微生物常规鉴定技术课件

第二章第二章 微生物常规鉴定技术微生物常规鉴定技术n 食品微生物检验常用的仪器食品微生物检验常用的仪器n 培养基和实验室基本操作技术培养基和实验室基本操作技术n 生物安全实验室生物安全实验室n 生化实验和血清学实验生化实验和血清学实验第二章 微生物常规鉴定技术 食品微生物检验常用的仪器生化实验和血清学实验生化实验和血清学实验常见的生化反应原理及现象血清学试验原理生化实验和血清学实验常见的生化反应原理及现象一、概述一、概述（一）、什么是生化试验（一）、什么是生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。来鉴别细菌的类别、属种的试验。一、概述（一）、什么是生化试验?（二）（二）检验细菌的生化试验范检验细菌的生化试验范围围1、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验（二）检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验（三）生化试验的方法（三）生化试验的方法1.在培养物中加入某种底物与指示剂在培养物中加入某种底物与指示剂,经接经接种、培养后种、培养后,观察培养基的观察培养基的PH值变化。值变化。2.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。代谢产物所生成的颜色反应。3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。观察细菌的生长情况。（三）生化试验的方法在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、（四）生化试验的注意事项（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养、待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。2、待检菌应是纯种培养物。、待检菌应是纯种培养物。3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为多为24或或48小时。小时。4、应做必要的对照试验、应做必要的对照试验。5、提高阳性检出率，至少挑取、提高阳性检出率，至少挑取23待检的疑待检的疑似菌落分别进行试验。似菌落分别进行试验。（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。培养18二、糖醇类代谢试验二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验（三）V-P试验（四）甲基红（Methyl Red）试验 MR二、糖醇类代谢试验（一）糖醇类发酵试验（一）（一）糖醇类发酵试验糖醇类发酵试验1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解有的只能分解12种糖醇种糖醇，有的分解糖醇能产，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。些特点，可鉴别细菌。（一）糖醇类发酵试验1.原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能常用的糖醇常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖三糖：棉子糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖2、试验方法：、试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置接种针作穿刺接种。置361.0 培养培养13天，每天观察结果。天，每天观察结果。2、试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接3、结果观察和记录、结果观察和记录记录：记录：n产酸不产气，阳性，以产酸不产气，阳性，以“+”表示表示n产酸产气，阳性，以产酸产气，阳性，以“”表示表示n不产酸产气，阴性，以不产酸产气，阴性，以“-”表示表示3、结果观察和记录记录：气泡导导管管气气泡泡气气泡泡阳性阳性阴性培养基变为培养基变为黄色黄色培养基未变色、培养基未变色、无气泡产生无气泡产生气泡导管气泡气泡阳性阳性阴性培养基变为黄色培养基未变色、无气（二）葡萄糖氧化发酵（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验）试验1、原理：、原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验1、原理：2、方法、方法n取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在绝空气，在37培养培养24h天，每天天，每天观察结果。观察结果。2、方法取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上3、结果观察与记录、结果观察与记录3、结果观察与记录（三）（三）V-P试验试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。）反应。（三）V-P试验1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸2、试验方法、试验方法（1）奥梅拉（）奥梅拉（OMeara）法）法（2）贝立脱（）贝立脱（Barritt）氏法）氏法（3）快速法）快速法2、试验方法（1）奥梅拉（OMeara）法 奥梅拉法：奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于水培养基，于361 培养培养48h，每每1ml培培养液加奥梅拉养液加奥梅拉OMeara试剂试剂0.1ml，摇动试管12min，静置于37恒温箱4h，或在4850 水浴放置2h后判定结果。奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄 3、结果观察与记录、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，）发酵管出现红色者，为阳性，记记 V-P +（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记记 V-P -3、结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，记 （四）甲基红试验（四）甲基红试验（MR）1、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基量酸性产物，使培养基PH值下降至值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。（四）甲基红试验（MR）1、原理细菌分解葡萄糖产生丙酮 2、试验方法：、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或或30（以（以30 较好）培养较好）培养35天，从第天，从第48h起，每日取培养液起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结滴，立即观察结果。果。2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物MR-VP试验原理及照片V-PMR-VP试验原理及照片V-P3、结果观察与记录、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记为弱阳性，记 MR +；（2）呈橘黄色或黄色）呈橘黄色或黄色为阴性，记为阴性，记MR -，迄至发现阴性并培养迄至发现阴性并培养至第至第5天仍为阴性，天仍为阴性，即可判定结果即可判定结果MR+MR-3、结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱 复习题1、什么是生化试验、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录和结果的记录5、简述甲基红试验（、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验）的原理，写出其试验方法和结果的记录方法和结果的记录 复习题1、什么是生化试验?（一）靛基质（吲哚）试验（一）靛基质（吲哚）试验（二）（二）H2S试验试验（三）尿素酶试验（三）尿素酶试验（四）氨基酸脱羧酶试验（四）氨基酸脱羧酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验（五）苯丙氨酸脱氨酶试验 (六六)明胶（明胶（Gelatin）液化试验）液化试验三、氨基酸和蛋白质代谢试验三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一）靛基质（吲哚）试验三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一）（一）靛基质试验靛基质试验1、原理、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。（一）靛基质试验1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白 2、试验方法：、试验方法：所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂;或（2）欧波试剂 2、试验方法：所用试剂:将待检菌小量接种于培养基中，于将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养培养2448h时后，加入柯凡克试时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。应。将待检菌小量接种于培养基中，于363、结果观察与记录、结果观察与记录 呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+无红色者，为阴性反应，记-靛基质靛基质+3、结果观察与记录 呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+靛基（二）（二）硫化氢（硫化氢（H2S）试验）试验1、原理：、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或或FeS，以此鉴别细菌。，以此鉴别细菌。（二）硫化氢（H2S）试验1、原理：2、试验方法：、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于养上，于361培养培养2448h，观察结果。，观察结果。2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种3、结果观察与记录、结果观察与记录n培养基底部呈黑色，为阳性，记培养基底部呈黑色，为阳性，记+n培养基底部无黑色，为阴性，记培养基底部无黑色，为阴性，记-3、结果观察与记录培养基底部呈黑色，为阳性，记+（三）（三）尿素酶试验尿素酶试验1、原理：、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。菌。（三）尿素酶试验1、原理：2、试验方法：、试验方法：挑取大量培养挑取大量培养1824h的待试菌，浓密涂布的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养部作变色对照。培养2、4和和24h分别观察一次分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判天，作最终判定。定。2、试验方法：挑取大量培养1824h的3、结果观察与记录、结果观察与记录n培养基变呈粉培养基变呈粉红色，为阳性，红色，为阳性，记记+n培养基颜色不培养基颜色不变，为阴性，变，为阴性，记记 -阳性3、结果观察与记录培养基变呈粉红色，为阳性，记+阳性 （四）（四）氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用,生成胺生成胺类物质和类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性性变紫色，为阳性,如呈黄色为阴性，如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。以此鉴别细菌。