性可能性 方法的灵敏度太低 方法失败 目标分子2.阳性结果 假阳性可能性 方法的特异性 受到污染.四、感染性疾病分子诊断的结果解释1.阴性结果 假阴性可能性153.定性检测结果 有时不能提供病原体活力相关信息 临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。4.疾病状况的判断 检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。该病原体可能是一种正常菌群 .3.定性检测结果 有时不能提供病原体活力相关信息.16五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。耐药性的检测细菌的分型流行病调查.五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价用于感染性疾病治疗的监17第一第一节 病毒的基因病毒的基因检测人人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、炎、脑炎、流行性感冒等等，占人炎、流行性感冒等等，占人类传染疾染疾病的病的75%75%左右。左右。400400多种不同病毒。多种不同病毒。病毒病毒结构：大构：大 小：小：20-300nm 20-300nm 核心区：核酸（核心区：核酸（DNADNA或或RNARNA）外周衣壳：蛋白外周衣壳：蛋白质 包膜：脂包膜：脂质（镶嵌有蛋白嵌有蛋白质）.第一节 病毒的基因检测人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝18 我我国国是是HBVHBV高高流流行行区区，50%50%70%70%的的人人受受过感感染染，8%8%10%10%是是HBVHBV携携带者者，肝肝炎炎患患者者中中60%60%是是慢慢性性肝肝炎炎患患者者，导致致肝肝硬硬变，HBVHBV又又与原与原发性肝癌密切相关。性肝癌密切相关。外壳（外壳（HBsAg):HBsAg):外壳蛋白成分外壳蛋白成分为表面抗原表面抗原 核心（核心（HBcAg)HBcAg)：DNA DNA DNA DNA 聚合聚合酶 HBcAgHBcAg一、一、乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒.我国是HBV高流行区，50%70%的人受过感染，819Dane颗粒（完整的病毒）形粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBV DNADNAPol（外膜蛋白）（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）（核衣壳蛋白）完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米，内含DNA双链和DNA多聚酶.Dane颗粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBV D20（一）病毒基因（一）病毒基因组结构构3.2kb3.2kb双双链DNADNA病毒病毒 不完全双不完全双连环状状DNADNA 长链L L为负链：有：有4 4个开放个开放阅读框框S S、C C、P P、X X S S区区编码外膜蛋白（外膜蛋白（HBsAgHBsAg）C C区区编码HBeAg HBeAg、HBcAg HBcAg p p区区编码DNADNA聚合聚合酶 X X区位区位编码X X蛋白，可能与病毒蛋白表蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。达有关。短短链S S为正正链：长短不一短不一.（一）病毒基因组结构3.2kb双链DNA病毒.21pre-s1 pre-s2S P P C C pre-c XHBV DNA 3.2 kbpre-S1 pre-S1蛋白蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAgHBVHBV基因基因组结构构.pre-s1 pre-s2S P C pre-c XHBV 22HBV 基因分型基因分型HBV基因序列差异的多少，可将基因序列差异的多少，可将HBV划分划分为不同的基因不同的基因型，至今型，至今为止已止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共共8种基种基因型：因型：A型主要存在于白人，型主要存在于白人，B型和型和C型主要存在于型主要存在于亚洲人群洲人群E型主要存在于西非型主要存在于西非F型型仅见于中南美洲的土著人于中南美洲的土著人G型和型和H型很少型很少见不同基因型序列不同基因型序列长度不同，主要是前度不同，主要是前S1区的不同。我国流区的不同。