免疫学检测技术与应用课件

免疫学检测技术及应用免疫学检测技术及应用免疫学教研室免疫学教研室免疫学检测技术及应用1免疫学检测技术应用：免疫学检测技术应用：1.1.疾病的诊断、治疗效果评价及疾病的诊断、治疗效果评价及发病机理探讨：发病机理探讨：如：感染性疾病、免疫缺陷病、如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应、肿瘤等移植排斥反应、肿瘤等 2.2.免疫分子的定性、定量测定：免疫分子的定性、定量测定：如：细胞因子、粘附分子、细胞如：细胞因子、粘附分子、细胞受体、补体、抗体等受体、补体、抗体等免疫学检测技术应用：2 3.3.抗原物质的定性、定量检测：抗原物质的定性、定量检测：如：病原微生物及其代谢产物，组织细如：病原微生物及其代谢产物，组织细胞、蛋白质等胞、蛋白质等 4.4.免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：如：如：T T细胞及其亚群等细胞及其亚群等 3.抗原物质的定性、定量检测：3抗原抗体反应抗原抗体反应抗原与相应抗体在体内或体外相遇可抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。发生特异性结合，呈现的某种反应现象。抗原抗体反应4抗原抗体反应有以下几个特点抗原抗体反应有以下几个特点:1.1.抗原与抗体结合是特异性结合抗原与抗体结合是特异性结合 表位表位(抗原抗原)超变区超变区(抗体抗体)2.2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合结合 氢键、疏水键、静电引力和范氢键、疏水键、静电引力和范德华力德华力(Van der waals force)(Van der waals force)、电子云力的合力。电子云力的合力。抗原和抗体可解离抗原和抗体可解离,性质不变。性质不变。抗原抗体反应有以下几个特点:5 3.3.抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段 （1 1）特异性结合阶段）特异性结合阶段 此阶段需时短此阶段需时短,仅需几秒到几分钟仅需几秒到几分钟,无可见无可见 反应出现反应出现 （2 2）可见反应阶段）可见反应阶段 需时较长需时较长,数分数分,数小时或数日出现可见现数小时或数日出现可见现 象象,表现为沉淀表现为沉淀,凝集凝集,细胞溶解等细胞溶解等 4.4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现 象象,与两者的分子比例密切相关与两者的分子比例密切相关 免疫学检测技术与应用课件6免疫学检测技术与应用课件7抗原抗体反应的主要影响因素：抗原抗体反应的主要影响因素：1.电解质电解质:在中性或碱性条件下在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负抗原抗体均带负电荷电荷,适当浓度的电解质会使它们失适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合去一部分负电荷而互相结合,出现明显出现明显的沉淀或凝集现象。的沉淀或凝集现象。2.温度温度:37 3.酸碱度酸碱度:pH6-8抗原抗体反应的主要影响因素：8抗原抗体反应包括：抗原抗体反应包括：沉淀反应沉淀反应 凝集反应凝集反应 溶解反应溶解反应 补体结合反应补体结合反应 中和反应中和反应 已知抗体已知抗体 检测未知抗原；检测未知抗原；已知抗原已知抗原 检测未知抗体。检测未知抗体。抗原抗体反应包括：9Sensitivity of varior immunoassaysSensitivity of varior immunoassaysSensitivity of varior immunoas10一、沉淀反应一、沉淀反应(precipitation)(precipitation)可溶性抗原与相应抗体在电解质可溶性抗原与相应抗体在电解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。存在条件下结合，出现沉淀物的现象。沉淀反应的试验方法：环状法沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法絮状法 琼脂中沉淀琼脂中沉淀法法 一、沉淀反应(precipitation)11琼脂中沉淀反应法：琼脂中沉淀反应法：双向免疫扩散双向免疫扩散(double immunodiffusion)(double immunodiffusion)单向免疫扩散单向免疫扩散(single radial(single radial immunodiffusion)immunodiffusion)对流免疫电泳对流免疫电泳(counter(counter immunoelectrophoresis)immunoelectrophoresis)火箭电泳火箭电泳(rocket electrophoresis)(rocket electrophoresis)免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)(immunoelectrophoresis)免疫学检测技术与应用课件12免疫学检测技术与应用课件13二、凝集反应二、凝集反应(agglutination)(agglutination)颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原性抗原(或抗体或抗体)于相应抗体于相应抗体(或抗原或抗原)，在电解质存在下出现凝集物的现象。在电解质存在下出现凝集物的现象。免疫学检测技术与应用课件14凝集反应包括：凝集反应包括：直接凝集反应直接凝集反应(direct (direct agglutination)agglutination)间接间接(被动被动)凝集反应凝集反应(indirect/passive(indirect/passive agglutination)agglutination)间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验(indirect(indirect agglutination agglutination inhibition test)inhibition test)协同凝集试验协同凝集试验(coagglutination(coagglutination test)test)抗球蛋白试验抗球蛋白试验(antiglobulin test(antiglobulin test，Coombs Coombs test)test)凝集反应包括：15免疫学检测技术与应用课件16三三.