实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化培训ppt课件

实验兔血清免疫球蛋实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化1实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化培训ppt课件2一、实验目的一、实验目的二、二、实验原理实验原理三、三、实验仪器及试剂实验仪器及试剂四、四、实验步骤实验步骤五、五、注意事项注意事项六、六、数据处理及计算数据处理及计算 实验一实验一 兔血清免疫球蛋白分离兔血清免疫球蛋白分离3 3实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验一 兔血清免疫球蛋白分离3实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化3一一 、实验目的、实验目的 学习并掌握盐析法的原理及用盐析法学习并掌握盐析法的原理及用盐析法进行免疫球蛋白分离与纯化的技术。进行免疫球蛋白分离与纯化的技术。（IgG）4 4实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化一、实验目的 学习并掌握盐析法的原理及4 抗体结构抗体结构 抗体分子是由两抗体分子是由两抗体分子是由两抗体分子是由两条轻链条轻链条轻链条轻链(light chainlight chain,L L L L链链链链)和两条重链和两条重链和两条重链和两条重链(heavy chainheavy chain,H,H,H,H链链链链)通通通通过链间二硫键连接而过链间二硫键连接而过链间二硫键连接而过链间二硫键连接而成。成。成。成。5 5实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化 抗体结构 抗体分子是由两条轻链(li5二、实验原理一二、实验原理一 盐析盐析 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀，这个过程叫做盐析。这个过程叫做盐析。这个过程叫做盐析。这个过程叫做盐析。6 6实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化二、实验原理一 盐析 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对6实验原理实验原理-盐析盐析n n不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分程度不同，加入不同浓度的中性盐可分阶段从溶液中沉淀出来。阶段从溶液中沉淀出来。n n蛋白质盐析中最常用的盐是硫酸铵蛋白质盐析中最常用的盐是硫酸铵n n硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀7 7实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验原理-盐析不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加7三、三、实验仪器及试剂实验仪器及试剂1.实验材料：血清（兔免疫血清）。实验材料：血清（兔免疫血清）。2.试剂：试剂：0.01mol/LpH7.4 PBS、0.5 mol/L NaOH、0.5mol/L HCl、饱和硫酸按（用前以、饱和硫酸按（用前以5mol/L NaOH调至调至pH7.4）、奈氏试剂。）、奈氏试剂。8 8实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化三、实验仪器及试剂1.实验材料：血清（兔免疫血清）。8实8三、三、实验仪器及试剂实验仪器及试剂3.用具：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、用具：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或双或双蒸水煮沸蒸水煮沸10min）、饭盒（装碎冰）等。）、饭盒（装碎冰）等。4.仪器：搅拌器、离心机等。仪器：搅拌器、离心机等。5.溶液配制溶液配制9 9实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化三、实验仪器及试剂3.用具：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试9三、实验试剂n n饱和硫酸铵溶液的配制：称（NH4）2SO4400425克，以7080之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（28%氨溶液）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。1010实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化三、实验试剂饱和硫酸铵溶液的配制：10实验兔血清免疫球蛋白分10磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液n n0.2M0.2M，PH7.4PH7.4磷酸盐缓冲盐液（磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Phosphate Buffered Saline PBSBuffered Saline PBS）配制。）配制。贮存液：贮存液：A A液：液：0.2M NaH0.2M NaH2 2POPO4 4：NaHNaH2 2POPO4 4 2H2H2 2O O 31.231.2克，加蒸馏水至克，加蒸馏水至1000ml1000ml；n n B B液：液：0.2M Na0.2M Na2 2HPOHPO4 4：NaNa2 2HPOHPO4 4 12H12H2 2O O 71.771.7克，加蒸馏水至克，加蒸馏水至1000ml1000ml；n n应用液：取应用液：取A A液液19ml19ml加加B B液液81ml81ml混合，再以生混合，再以生理盐水作理盐水作1010倍稀释，加入倍稀释，加入NaClNaCl至终浓度为至终浓度为0.85%0.85%，即为，即为PBSPBS。1111实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化磷酸盐缓冲液0.2M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosph11柰氏试剂柰氏试剂n nHgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50ml；搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为20%的溶液NaOH 50ml。1212实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化柰氏试剂HgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50m12四、实验步骤四、实验步骤1 兔免疫血清的制备兔免疫血清的制备1313实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化四、实验步骤1 兔免疫血清的制备13实验兔血清免疫球蛋白分离132 硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀（1）取制备好的血清）取制备好的血清20ml，逐滴加入（，逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液饱和溶液20ml，使成，使成50%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置置10min。（2）3000r/min离心离心10min，弃去上清。，弃去上清。（3）用）用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加（磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4饱和溶液饱和溶液3ml，使成，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置溶液，充分混合，静置10min。（4）3000r/min离心离心10min，弃上清。，弃上清。（5）为进一步纯化，可重复步骤）为进一步纯化，可重复步骤3 23次。次。1414实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化2 硫酸铵分级沉淀（1）取制备好的血清20ml，逐滴加入（143 3 透析去盐透析去盐（6）用）用5mlPBS溶解沉淀，装入透析袋。溶解沉淀，装入透析袋。（7）透析除盐，中间换液数次，至奈氏试剂测透析外液）透析除盐，中间换液数次，至奈氏试剂测透析外液无黄色。无黄色。1515实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化3 透析去盐（6）用5mlPBS溶解沉淀，装入透析袋。15实15五、数据处理及计算五、数据处理及计算蛋白含量（蛋白含量（mg/mL）（1.45OD 280nm 0.74 OD 260nm）样品稀释度样品稀释度 注：式中注：式中1.45与与0.74为常数，为常数，nm为波长。为波长。蛋白质及其定量鉴定：取样品少许作适量稀释，以紫蛋白质及其定量鉴定：取样品少许作适量稀释，以紫外分光光度计测量蛋白含量外分光光度计测量蛋白含量 260、280nm处读数处读数1616实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化五、数据处理及计算蛋白含量（mg/mL）蛋白质及其定量鉴16实验报告的要求实验报告的要求n n题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果、注意事项（心得体会）n n班级、姓名、学号n n由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好n n自己写、书写整齐n n订成一本或每次分开1717实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验兔血清免疫球蛋白分离和纯化实验报告的要求题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果、注意事17