我国流行的主要是行的主要是B和和C基因型，基因型，长江以北以江以北以C型型为主，主，长江以南江以南以以B型型为主，另又少量的主，另又少量的A型、型、D型和混合型。西北和西南型和混合型。西北和西南尤其是西北有尤其是西北有较高比例的高比例的D型型.HBV 基因分型HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不23HBV在肝在肝细胞内的复制胞内的复制A(n)mRNAcccDNAHBsAg 包膜包膜负链链DNA包包裹裹后后的的前前基基因因 mRNA传染性染性HBV病毒病毒颗粒粒传染性染性HBV病毒病毒颗粒粒部分双部分双链DNA逆逆转录酶DNA聚合聚合酶肝肝 细 胞胞.HBV在肝细胞内的复制A(n)mRNAcccDNAHBsAg24（二）分子（二）分子诊断断常用的免疫学常用的免疫学检测方法，即二方法，即二对半的半的检测存存在窗口期，不易早期在窗口期，不易早期诊断。断。1.PCR 1.PCR 采用普通采用普通PCRPCR、FQ-PCRFQ-PCR、竞争性争性PCRPCR、免疫、免疫杂交交PCRPCR，可提供直接、准确的病原学，可提供直接、准确的病原学诊断断证据。引物是根据据。引物是根据S S、C C、P P、X X基因中高度保守基因中高度保守序列序列设计，决定，决定扩增的特异性和敏感度。增的特异性和敏感度。.（二）分子诊断常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在窗口期25扩增位置增位置 引物序列引物序列 扩增片断（增片断（bp)bp)P P、X X基因基因 5 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 278 5 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C C基因基因 5 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 477 5 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C C基因基因 5 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 258 5 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3 .扩增位置 引物序列 扩增片断（bp26 有有时为了了证实扩增增产物的特异性，物的特异性，对扩增增产物物进行以下分析：行以下分析：RLFP 斑点斑点杂交交 Southern杂交交 .有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产物进行以下分析：272.2.支支链DNADNA信号放大技信号放大技术(bDNA(bDNA）原理原理:捕捕获探探针 检测 靶探靶探针1 1 体系体系 靶探靶探针2 2 bDNA bDNA分子分子:DNA:DNA主主链上上结 合多个合多个侧链 .2.支链DNA信号放大技术(bDNA）原理:.28捕捕获探探针固化在微孔板上固化在微孔板上 靶探靶探针1 1分分别与捕与捕获探探针及待及待测核酸核酸杂交交 靶探靶探针2 2分分别与待与待测核酸及核酸及bDNAbDNA杂交交 形成复合物：形成复合物：固相支固相支持物持物捕捕获探探针靶探靶探针1CEs待待测核酸核酸靶探靶探针2LEsbDNA复合物复合物.捕获探针固化在微孔板上 固相支持物捕获探针靶探针1待测核酸靶29分支链DNA信号放大技术(bDNA).分支链DNA信号放大技术(bDNA).30信号信号检测：bDNA可可结合很多合很多酶标探探针，酶催化底物（催化底物（1,2-二二恶二二酮，dioxetane）发光，使核酸信号放大，且光，使核酸信号放大，且发光光强度与度与DNA量成正比。量成正比。优点：放大倍数确定点：放大倍数确定 阳性阳性检出率高出率高 稳定性和可重复性好定性和可重复性好 操作操作简便，省便，省时，易于普及，易于普及.信号检测：bDNA可结合很多酶标探针，酶催化底物（1,2-二313.基因芯片技基因芯片技术 标本本经PCR扩增后与芯片上的特异探增后与芯片上的特异探针进行行杂交，可以交，可以检测：是否有病毒感染是否有病毒感染 感染病毒的种感染病毒的种类及及亚型型 病毒的耐病毒的耐药情况情况 特点：可同特点：可同时进行大量行大量标本的本的检测.3.基因芯片技术.32近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区。干扰素治疗对HBV的压力主要集中在前C/C区及前S区。HBV耐耐药突突变lamivudineadefovirentecavirtelbivudine.近年来陆续上市的核苷(酸)类似物对HBV的治疗压力集中在P区33YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)HBV对拉米夫定耐药是HBV DNA聚合酶突变所致。