免疫标记技术免疫标记技术 用荧光素、同位素、酶及发光等示用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物质标记抗体踪物质标记抗体(或抗原或抗原)，与抗原，与抗原(或抗或抗体体)进行反应，通过检测示踪物质，分析进行反应，通过检测示踪物质，分析被检抗原被检抗原(或抗体或抗体)的存在或含量的方法。的存在或含量的方法。灵敏度：高，灵敏度：高，1X10-4 1X10-4 1X10-5ug1X10-5ug抗抗体体/ml/ml 应用：微量物质的定性、定量或定位。应用：微量物质的定性、定量或定位。三.免疫标记技术17免疫标记技术的基本类型：免疫标记技术的基本类型：（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术(immunofluorescence(immunofluorescence technique)technique)（二）免疫酶技术（二）免疫酶技术(immunoenzymatic(immunoenzymatic technique)technique)（三）同位素标记技术（三）同位素标记技术(isotope(isotope labellinglabelling technique)technique)（四）发光免疫测定（四）发光免疫测定(luminescent(luminescent immuno-assay,LIA)immuno-assay,LIA)（五）免疫胶体金标记技术（五）免疫胶体金标记技术(colloidal(colloidal goldgold immunogold immunogold staining)staining)免疫标记技术的基本类型：18（一）免疫荧光技术（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术又称荧光抗体技术)原理：用荧光素原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗丹明如异硫氰酸荧光素、罗丹明B200等等)标记抗体标记抗体(荧光抗体荧光抗体)，用荧光抗体浸，用荧光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存在。存在。免疫荧光技术包括：免疫荧光技术包括：直接法直接法 间接法间接法 间接补体增强法间接补体增强法（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术)19Direct and indirect immunofluore-scence staining of membrane antigen(mAg).Direct and indirect immunofluo20（二）免疫酶技术（二）免疫酶技术(immunoenzymatic(immunoenzymatic techniques)techniques)是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用相结合的一种方法。相结合的一种方法。主要有两种类型：主要有两种类型：1.1.免疫酶染色免疫酶染色 2.2.酶免疫测定（酶免疫测定（enzyme immunoassay,enzyme immunoassay,EIA EIA）（二）免疫酶技术(immunoenzymatic 211.免疫酶染色(又称免疫组化技术,immunohistochemistry technique)原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色物质，观察结果。应用：细胞内、组织内抗原的定性、定量和定位检测。1.免疫酶染色(又称免疫组化技术,222.2.酶免疫测定酶免疫测定 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)ELISA)原理：原理：将抗原将抗原(或抗体或抗体)结合于固相载结合于固相载体；体；与抗体与抗体(或抗原或抗原)反应；反应；加酶底物，酶加酶底物，酶促反促反应。应。灵敏度：灵敏度：2X10-5 g2X10-5 gmlml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微生物成分、激素、细胞因子、粘附如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。分子等）。2.酶免疫测定23 ELISA ELISA法：法：直接法直接法 间接法间接法 双抗体夹心法双抗体夹心法(双位点法双位点法)竞争法竞争法免疫学检测技术与应用课件24ELISAELISA25(三三)同位素标记技术同位素标记技术(isotope-labelling technique)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应相结合方法。相结合方法。优点：灵敏度高优点：灵敏度高,可检测可检测0.001pgmL 特异性强特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。应用：微量抗原和抗体检测。缺点：不稳定，废物处理麻烦等。缺点：不稳定，废物处理麻烦等。(三)同位素标记技术(isotope-labelling 26（四）发光免疫分析（四）发光免疫分析(luminescent immuno-(luminescent immuno-assay,LIA)assay,LIA)原理：用发光物质标记抗体原理：用发光物质标记抗体(或抗原或抗原),),再同再同抗原抗原(或抗体或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统。抗体反应的指示系统。应用：定量检测抗原、抗体。应用：定量检测抗原、抗体。