（四）氨基酸脱羧酶试验1、原理：2、试验方法、试验方法 取待检菌，分别接种于含有氨基酸取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在内，在361 培养培养14天（指示剂为天（指示剂为溴甲酚紫），每天观察结果。溴甲酚紫），每天观察结果。2、试验方法 取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培3、结果观察与记录、结果观察与记录n试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记记+n试验管、对照管都呈黄色，为阴性，试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记记 -。3、结果观察与记录试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+试试验验管管对对照照管管阳性阳性+阴性阴性-对对照照管管变变黄黄试试验验管管变变黄黄试验管对照管阳性+阴性-对照管变黄试验管变黄阳性反应试验管颜色变化过程阳性反应试验管颜色变化过程紫色紫色黄色黄色紫色紫色原理：原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早对照管呈黄色，说明有细菌生长。在培养的早期（期（1012h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，后由于氨基酸脱羧生成胺，PH又回升至碱性，又回升至碱性，指示剂显紫色。指示剂显紫色。阳性反应试验管颜色变化过程紫色黄色紫色阳性反应试验管颜色变化过程：阳性反应试验管颜色变化过程：紫色紫色黄色黄色紫色紫色阳性反应试验管颜色变化过程：（五）（五）苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。以此鉴别细菌。（五）苯丙氨酸脱氨酶试验1、原理：2、试验方法、试验方法n从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在接种于苯丙氨酸培养基上，在361 培养培养1824h后，加入氯化铁溶液后，加入氯化铁溶液45滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。接触，立即观察结果。2、试验方法从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸3、结果观察与记录n试验管立即出现绿色，为阳性，记+n无色为阴性，记-。加氯化铁试剂出现绿色+3、结果观察与记录试验管立即出现绿色，为阳性，记+加氯化铁（六）（六）明胶液化试验明胶液化试验1、原理、原理 有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。凝胶性质，使培养基由固态变为液态。（六）明胶液化试验1、原理2、试验方法、试验方法 挑取培养挑取培养1824h的待试菌，以较大量穿刺的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约接种于明胶高层约2/3深度。于深度。于2022培养培养714天。明胶高层亦可培养于天。明胶高层亦可培养于361。另取一。另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置两支试管，放入冰箱放置2030min后，再观察后，再观察结果。结果。2、试验方法 挑取培养1824h的待试菌，3、结果观察与记录、结果观察与记录n明胶液化，为阳性，+。n明胶凝固，为阴性，-。3、结果观察与记录明胶液化，为阳性，+。复习题1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项的记录和注意事项2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项和注意事项3、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录的记录4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理阳性反应试验管颜色变化过程和原理复习题1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和 四、四、有机酸盐和铵盐的利用试验有机酸盐和铵盐的利用试验n枸橼酸盐利用试验n丙二酸盐利用试验 四、有机酸盐和铵盐的利用试验枸橼酸盐利用试验（一）（一）枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验1、原理：、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼源，分解枸橼(柠檬柠檬)酸盐生成碳酸盐；同酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。为深蓝色，为阳性。（一）枸橼酸盐利用试验1、原理：2、试验方法、试验方法 挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在上密集划线接种，在361 培养培养14天，天，每天观察结果。每天观察结果。2、试验方法 挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集3、结果观察与记录、结果观察与记录n斜面有菌苔生长，斜面有菌苔生长，培养基斜面变为培养基斜面变为蓝色或深蓝色，蓝色或深蓝色，为阳性，记为阳性，记+；n无菌苔生长，培无菌苔生长，培养基斜面仍为绿养基斜面仍为绿色者，为阴性，色者，为阴性，记记-阳性+3、结果观察与记录斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色（二）（二）丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验1.原理原理:某些细菌可以利用培养基中的丙二某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳丙二酸盐被分解成碳酸钠酸钠,使培养基变为碱性使培养基变为碱性,培养基由草绿培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。（二）丙二酸盐利用试验1.