基因诊断ppt课件

基因诊断课件第一页，共43页。基因诊断课件基因诊断课件基因诊断课件概述几乎所有的疾病均在一概述概述几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联络，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾络，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和开展，疗效和测基因的改变来反映疾病的发生和开展，疗效和预后预后基因诊断：是以基因诊断：是以DNADNA或或RNARNA为诊断材料，通过检查基因的为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。方法和过程。2021/1/122第二页，共43页。概述几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联络，基因的改变基因诊断经历了三个根本开展阶段第一阶段：世纪年代，以DNA分子杂交为根底，通过限制性片段长度多态性性RFLP)分析进展第二阶段：应用PCR技术第三阶段：应用基因芯片技术2021/1/123第三页，共43页。基因诊断经历了三个根本开展阶段第一阶段：世纪年代，以第一节第一节 基因诊断的根底技术基因诊断的根底技术一一.基因诊断中常用的几种技术基因诊断中常用的几种技术一一 核酸杂交核酸杂交二二 PCR PCR三三 DNA DNA序列测定序列测定四四 DNA DNA芯片技术芯片技术2021/1/124第四页，共43页。第一节 基因诊断的根底技术一.基因诊断中常用的几种技术20(一)核酸分子杂交技术(1)(1)方法方法:以顺序核酸片段作为探针以顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标记后经放射性或非放射性物质标记后,再再与未知的目的核酸片段进展杂交反响与未知的目的核酸片段进展杂交反响,别离已杂交和未杂交的标记别离已杂交和未杂交的标记核酸链核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进展定性、通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进展定性、定量分析定量分析.(2)(2)几种不同形式的核酸分子杂交几种不同形式的核酸分子杂交 a.Southern a.Southern印迹印迹(southern blot)(southern blot)杂交杂交:用于用于DNADNA的检测，可的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等 b.Northern b.Northern印迹印迹(Northern blot)(Northern blot)杂交杂交:用于用于RNARNA的检测，能对的检测，能对组织细胞中的总组织细胞中的总RNA RNA 或或mRNAmRNA进展定性和定量分析进展定性和定量分析 c.c.斑点杂交斑点杂交dot blot):dot blot):既可以检测既可以检测DNADNA也可以检测也可以检测RNA,RNA,用于用于特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特特定基因及其表达的定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低异性低 2021/1/125第五页，共43页。(一)核酸分子杂交技术(1)方法:2021/1/125第五页d.原位杂交in situ hybridization):e.f.是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术可分为DNA原位杂交和RNA原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断g.分类:玻片原位杂交:如中期的染色体和组h.织切片.i.膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印在尼 j.龙膜(如硝酸纤维膜)k.l.2021/1/126第六页，共43页。原位杂交in situ hybridization):原位杂交的镜像图2021/1/127第七页，共43页。原位杂交的镜像图2021/1/127第七页，共43页。(二)PCR技术在基因诊断中的应用等位基因特异性寡聚核苷酸等位基因特异性寡聚核苷酸allele specific allele specific oligonnucleotide,ASO)oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交：探针斑点杂交：PCR-ASOPCR-ASO该方法是诊断点的突变：需分别合成野生型和突变型探针该方法是诊断点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用在基因诊断时，只需用PCRPCR扩增受检者目的扩增受检者目的DNADNA片段，再片段，再分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况：分别与上述探针杂交杂交的结果有如下几种情况：PCR PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不不 存在这种突变；存在这种突变；只与突变探针杂交只与突变探针杂交-突变基因为纯合子；突变基因为纯合子；与正常探针和突变探针都可杂交与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子；突变基因为杂合子；与正常探针和突变探针都不能杂交与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属突变基因不属于已发于已发 现的类型现的类型2021/1/128第八页，共43页。