耐药基因位点(YMDD)位于聚合酶的C区(rtM2041或rtM204V)，分别是YMDD中的蛋氨酸(M)被异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD变异.拉米夫定作用靶位为HBV DNA聚合酶C区。有研究表明，拉米夫定与HBV逆转录酶的亲和力与位于第552位氨基酸侧链长度有关，异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸，使侧链氨基酸长度缩短，使逆转录酶dNTP结合区增大，不适于拉米夫定结合，从而诱发耐药性。.YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)HBV对34HBV耐耐药检测（YMDD突突变检测方法）方法）.HBV耐药检测（YMDD突变检测方法）.35YMDD突突变检测方法方法1.基因基因测序法序法2.荧光定量光定量PCR方法方法基本原理基本原理确定探确定探针特定的特定的TM值来区分是否突来区分是否突变常用方法常用方法覆盖突覆盖突变位点位点荧光双探光双探针杂交交YIDD YMDD YVDD46.91 54.64 50.74.YMDD突变检测方法1.基因测序法 YIDD36（三）（三）临床意床意义1.1.早期早期诊断断 免疫学免疫学检测敏感性：敏感性：0.10.1g/ml g/ml 核酸核酸杂交交检测敏感性：敏感性：0.1pg/ml 0.1pg/ml PCR PCR检测：0.1fg/ml 0.1fg/ml 因此，在感染早期即可通因此，在感染早期即可通过DNADNA检测证实病病毒的存在。毒的存在。.（三）临床意义1.早期诊断.372.监测治治疗效果效果:HBVDNA107拷拷贝/ml提示病毒复制活提示病毒复制活跃；HBVDNA104拷拷贝/ml治治疗有一定有一定疗效；效；HBVDNA103拷拷贝/ml、HBeAg阴阴转、转氨氨酶正常正常为乙型肝炎乙型肝炎临床治愈指床治愈指标；3.判断病情，指判断病情，指导制定合理的治制定合理的治疗方案方案.2.监测治疗效果:.384.病毒耐病毒耐药性的性的检测 乙肝病毒乙肝病毒DNA聚合聚合酶YMDD处的突的突变是是病毒病毒产生耐生耐药性的重要原因，通性的重要原因，通过监测YMDD的突的突变情况，可以情况，可以获得病毒耐得病毒耐药性方性方面的信息，指面的信息，指导抗病毒治抗病毒治疗。.39二、流行性感冒病毒二、流行性感冒病毒 流行性感冒病毒流行性感冒病毒(Influenza virus)，是引起流行性，是引起流行性感冒的病原体感冒的病原体;分分为甲甲(A)、乙、乙(B)和丙和丙(C)3个个型型别;根据病毒根据病毒颗粒表面粒表面血凝素血凝素血凝素血凝素(Haemagglutinin，HA)和和神神神神经经氨酸氨酸氨酸氨酸酶酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲的抗原性，甲型流感病毒又可分型流感病毒又可分为不同的不同的亚型型。甲型流感病毒易甲型流感病毒易发生生变异，致病力异，致病力强，1918年年发生生在西方国家的大流感在西方国家的大流感杀死了几千万人，死了几千万人，即是由甲型即是由甲型流感病毒引起。流感病毒引起。Thereare16differentHantigens(H1toH16)andninedifferentNantigens(N1toN9).二、流行性感冒病毒 There are 16 differ40.41（一）流感病毒基因（一）流感病毒基因组结构构 单链RNA病毒，病毒，RNA为负链；有有8个个RNA片段或片段或7个个RNA片段；片段；所有所有RNA片段片段5末端和末端和3末端高度保守；末端高度保守；两种不同两种不同亚型病毒感染宿主型病毒感染宿主时，会生成基因，会生成基因重配的新病毒；重配的新病毒；RNA基因在复制基因在复制过程中程中 常会常会发生点突生点突变。.（一）流感病毒基因组结构.42（二）分子（二）分子诊断方法断方法 可采用可采用RT-PCR、FQ-PCR检测流感病毒流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非。引物常按流感病毒保守的非结构基因构基因（NS）的序列）的序列进行行设计。为证实PCR扩增增产物的特异性或提高物的特异性或提高检测的的灵敏度，可用限制性内切灵敏度，可用限制性内切酶分析法、斑点分析法、斑点杂交法、交法、Southern印迹法印迹法进行行扩增增产物的分析。物的分析。.