原理:2、试验方法、试验方法 取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于二酸钠培养基上，于361 培养培养48h，观察结果。，观察结果。2、试验方法 取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二3、结果观察与记录、结果观察与记录n培养基由草绿色变成蓝色培养基由草绿色变成蓝色,为阳性为阳性,记记+;n培养基无颜色变化培养基无颜色变化,为阴性为阴性,记记-3、结果观察与记录培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+;五、五、呼吸酶类试验呼吸酶类试验n过氧化氢酶试验n硝酸盐还原试验n氰化钾试验五、呼吸酶类试验过氧化氢酶试验（一）（一）过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验1.原理：原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。应。（一）过氧化氢酶试验1.原理：2、试验方法、试验方法n挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。化氢液，立即观察结果。2、试验方法挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（3、结果观察与记录、结果观察与记录n产生气泡者，为阳性，记产生气泡者，为阳性，记+n不产生气泡者，为阴性，记不产生气泡者，为阴性，记-3、结果观察与记录产生气泡者，为阳性，记+（二）硝酸盐还原试验（二）硝酸盐还原试验1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与-萘萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。阳性反应。（二）硝酸盐还原试验1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，试剂nA、对氨基苯磺酸试剂nB、-萘胺试剂萘胺试剂试剂A、对氨基苯磺酸试剂2、试验方法、试验方法n取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在上接种，在361 培养培养14天，每天取天，每天取2mL培养液培养液,加入加入A、B试剂的等量混合物试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。各二滴混匀，立即观察结果。2、试验方法取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在33、结果观察与记录n呈现红色，为阳性，呈现红色，为阳性，记记+n若无红色出现，为若无红色出现，为阴性，记阴性，记-3、结果观察与记录呈现红色，为阳性，记+（四）（四）氰化钾试验氰化钾试验1.原理原理：氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与可与呼吸酶作用使酶失去活性呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长生长,以此鉴别细菌以此鉴别细菌.（四）氰化钾试验1.原理：2、试验方法、试验方法n 取培养2024h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，361 培养24 48h，观察结果。2、试验方法 取培养2024h的营养肉汤培养液或菌3、结果观察与记录、结果观察与记录n对照管有菌生对照管有菌生长，试验管有长，试验管有菌生长为阳性，菌生长为阳性，记记+。n对照管有菌生对照管有菌生长，试验管无长，试验管无菌生长为阴性。菌生长为阴性。记记-。3、结果观察与记录对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+六、毒性酶类试验六、毒性酶类试验n溶血试验溶血试验n卵磷脂酶试验卵磷脂酶试验n血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 六、毒性酶类试验溶血试验（一）（一）溶血试验溶血试验1、原理：、原理：某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。细菌。（一）溶血试验1、原理：2、试验方法、试验方法有二种：有二种：n平板法平板法n试管法试管法2、试验方法有二种：平板法平板法 将培养物接种于血平板培养基上，将培养物接种于血平板培养基上，361 培养培养24 48h，观察结果。，观察结果。平板法 将培养物接种于血平板培养基上，36溶血试验的溶血类型及现象溶血试验的溶血类型及现象（1）（甲型）溶血（甲型）溶血:菌落周围出现较窄的菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。半透明的草绿色溶血环。（2）（乙型）溶血（乙型）溶血:菌落周围出现较宽的菌落周围出现较宽的透明溶血环。透明溶血环。（3）（-丙型）溶血丙型）溶血:菌落周围无溶血环。菌落周围无溶血环。溶血试验的溶血类型及现象（1）（甲型）溶血:菌落周围出甲型（甲型（-）溶）溶血血乙型（乙型（-）溶血溶血丙型（丙型（-）溶血溶血甲型（-）溶血乙型（-）溶血丙型（-）溶血（二）（二）血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象浆发生凝固现象,为阳性。为阳性。（二）血浆凝固酶试验1、原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固2、试验方法、试验方法（1）玻片法：）玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴生理盐水，另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与另一端滴加一滴兔（人）血浆，挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合，生理盐水和血浆混合，5 min内内,如血浆内出现团如血浆内出现团块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为块或颗粒状凝块，而盐水滴仍呈均匀混浊，则为阳性阳性;如两者呈均匀混浊，无凝则为阴性。