(二)PCR技术在基因诊断中的应用等位基因特异性寡聚核单链构象多构象多态性性single strand single strand conformation ploymorphism,SSCP)conformation ploymorphism,SSCP)分析分析是一种基于单链是一种基于单链DNADNA构象差异来检测点突变的方构象差异来检测点突变的方 法法DNADNA变性形成单链，在中性条件下长度一样的单变性形成单链，在中性条件下长度一样的单 链指链指DNA,DNA,假如碱基组成和假如碱基组成和(或或)排列顺序不同排列顺序不同,形成的形成的 构象就不同构象就不同,这样就形成了单链构象多态性这样就形成了单链构象多态性.这些分子在非变性这些分子在非变性PAGEPAGE中电泳中表现出不同的迁移率中电泳中表现出不同的迁移率.SSCPSSCP特别适于分析小于特别适于分析小于400bp 400bp 的的 PCR PCR产物。据认为产物。据认为SSCPSSCP可以区分可以区分1bp1bp的差异的差异PCR-SSCPPCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进展测序分析，确定变异性质还需进展测序分析，确定变异性质2021/1/129第九页，共43页。单链构象多态性single strand 是一种基于(3)(3)(3)(3)限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 restriction fragment length restriction fragment length restriction fragment length restriction fragment length polymorphisms,RFLPpolymorphisms,RFLPpolymorphisms,RFLPpolymorphisms,RFLP分析分析分析分析基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因构造中产生新的限制性内切酶位点或使原有的位点消失.用限制酶对不同个体基因组进展消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变，根据这些改变可以判断出突变是否存在.2021/1/1210第十页，共43页。(3)限制性片段长度多态性 restriction fra 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性 RFLPs(restriction fragment length polymorphisms)样品一样品二1987年等人以RFLP为遗传标记绘制了第一张人类遗传图谱2021/1/1211第十一页，共43页。限制性片段长度多态性样品一样品二1987年等人以RFL(4)PCR+(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术变性梯度凝胶电泳分析技术 双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时,DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA开场解链，从而不同的DNA片段会形成不同的迁移率条带优点：可靠，检出单碱基突变率可达缺点：富含高熔点GC区时，那么难以检测出突变2021/1/1212第十二页，共43页。(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术 双链DNA在一定用甲基化特异性用甲基化特异性PCRPCRmethylation-specific methylation-specific PCR)PCR)进展分析进展分析 在PCR扩增前，先用化学试剂NaHSO3)处理模板DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶C)转变成尿嘧啶(U)，在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化的C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异可以进展甲基化特异性PCR设计一对甲基化特异性引物引物中G结合模板中C);和非甲基化特异性引物引物中A结合模板中U),通过PCR扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰的DNA序列和非甲基化等位基因序列用于一些疾病和肿瘤的基因诊断2021/1/1213第十三页，共43页。用甲基化特异性PCRmethylation-spec(6)采用PCR技术对靶核酸进展定量分析 定量PCR(quantiative PCR,Q-PCR):就是对靶核酸分子进展定量分析的技术.根据PCR扩增指数增长期原理，理论上扩增产物累积分子数N=No(1+E),其中E是指每次循环中参与复制的模板数与总模板数的比率.通过N值可求出No.但PCR扩增时平台期(15-25)的出现会影响测量的准确度.定量PCR的策略和方法较多.n2021/1/1214第十四页，共43页。(6)采用PCR技术对靶核酸进展定量分析 定量PCR(q a.通过测定PCR产物量 方法:对量的靶DNA进展系列稀释,比较待测样品和系列稀释样品的PCR产量,还可对未知量的靶DNA进展绝对定量.b.采用极限稀释法对靶核酸进展定量分析:方法:将待测DNA标本进展倍数稀释,直至扩增不到靶基因的稀释度,用稀释程度表示启始靶基因分子数的相对量,是一种半定量方法.2021/1/1215第十五页，共43页。