（二）分子诊断方法.43扩增位置增位置 引物序列引物序列 扩增片段大小增片段大小 NS基因基因 5-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3 190(bp)5-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3 NS基因基因 5-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3 241(bp)5-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3.扩增位置 引物序列 44（三）（三）临床意床意义 流感病毒的流感病毒的诊断断过去主要靠去主要靠鸡胚羊膜腔培胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制养和血清学血凝抑制试验，这些方法比些方法比较费时，灵敏度低，灵敏度低，难以作出早期以作出早期诊断。断。PCR法敏感、特异、法敏感、特异、简便、快速，并且便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病学可用于流感病毒的分型和流行病学调查。.（三）临床意义.45三三.人人类免疫缺陷病毒（免疫缺陷病毒（HIV)HIV)HIV，human immunodeficiency virusAIDS，acquired immunodeficiency syndromeHIVHIV为艾滋病的病原体。艾滋病的病原体。现已已发现引起艾滋病引起艾滋病的病毒有的病毒有HIV-1HIV-1、HIV-2HIV-2、HIV-3HIV-3三种。三种。19981998年底艾滋病感染者和艾滋病患者年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数数为3.3403.340万，已死亡万，已死亡1.3901.390万，是全球十大主要死万，是全球十大主要死因之一。因之一。.三.人类免疫缺陷病毒（HIV)HIV，human immu46最外最外层为囊膜，双囊膜，双层脂蛋白，是病毒脂蛋白，是病毒识别攻攻击宿主宿主细胞所必不可少的；其内胞所必不可少的；其内为核衣壳。核衣壳。.最外层为囊膜，双层脂蛋白，是病毒识别攻击宿主细胞所必不可少的47.482.基因基因组结构构 逆逆转录病毒，两个拷病毒，两个拷贝的的单股正股正链RNA；每个每个RNA长约9.7Kb，有，有5帽，帽，3端有多聚端有多聚尾；尾；HIV是一种高度是一种高度变异的病毒；异的病毒；含有含有gag、env 和和 pol三个基因以及三个基因以及6种种调控控基因基因 tat,vif,vpr,vpx,nef,rev。.2.基因组结构.49gag基因基因编码病毒的核心蛋白；病毒的核心蛋白；pol基因基因编码病毒复制所需要的病毒复制所需要的酶类（逆（逆转录酶、整合、整合酶和蛋白和蛋白酶）；）；env基因所基因所编码病毒包膜蛋白，是病毒包膜蛋白，是HIV免疫免疫学学诊断的主要断的主要检测抗原。抗原。调控基因控基因编码辅助蛋白，助蛋白，调节病毒蛋白合成病毒蛋白合成和复制。和复制。.gag基因编码病毒的核心蛋白；.50（二）分子（二）分子诊断方法断方法抗体的抗体的检测：酶联免疫吸附法（免疫吸附法（ELISAELISA）和免）和免疫疫荧光光检测法（法（IFAIFA）；感染）；感染2 2周后才能逐周后才能逐渐产生病毒抗体；生病毒抗体；抗原的抗原的检测：酶联免疫吸附法（免疫吸附法（ELISAELISA）检测P24P24抗原，灵敏度低抗原，灵敏度低.（二）分子诊断方法抗体的检测：酶联免疫吸附法（ELISA）和511.病毒病毒载量量检测 感染者体内感染者体内HIV的定量的定量检测，对病情判断和病情判断和治治疗效果效果检测极有价极有价值。目前常用三种技目前常用三种技术：RT-PCR 最低最低检测限限50拷拷贝/ml bDNA 最低价最低价测限限50拷拷贝/ml NASBA 最低最低检测限限20拷拷贝/ml.1.病毒载量检测.52PCR RNA逆逆转录cDNA整合到宿主基因整合到宿主基因组中复中复制，以被感染制，以被感染细胞胞DNA为模板模板PCR扩增；增；HIV为高高变异病毒，不同患者体内分离的异病毒，不同患者体内分离的病毒基因病毒基因结构有差异，引物构有差异，引物设计应根据各根据各编码区的保守序列区的保守序列设计；灵敏度高，特灵敏度高，特别是用于无症状是用于无症状HIV感染者。感染者。.PCR.53扩增位置增位置 引物序列引物序列 扩增片断（增片断（bp)bp)gaggag基因基因 5 5-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3 342 342 5 5-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3 gapgap基因基因5 5-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3 115 115 5 5-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3 polpol基因基因5 5-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3 360 360 5 5-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3 .