如两者呈均匀混浊，无凝则为阴性。2、试验方法（1）玻片法：有凝块有凝块均匀均匀混浊混浊血浆血浆生理盐水生理盐水血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验有凝块均匀混浊血浆生理盐水血浆凝固酶试验 （2）试管法）试管法 取灭菌小试管取灭菌小试管3支支，各加入血浆，各加入血浆0.5ml，1支加入被支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml；其余其余2支作对照管，支作对照管，1支加入金黄色葡萄球菌的营支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照作阳性对照;另另1支加支加入营养肉汤或入营养肉汤或0.9氯化钠溶氯化钠溶0.5ml作空白对照。作空白对照。将将3管同时放管同时放37温箱或水浴中培养，每温箱或水浴中培养，每0.5 h观观察一次，察一次，4 h 内无凝固现象者内无凝固现象者，观察直至，观察直至24小时。小时。（2）试管法 取灭菌小试管3支，各加入血浆0.阳性反应阳性反应阴性反应阴性反应不凝固不凝固少量、少量、零散凝零散凝固固明显的块明显的块状凝固状凝固巨大块巨大块凝固凝固完全凝固，完全凝固，倒置不流倒置不流动动阳性反应阴性反应不凝固少量、零散凝固明显的块状凝固巨大块凝固3、试管法的结果观察与记录、试管法的结果观察与记录n空白对照管的血空白对照管的血浆流动自如，阳浆流动自如，阳性对照管血浆凝性对照管血浆凝固，试验管血浆固，试验管血浆凝固者为阳性；凝固者为阳性；n均无凝固则为阴均无凝固则为阴性。性。3、试管法的结果观察与记录空白对照管的血浆流动自如，阳性对照七、七、三糖铁（三糖铁（TSI）试验）试验七、三糖铁（TSI）试验1、三糖铁试验的原理、三糖铁试验的原理 如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。基底部变黑。1、三糖铁试验的原理 如果细菌可利用乳糖和2、试验方法、试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置物，穿刺接种并涂布于斜面，置361培培养养1824h，观察结果。，观察结果。2、试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物制好的培制好的培养基养基对照管对照管斜面红色，底斜面红色，底面黄色面黄色培养基培养基全黄色全黄色斜面、底部斜面、底部黄色，并产黄色，并产生生H2S斜面红色，底斜面红色，底部黄色，产生部黄色，产生H2S底面黄色，并底面黄色，并产生产生CO2制好的培养基对照管斜面红色，底面黄色培养基全黄色斜面、底部黄思考题n提问：提问：1.志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生乳糖，不产生H2S。在培养基上应该产生什么现象？。在培养基上应该产生什么现象？2.大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生糖，不产生H2S。在培养基上应该是什么现象？。在培养基上应该是什么现象？3.沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？，多数产气，在培养基上应该是什么现象？思考题提问：复习题1、什么是生化试验、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖酵解试验的原理，写出其试验方法和结果的记录、简述糖酵解试验的原理，写出其试验方法和结果的记录4、简述甲基红试验（、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结）的原理，写出其试验方法和结果的记录果的记录5、简述靛基质（、简述靛基质（Imdole）(吲哚吲哚)试验的原理，写出其试试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项验方法、结果的记录和注意事项6、简述硫化氢（、简述硫化氢（H2S）试验的原理，写出其试验结果的记）试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项录和注意事项复习题1、什么是生化试验?7、简述尿素酶（、简述尿素酶（Urease）试验的原理，写出其试验方）试验的原理，写出其试验方法、结果的记录法、结果的记录8、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理阳性反应试验管颜色变化过程和原理9、简述氰化钾试验的原理，写出其试验方法、结果的、简述氰化钾试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项记录和注意事项7、简述尿素酶（Urease）试验的原理，写出其试验方法、结10、写出溶血试验的溶血类型及现象11、简述链激酶试验的原理，12、简述血浆凝固酶试验的原理，并写出玻片法的试验方法13、简述三糖铁（TSI）试验的试验的原理10、写出溶血试验的溶血类型及现象三、血清学试验三、血清学试验血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应补体结合反应补体结合反应三、血清学试验血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件凝集反应n直接凝集反应凝集反应直接凝集反应方法步骤方法步骤:、于洁净玻片的一端加诊断血清、于洁净玻片的一端加诊断血清1 1滴，另一端加滴，另一端加生理盐水生理盐水1 1滴作为阴性对照。滴作为阴性对照。、用接种环取待检菌或血细胞的悬液分别涂于、用接种环取待检菌或血细胞的悬液分别涂于诊断血清和生理盐水中。诊断血清和生理盐水中。、轻轻转动玻片，使其充分混匀，静置数分钟，、轻轻转动玻片，使其充分混匀，静置数分钟，观察结果。观察结果。方法步骤:抗血清抗血清生理生理盐水盐水待检待检菌菌凝集者凝集者为为+未凝集未凝集抗血清生理盐水待检菌凝集者为+未凝集 凝集反应n间接凝集反应 凝集反应间接凝集反应 沉淀反应n环状沉淀反应n絮状沉淀反应 沉淀反应环状沉淀反应 沉淀反应n琼脂扩散试验 沉淀反应琼脂扩散试验 补体结合反应补体结合反应 补体结合反应加油呀!