a.通过测定PCR产物量2021/1/1215第十五页 c.采用非竞争性对照法对靶核酸进展定量分析 方法:该方法是在一个试管内同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标序列,用内标序列控制DNA的用量、可扩增性和管间扩增效率的变化,通过比较两段序列PCR扩增产物电泳带的荧光强度,对靶序列进展定量分析 d.采用竞争抑制法对靶核酸进展定量分析:方法:参照标准不是同一核酸分子上的另一段序列,通常是人工模板,与待测序列具有一样的引物结合位点,能与待测序列竞争聚合酶,底物,引物分子.方法:将竞争模板作系列稀释后参加恒量的样品DNA进展PCR扩增,通过别离和分析竞争模板和样品DNA的PCR产量,对样品DNA进展定量分析2021/1/1216第十六页，共43页。c.采用非竞争性对照法对靶核酸进展定量分析2021/1/1 e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术,是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,具有灵敏度高,特异性强等优点.FQ-PCR技术的两种定量形式:绝对定量:一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量.如合成目的基因;将PCR产物直接梯度稀释;或将PCR产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量.优点:稳定,准确.相对定量:指在测定目的基因的同时测定一内源性管家基因(如-actin,rRNA等),该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较,反映反响体系内是否存在PCR扩增的影响因素.2021/1/1217第十七页，共43页。e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术2021/1/12(三DNA序列测序1977年Sanger创立的链终止反响序列测序法 用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA链的延伸，产生长度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳别离这些片段，放射自显影读出结果。自动测序法 采用四色荧光标记代替了放射性同位素标记。DNA 测序测定是基因突变检测的最直接，最准确的方法，它不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质2021/1/1218第十八页，共43页。(三DNA序列测序1977年Sanger创立的链终止反响序四DNA芯片技术 DNA芯片DNA chip)又称为基因芯片，DNA微阵列DNA microarray)该技术的根底仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针oligos or cDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成DNA微阵列。用荧光标记待测样品DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定的软件对荧光信号进展综合分析，就能获得待测样品的大量基因序列信息或表达信息。基因芯片按照用处分为：表达芯片，诊断芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。该技术可用于新基因鉴定，突变检测，表达监控和遗传制图等。2021/1/1219第十九页，共43页。四DNA芯片技术 DNA芯片DNA chip)又称为基第二节第二节 对不同的疾病需要采用不同的基对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略因诊断策略 已经根本清楚基因突变与疾病发生之间的分子机制，相关的基因已被克隆，测序，并被定位在染色体上。如：一些与疾病有关的内源基因-癌基因，抑癌基因和血红蛋白基因突变型。诊断方法：根据突变的基因序列设计探针.2021/1/1220第二十页，共43页。第二节 对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略2021/1/二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病 许多基因病，虽然它们的基因构造还没有说明，但通过染色体分析已被定位在染色体的特定位置上，这些基因是通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来发现的。原理：同一染色体上位置非常靠近的相邻基因或其它遗传标记，在遗传过程中别离的几率很低，常常一起遗传，形成连锁。可以通过一个或几个基因或遗传标记的分析，理解另一个或几个基因。2021/1/1221第二十一页，共43页。二.通过连锁遗传标志检测诊断疾病 许多基因病，虽然它们40-60年代:功能克隆,即基于明显可见的或直接与生化功能相关的线索确定与疾病相关的基因:如苯丙酮尿症与镰刀型的贫血病等.70-80年代:定位克隆,即基于疾病-染色体-基因的反向遗传学策略对没有明显的表型或生化功能异常的疾病.90-今 :表型克隆,不考虑基因在染色体上的位置信息,而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子程度上的差异.2021/1/1222第二十二页，共43页。