扩增位置 引物序列 扩增片542.病毒表型和耐药检测HIV表型主要依据逆转录酶和蛋白酶基因突变的检测最常用的耐药检测方法是基因型检测方法,即查找与病毒耐药有关的基因突变。检测病毒逆转录酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把这些结果与已知的没有发生突变的HIV（称为野生株）基因序列进行比较，与之不同的基因序列就认为发生了突变。检测出的任何突变都有可能导致形成HIV耐药性，但具体结果的解释必须要有非常有经验的专家和医师来进行。.2.病毒表型和耐药检测HIV表型主要依据逆转录酶和蛋白酶基因55（三）（三）临床意床意义1.1.原位原位杂交：可以交：可以显示病毒感染的部位；示病毒感染的部位；2.PCR2.PCR：可：可对无症状的感染者无症状的感染者进行早期行早期诊断；断；3.3.病毒病毒载量量检测：在：在临床床进展情况的判定及展情况的判定及疗效效观察上极有价察上极有价值。.（三）临床意义1.原位杂交：可以显示病毒感染的部位；.56第九章：第九章：细菌感染的分子生物学菌感染的分子生物学检验概述概述 正常菌群：存在于人体表及与外界相通部正常菌群：存在于人体表及与外界相通部位的位的细菌；菌；条件致病菌：正常菌群与人体平衡破坏，条件致病菌：正常菌群与人体平衡破坏，引起疾病的一引起疾病的一类细菌；菌；病原菌：具有毒性和侵病原菌：具有毒性和侵袭力的力的细菌，造成菌，造成人体感染；人体感染；.第九章：细菌感染的分子生物学检验概述.57病原菌的病原菌的诊断方法：断方法：直接涂片法直接涂片法 生化生化试验 血清学血清学试验 分离培养分离培养 动物物实验 分子生物学：灵敏、特异，可分子生物学：灵敏、特异，可进行早行早期期诊断、分型、耐断、分型、耐药性性检测；不能确不能确诊或或进行行分型、耐分型、耐药性的性的检测，或，或费时等等.病原菌的诊断方法：不能确诊或进行分型、耐药性的检测，或费时58 全世界全世界1/51/5人口感染，每年人口感染，每年约300300万死于万死于结核，中国占核，中国占70%70%，免疫低下个体特，免疫低下个体特别是是HIVHIV感感染者更易于感染染者更易于感染结核分枝杆菌。核分枝杆菌。结核分枝杆菌核分枝杆菌为革革兰氏阳性菌，氏阳性菌，细长略略带弯曲，弯曲，分枝状，分枝状，有有荚膜，抗酸染色阳性，膜，抗酸染色阳性，对多种抗生素有抵抗力。多种抗生素有抵抗力。一一.结核分枝杆菌核分枝杆菌.全世界1/5人口感染，每年约300万死于结核，中国59形形 态 .形 态.60(一一)基因基因组结构构 1.TB H37Rv株基因株基因组是是环状双状双链DNA，共共有有4 411 529bp;2.共有共有4033基因，功能已知的有基因，功能已知的有1734个个,1694个可能个可能为新基因新基因;3.基因基因组中有中有许多多药物抗性因子的物抗性因子的编码序列，序列，包括水解包括水解酶或者或者药物修物修饰酶。.(一)基因组结构.61.62.63（二）分子（二）分子诊断方法断方法 普通普通PCR、FQ-PCR、竞争性争性PCR、免疫、免疫杂交交PCR 扩增靶序列：增靶序列：65KDa抗原基因（抗原基因（细菌菌细胞壁上蛋白）胞壁上蛋白）MPB蛋白基因（蛋白基因（结核杆菌复合群特有）核杆菌复合群特有）rRNA基因基因（种属（种属鉴定）定）ISDNA6110插入序列插入序列.（二）分子诊断方法.64靶序列靶序列 引物序列引物序列 扩增片断（增片断（bpbp）IS6110IS6110插入插入 5 5-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3 317 317 5 5-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3 16SrRNA 516SrRNA 5-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3 463 463 5 5-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3 DNADNA重复序列重复序列 5 5-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3 245 245 5 5-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3 .