40-60年代:功能克隆,即基于明显可见的或直接与生化功能利用表型克隆诊断疾病表型克隆：对疾病相关的一组基因进展克隆 一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，由于疾病发生的原因复杂，不仅涉及多基因互作，还涉及基因与环境互作。不可能通过前面的方法来诊断，必须利用差异显示等技术找出正常人和疾病患者之间的差异序列，鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。方法：根据克隆到的一组基因制作相应的一组探针，用这组探针检测一组与疾病相关的基因来诊断多基因病2021/1/1223第二十三页，共43页。利用表型克隆诊断疾病表型克隆：对疾病相关的一组基因进展克隆 第三节 遗传病的基因诊断一.遗传病基因诊断的策略1.直接策略：采用基因突变的诊断方法，直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆.2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进展基因诊断.2021/1/1224第二十四页，共43页。第三节 遗传病的基因诊断一.遗传病基因诊断的策略2021/人类基因组上的DNA遗传标记1980 限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLPs)1985 短串联重复序列短串联重复序列(short tendem repeats,STRs,mini-satellites)1990s 单核苷酸多态性单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs)2021/1/1225第二十五页，共43页。人类基因组上的DNA遗传标记 限制性片段长度多态性(RFLP短串联重复序列短串联重复序列STRs (short tendem repeats,Microsatellites)STR广泛存在于人基因广泛存在于人基因组组，占，占约约5%，根本根本单单位是位是1bp-8bp的串的串联联重复，重复，重复次数重复次数 n=15-60，8000多个，多个，主要形式主要形式为为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以，其中以(CA)n，(GT)n 为为多多见见。1992年，年，Welssenbanch等以等以STR为标记为标记的第的第二代二代连锁图连锁图取代了取代了RFLP连锁图连锁图。2021/1/1226第二十六页，共43页。短串联重复序列STR广泛存在于人基因组，占约5%，2021/定义定义:主要是指在基因组程度上由单个核苷酸的变异主要是指在基因组程度上由单个核苷酸的变异所引起的所引起的DNADNA序列多态性。与序列多态性。与RFLPRFLP与与STRSTR不同不同,它是直接它是直接以序列的变异作为标记以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为而不是以片段的长度差异作为标记标记.人类基因组图谱的初步分析说明，共有人类基因组图谱的初步分析说明，共有3 3万至万万至万个基因。有个基因。有300300多万个单核苷酸多态性多万个单核苷酸多态性,SNP,SNP在人类基在人类基因组中广泛存在，平均每因组中广泛存在，平均每50050010001000个碱基对中就有个碱基对中就有1 1个，个，3-43-4个相邻的标记构成的单倍型个相邻的标记构成的单倍型haplotypehaplotype就就可有可有8-168-16种。种。19961996年，年，LanderLander报道了用单核苷酸多态性报道了用单核苷酸多态性 标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。单核苷酸多态性单核苷酸多态性single nucleotid polymorphismsingle nucleotid polymorphism，SNPSNP2021/1/1227第二十七页，共43页。定义:主要是指在基因组程度上由单个核苷酸的变异所引起的DNSNP用作遗传标记具有以下优点：SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。与串联重复的微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定的.尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的构造或基因表达程度，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。易于进展自动化分析，缩短了研究时间.2021/1/1228第二十八页，共43页。SNP用作遗传标记具有以下优点：SNP在人群中是二等位一一.血红蛋白病的基因诊断血红蛋白病的基因诊断 分为异常血红蛋白病和地中海贫血分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是前者是由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋由于珠蛋白的基因突变；后者是由于珠蛋白合成速率降低，白合成速率降低，a a链和链和b b链合成不平衡。链合成不平衡。一异常血红蛋白病的基因诊断：一异常血红蛋白病的基因诊断：如镰状红细胞贫血病如镰状红细胞贫血病:链第六位氨基酸链第六位氨基酸:GAA(:GAA(谷谷)GUA()GUA(颉颉)代替代替.对该病的基因诊断应采用对该病的基因诊断应采用:1)PCR+1)PCR+限制酶切限制酶切,即用即用PCRPCR从患者基因组从患者基因组扩增含突变位点的珠蛋白基因片段扩增含突变位点的珠蛋白基因片段,再选再选适当的内切酶消化适当的内切酶消化PCRPCR产物产物,根据电泳图根据电泳图谱上片段数量和大小做出判断谱上片段数量和大小做出判断 2)Southern 2)Southern 印迹杂交分析印迹杂交分析2021/1/1229第二十九页，共43页。一.血红蛋白病的基因诊断 分为异常血红蛋白病和地中海贫血,血红蛋白病的基因诊断血红蛋白病的基因诊断2 2二二 地贫的基因诊断：地贫的基因诊断：1.1.定性分析：定性分析：PCRPCR法直接扩增法直接扩增11和和22 基因的基因的33端有差异，针对此可设计端有差异，针对此可设计 引物进展引物进展PCRPCR，如有缺失，那么不能扩，如有缺失，那么不能扩 增出产物增出产物 2.2.定量分析定量分析:地贫的共同特点是地贫的共同特点是 珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA的量减少，因此可用的量减少，因此可用 RT-PCR RT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊断的量以助诊断2021/1/1230第三十页，共43页。血红蛋白病的基因诊断2二 地贫的基因诊断：2021/1 三三-地贫的基因诊断地贫的基因诊断 1.DN 1.DN检测与分析检测与分析 ：PCR+ASO PCR+ASO 探针法探针法 为主要方法为主要方法 根据根据-珠蛋珠蛋 白主要突变位点，设计白主要突变位点，设计2 2对引物，扩增可能发生对引物，扩增可能发生 突变的突变的2 2个片段个片段,再分别与相应野生型探针和突再分别与相应野生型探针和突 变探针进展斑点杂交。变探针进展斑点杂交。PCR+RFLP PCR+RFLP连锁分析法连锁分析法 检测与检测与-珠蛋白基因连珠蛋白基因连 锁的遗传标记进展基因诊断锁的遗传标记进展基因诊断,如如-珠蛋白珠蛋白55端端 有一限制内切酶有一限制内切酶HgiAIHgiAI的多态性位点的多态性位点,在中国人在中国人 群的频率为群的频率为0.5 0.5 DNA DNA芯片技术芯片技术 2.RNA 2.RNA检测与分析：检测与分析：RT-PCRRT-PCR定量分析定量分析mRNAmRNA的量以助诊的量以助诊 断断2021/1/1231第三十一页，共43页。三-地贫的基因诊断2021/1/1231第三十一页二二.杜氏肌营养不良症杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular(Duchenne muscular dystrophy,DMD)dystrophy,DMD)DMDDMD：是性连锁隐性遗传病：是性连锁隐性遗传病,是由抗肌萎缩蛋白是由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)(dystrophin)基因突变基因突变(突变或缺失突变或缺失).).其突出其突出特点为横纹肌进展性萎缩，引起无力和挛缩。特点为横纹肌进展性萎缩，引起无力和挛缩。DMDDMD相对更为常见。相对更为常见。DMDDMD患儿在患儿在5 5岁前发病，岁前发病，2020岁岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约在男性活婴中约1/3500 1/3500。2021/1/1232第三十二页，共43页。二.杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular d杜氏肌营养不良症的基因诊断杜氏肌营养不良症的基因诊断1.RFLP连锁分析:通过家系连锁分析,找出与突变基因相连锁的DNA多态性,并将其作为遗传标记追踪多态性在家族成员中的传递.2.基因组DNA探针法:用突变高发区的常见序列作为探针,检测抗肌萎缩蛋白基因的相应变异.3.cDNA探针法:用较短的抗肌萎缩蛋白基因cDNA作为探针.比2方便、检出率高.4.多重PCR法:对基因突变较集中的区域,设计多对引物,扩增基因相应的突变高发区,检测相应的基因突变.2021/1/1233第三十三页，共43页。杜氏肌营养不良症的基因诊断RFLP连锁分析:通过家系连锁分析第四节 用基因诊断技术检测肿瘤 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制非常复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略.一.通过检测肿瘤染色体易位及交融基因诊断肿瘤淋巴造血系统肿瘤:染色体易位及基因交融是较普遍的现象.如:淋巴瘤和淋巴结反响性增生.它是由于T细胞受体(TCR)基因和IgH基因重排,使原来相隔数百个碱基的IgH和TCR基因的V区和J区靠近在一起.用PCR扩增该区域片段,通过长度分析就能判断是否发生了基因重排.2021/1/1234第三十四页，共43页。第四节 用基因诊断技术检测肿瘤 肿瘤的发生涉及多个基因、二二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生亲密相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变1.癌基因-ras与肿瘤:ras是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变,高发区是第12、13和61位密码子.如90%的胰腺癌,50%的结直肠癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突变.ras癌基因点突变检测方法:法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类 型。法：根据PCR扩增的目的DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便；缺点：不能检测出突变的详细位点和详细类型。2021/1/1235第三十五页，共43页。