靶序列 引物序列 扩增片断（bp）65TB耐药检测利福平耐药-RNA聚合酶rpoB基因异烟肼耐药-katG基因链霉素耐药-S12的rpsL基因 16SrRNA的rrs基因 喹诺酮的耐药-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或药物修饰酶（-内酰胺酶、氨基糖苷乙酰基转移酶和药物外排系统等）.TB耐药检测利福平耐药-RNA聚合酶rpoB基因.66细菌耐菌耐药基因的基因的检测 细菌耐菌耐药性的性的产生生导致治致治疗失失败、感染复、感染复发、增加昂增加昂贵抗生素的使用。抗生素的使用。机理：由于机理：由于细菌基因菌基因组的的变异，异，导致致 1.1.细菌菌细胞外膜通透性改胞外膜通透性改变；2.2.产生生灭活活酶和和钝化化酶，如，如-内内酰胺胺酶；3.3.药物作用靶位改物作用靶位改变；4.4.代代谢途径改途径改变；.细菌耐药基因的检测 细菌耐药性的产生导致治疗失败、感染复发67（三）（三）临床意床意义1.1.准确、快速、早期准确、快速、早期诊断断TB TB 2.2.区分区分TBTB与其它分枝杆菌与其它分枝杆菌 3.3.疫情疫情监控和抗控和抗痨治治疗疗效的效的评价价 .（三）临床意义1.准确、快速、早期诊断TB.68二、二、淋球菌淋球菌 淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我国性的唯一自然宿主。淋病在我国性传播疾病种播疾病种中，中，发病率居首位。淋球菌耐病率居首位。淋球菌耐药菌株的出菌株的出现和流行和流行对淋病的控制淋病的控制带来很大困来很大困难。传播途径：播途径：1.1.直接性接触感染直接性接触感染 2.2.间接接触感染接接触感染.二、淋球菌 淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌69.70（一）基因（一）基因组结构构 1.染色体分子量染色体分子量980M，可，可编码约5000个个基因，基因，GC含量含量为50%；2.无操无操纵子子结构构 3.含有含有1至数个至数个质粒粒（2.6MDa，24.5MDa），通），通过质粒介粒介导耐耐药性在不同菌株性在不同菌株间的的转移；移；.（一）基因组结构.71.72（二）分子（二）分子诊断断1.PCR:1.PCR:扩增的靶序列：增的靶序列：编码外膜蛋白外膜蛋白的的结构基构基因，或因，或16SrRNA16SrRNA基因、基因、CPPBCPPB基因（同基因（同时存在于存在于染色体及染色体及质粒上）粒上）.（二）分子诊断1.PCR:.73靶序列靶序列 引物序列引物序列 扩增片断（增片断（bpbp）CPPBCPPB基因基因 5 5-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3 633 633 5 5-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3 外膜蛋白外膜蛋白55-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3 494 494 5 5-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3 5 5-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3 181181.靶序列 引物序列 扩增片断（bp）742.LCR（Ligase chain reaction）连接接酶链反反应(Ligase chain reaction，LCR)，是一种新的，是一种新的DNA体外体外扩增和增和检测技技术，主要用于点突主要用于点突变的研究及靶基因的的研究及靶基因的扩增增.2.LCR（Ligase chain reaction75原理：在原理：在PCR反反应体系中加入二体系中加入二对引物，加引物，加热(9495)使使DNA变性，双性，双链打开，然打开，然后降温退火后降温退火(65)，引物与模板，引物与模板DNA结合并合并留下一缺口，如果引物与模板完全互留下一缺口，如果引物与模板完全互补，DNA连接接酶即即连接封接封闭缺口，缺口，PCR反反应接着接着进行，行，扩增出大量的目增出大量的目标DNA.若有点突若有点突变，引物不能与模板精确引物不能与模板精确结合，缺口附近核苷酸合，缺口附近核苷酸的空的空间结构构发生生变化，化，连接接酶不能封不能封闭缺口，缺口，PCR反反应不能不能进行，无行，无扩增增产物生成，据此物生成，据此可判断模板可判断模板DNA中有无突中有无突变.原理：在PCR反应体系中加入二对引物，加热(9495)76.77（三）（三）临床意床意义 1.分子分子诊断技断技术具有灵敏性高、快速、特异性具有灵敏性高、快速、特异性好的好的优点，可点，可检测极微量的淋球菌。极微量的淋球菌。2.应用于以下几方面：用于以下几方面：对菌株菌株进行分型和耐行分型和耐药性分析。性分析。抗生素治抗生素治疗效果的效果的观察。察。进行流行病学分析。行流行病学分析。对疑似病例的疑似病例的诊断和断和鉴别诊断。断。.（三）临床意义.78衣原体的基因衣原体的基因检测 衣原体是介于立克次氏体与病毒之衣原体是介于立克次氏体与病毒之间，能通能通过细菌菌滤器，器，专性活性活细胞内寄生的一胞内寄生的一类原核生物。原核生物。沙眼衣原体是一种在人体内沙眼衣原体是一种在人体内长期生存并期生存并又广泛又广泛传播的病原体，常播的病原体，常导致人泌尿生殖道致人泌尿生殖道疾病及眼病，有疾病及眼病，有15种血清型。种血清型。.衣原体的基因检测.79一、基因一、基因组 沙眼衣原体（血清型沙眼衣原体（血清型D）基因）基因组大小大小1042Kbp，GC含量含量为41.3%，另有一个，另有一个7493bp的的质粒，整个基因粒，整个基因组有有894个蛋白个蛋白编码基因，其中基因，其中604个个(68%)编码蛋白的功蛋白的功能已明确，能已明确，35个个(4%)编码基因在基因在GenBank收收录的其他的其他细菌中有同源序列，但功能不清，菌中有同源序列，但功能不清，剩下的剩下的255个个(28%)在在GenBank中没有中没有检索索到同源序列。到同源序列。.一、基因组 .80二、分子二、分子诊断断 1.PCR 扩增靶序列主要有外膜蛋白增靶序列主要有外膜蛋白(MOMP)基因、基因、特有特有质粒粒DNA和和rRNA基因序列。基因序列。rRNA基因基因 5-GAAGGCGGATAATACCCGCTG-3 5-GATGGGGTTGAGCCATCC-3 MOMP基因基因 5-GATAGCGAGCACAAAGACTAA-3 5-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3.二、分子诊断.812.LCR LCR的的扩增效率与增效率与PCR相当，其相当，其产物物的的检测也也较方便灵敏方便灵敏 三、三、临床意床意义 沙眼衣原体感染常缺乏特异症状，易形沙眼衣原体感染常缺乏特异症状，易形成成隐匿感染，分子匿感染，分子诊断技断技术敏感性和特异敏感性和特异性高，适用于早期性高，适用于早期诊断和无症状携断和无症状携带者的者的检查；.2.LCR .82支原体的基因支原体的基因检测 肺炎支原体肺炎支原体(mycoplasma pulmonis,MP)(mycoplasma pulmonis,MP)是原是原发性非典型肺炎的病原体。性非典型肺炎的病原体。一、基因一、基因组结构构 肺炎支原体肺炎支原体M129M129株基因株基因组有有816394bp816394bp，G+CG+C含量含量为40%40%，含，含677677个开放个开放阅读框，框，3939个个RNARNA编码基因。基因。.支原体的基因检测 肺炎支原体(mycoplasma p83二、分子二、分子诊断方法断方法 1.PCR 扩增靶序列常增靶序列常选在在16S rRNA基因基因组可可变区与保守区、特异的染色体区与保守区、特异的染色体DNA片段、片段、P1蛋白基因区。蛋白基因区。2.核酸核酸杂交交 特异的特异的寡核苷酸探寡核苷酸探针与与样品品DNA进行斑行斑点点杂交，特异性好，但灵敏度不如交，特异性好，但灵敏度不如PCR法。法。.二、分子诊断方法.84三、三、临床意床意义 因肺炎支原体与其他支原体存在因肺炎支原体与其他支原体存在共同抗原，免疫学方法共同抗原，免疫学方法检测可出可出现假假阳性和假阴性。阳性和假阴性。PCR方法方法简便快速、特异、敏感，便快速、特异、敏感，适于早期快速适于早期快速检测MP。.三、临床意义.85螺旋体的基因螺旋体的基因检测 梅毒螺旋体梅毒螺旋体(syphilis spirochete)是人是人类梅毒的病原体。梅毒的病原体。一、基因一、基因组结构构 基因基因组大小大小约1000kb，为最小的原核最小的原核基因基因组之一，之一，GC含量含量为52.8%，共有，共有1041个开放个开放阅读框，占整个基因框，占整个基因组的的92.9%，每个，每个ORF的平均大小的平均大小为1023bp。.螺旋体的基因检测.86二、分子二、分子诊断方法断方法 1.PCR 扩增的靶序列有增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。等基因。2.核酸核酸杂交交 用同位素或非同位素用同位素或非同位素(如生物素、地高辛如生物素、地高辛)标记的探的探针与待与待测标本的本的DNA或或扩增后的增后的DNA进行斑点行斑点杂交。交。.二、分子诊断方法.87三、三、临床意床意义 血清学血清学试验对早期梅毒早期梅毒诊断不敏感，断不敏感，对先先天性和神天性和神经性梅毒的性梅毒的诊断特异性差。分子断特异性差。分子诊断的方法可早期断的方法可早期诊断梅毒感染的病人，尽早断梅毒感染的病人，尽早根治梅毒。根治梅毒。.三、临床意义.88思考题感染性疾病分子诊断的临床意义 乙型肝炎病毒的基因组结构及分子诊断.思考题感染性疾病分子诊断的临床意义.89