二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤续 2.P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基 因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基 因表达异常而使p53失活，约50%以上的恶性肿瘤有 p53基因突变。突变类型：130290密码子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。基因检测方法：PCR-SSCP:可检出有无突变 PCR-RFLP:通过内切酶位点的消 失或增加检测p53的基因突变。2021/1/1236第三十六页，共43页。通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤续 2.P53基因与肿 已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如:Burkitt 淋巴瘤人类乳头瘤病毒(HPV)宫颈癌通过检测这些病毒的基因就可以帮助诊断相应的肿瘤.EB病毒2021/1/1237第三十七页，共43页。已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和开展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。类型：基因标志：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。基因诊断方法：基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技术。导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，可用RT-PCR技术检测肿瘤标记物mRNA的存在或含量的改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标记物，在肿瘤细胞中该酶的活性增高。2021/1/1238第三十八页，共43页。mRNA诊断肿瘤肿瘤标志物tumor marker)是由肿第五节第五节 感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断 每种病原体都有各自特异的遗传物质每种病原体都有各自特异的遗传物质,可以是可以是DNA,DNA,也也可以是可以是RNA.RNA.每种病原生物都有各自种属特异的基因每种病原生物都有各自种属特异的基因.一一.病毒感染性疾病的诊断病毒感染性疾病的诊断 a.a.乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒:目前采用免疫法检测血清中病毒抗目前采用免疫法检测血清中病毒抗原原.HBV HBV基因组包含基因组包含4 4个开放阅读框个开放阅读框,S,S、C C、P P和和X X区区,C,C区区变异性小变异性小,是基因诊断采用的目的部位是基因诊断采用的目的部位.在用在用PCRPCR检测检测时可扩增时可扩增HBVHBV的特异核苷酸序列的特异核苷酸序列,通过通过PCRPCR产物的直接产物的直接电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或电泳分析、或内切酶谱分析、或点杂交、或SouthernSouthern印迹等结果作出判断印迹等结果作出判断.也可采用基因芯片技也可采用基因芯片技术术.2021/1/1239第三十九页，共43页。第五节 感染性疾病的基因诊断 每种病原体都有各自特异 b.b.传染性非典型肺炎传染性非典型肺炎(SARS):(SARS):是由新型变异冠状病毒是由新型变异冠状病毒(SARS-CoV)(SARS-CoV)感染引起感染引起.SARS-CoV.SARS-CoV基因基因组为正链单股组为正链单股RNA,RNA,有有1111个开放阅读框个开放阅读框,基因组的特异保守序列为基因组的特异保守序列为编码编码RNARNA聚合酶的序列聚合酶的序列.基因诊断方法基因诊断方法:采用采用RT-PCRRT-PCR技术扩增保守序列技术扩增保守序列 DNADNA芯片芯片二二.诊断细菌感染性的疾病诊断细菌感染性的疾病 用用PCRPCR技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列技术通过对致病细菌所含质粒的特异序列,设计引物设计引物,检测引检测引起的疾病的细菌类型起的疾病的细菌类型.2021/1/1240第四十页，共43页。b.传染性非典型肺炎(SARS):2021/1/1240第五节 基因诊断存在的问题与开展前景一.基因诊断技术应用存在的问题 1.理论问题 目前找到的致病基因不多,由多基因及基因 与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不 清楚 2.技术问题 设备条件;操做人员;污染造成的假阳性.3.伦理问题二.开展前景2021/1/1241第四十一页，共43页。第五节 基因诊断存在的问题与开展前景一.基因诊断技术应用存在完毕语 基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA程度检测基因的存在、分析基因的构造变异和表达状态,从而对疾病作出诊断.基因诊断的根本技术是核酸分子杂交和PCR扩增.前者是最直接、最准确的基因诊断技术,后者那么是应用前景最为广阔的诊断技术.目前,基因诊断技术已广泛地应用到遗传病、肿瘤和感染性疾病的诊断.随着医学和分子生物学技术的不断开展,基因诊断技术将会更加广泛.2021/1/1242第四十二页，共43页。完毕语 基因诊断利用分子生物学技术,从DNA/RNA程谢谢！第四十三页，共43页。谢谢！第四十三页，共43页。