发光分为：化学发光发光分为：化学发光(chemiluminescence)(chemiluminescence)生物发光（生物发光（bioluminescencebioluminescence）（四）发光免疫分析(luminescent immuno-a27化学发光原理：化学发光原理：发光物质发光物质 激发态分子激发态分子 基态基态分子分子 释放光子释放光子(发光发光)化学发光剂：鲁米诺（化学发光剂：鲁米诺（luminol luminol）反应剂：过氧化阴离子反应剂：过氧化阴离子反应剂反应剂反应剂反应剂化学发光原理：反应剂28（五）免疫胶体金技术（五）免疫胶体金技术(colloidal gold(colloidal goldimmunogold staining)immunogold staining)原理：胶体金标记蛋白质原理：胶体金标记蛋白质(如抗体如抗体)+)+组组织细胞织细胞(待测待测)观察结果观察结果(用电镜、光镜用电镜、光镜或肉眼或肉眼)应用：免疫组织化学定位，测定细胞表应用：免疫组织化学定位，测定细胞表面标志和细胞内成分。面标志和细胞内成分。优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。胶体金：用还原法将四氯金酸胶体金：用还原法将四氯金酸(HAuCl4)(HAuCl4)制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。（五）免疫胶体金技术(colloidal goldimmu29淋巴细胞的检测技术淋巴细胞的检测技术一一.淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 1.1.外周血单个核细胞外周血单个核细胞(淋巴细胞淋巴细胞 90%)90%)的分离的分离 密度梯度离心法密度梯度离心法 (密度为密度为1.077)1.077)(2000rpm,15min)(2000rpm,15min)淋巴细胞的检测技术(密度为1.077)(2000rpm,15302.2.尼龙纤维分离法：尼龙纤维分离法：单个核细胞单个核细胞 通过尼龙纤维柱通过尼龙纤维柱 B B细胞和单核细胞细胞和单核细胞(粘附特性粘附特性)T T细胞细胞(非粘附性非粘附性)。3.3.流式细胞术（流式细胞术（flow cytometry,FCMflow cytometry,FCM）：）：荧光素标记抗体待检细胞荧光素标记抗体待检细胞 单列经过单列经过FACSFACS 分离（荧光素不同）的细胞分离（荧光素不同）的细胞 *FACS *FACS：荧光激活细胞分类仪：荧光激活细胞分类仪(fluore-(fluore-scent activated cell sorter)scent activated cell sorter)2.尼龙纤维分离法：31流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪32免疫学检测技术与应用课件334.4.磁珠分离术：磁珠分离术：(1)(1)直接法：直接法：免疫磁珠免疫磁珠(磁性微粒结合抗体磁性微粒结合抗体)+)+细胞细胞 通过磁场通过磁场 分离磁珠结合细胞分离磁珠结合细胞 +解离剂解离剂 获纯化细胞获纯化细胞 (2)(2)间接法：间接法：免疫磁珠免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体磁性微粒结合第二抗体)+)+细细胞胞+抗体抗体 通过磁场通过磁场 分离磁珠结合细胞分离磁珠结合细胞 +解离剂解离剂 获纯化细胞获纯化细胞 4.磁珠分离术：34免疫学检测技术与应用课件35 淋巴细胞的功能测定技术淋巴细胞的功能测定技术（一）体外法（一）体外法 1 1淋巴细胞增殖检测淋巴细胞增殖检测3H-3H-胸腺嘧啶核苷参入法（胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR3H-TdR）:间接观间接观察察DNADNA合成含量。灵敏度高，具有放射性。合成含量。灵敏度高，具有放射性。四甲基偶氮唑盐法（四甲基偶氮唑盐法（MTTMTT）:MTT:MTT商品名为噻唑商品名为噻唑蓝。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可蓝。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性将外源性MTTMTT还原成蓝紫色结晶还原成蓝紫色结晶-甲瓒甲瓒（formazanformazan）,DMSO,DMSO使其溶解，酶标分析仪检使其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性差。测。简便，灵敏度高，稳定性差。淋巴细胞的功能测定技术36二甲氧唑黄比色法（二甲氧唑黄比色法（XTT）：）：XTT是一种是一种MTT类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯（PMS）可提高其效率。快速、简便灵敏。）可提高其效率。快速、简便灵敏。XTT水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。免疫学检测技术与应用课件37四唑单钠盐法（四唑单钠盐法（WST-1WST-1）:WAT-1:WAT-1是一种类似于是一种类似于MTTMTT的水溶性四唑盐，在的水溶性四唑盐，在PMSPMS存在下被活细胞脱氢酶还存在下被活细胞脱氢酶还原成橙黄色甲瓒产物，水溶性，直接酶标仪测定。原成橙黄色甲瓒产物，水溶性，直接酶标仪测定。WAT-1WAT-1的水溶液比的水溶液比MTT MTT 和和XTTXTT稳定。结果稳定，灵稳定。结果稳定，灵敏度高。可多次用酶标仪重复检测结果。敏度高。可多次用酶标仪重复检测结果。Cell-Counting Kit-8Cell-Counting Kit-8（CCK-8CCK-8）:CCK-8:CCK-8中含有中含有WST-8WST-8，较，较WST-1WST-1更新的四唑盐，检测原理与更新的四唑盐，检测原理与WST-1WST-1类似。操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更类似。操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更高、灵敏度更高、保存时间更长。高、灵敏度更高、保存时间更长。四唑单钠盐法（WST-1）:WAT-1 是一种类似于MTT的38（放射性核素摄取法）（放射性核素摄取法）（放射性核素摄取法）（放射性核素摄取法）（放射性核素摄取法）392.2.细胞毒试验细胞毒试验(1)NK(1)NK细胞的细胞毒活性测定细胞的细胞毒活性测定 放射性核素释放法放射性核素释放法 放射性核素标记靶细胞放射性核素标记靶细胞(K562(K562细胞细胞)+)+效应细胞效应细胞 培养培养 靶细胞破坏，释放放射性核素靶细胞破坏，释放放射性核素 测测cpmcpm值值 NKNK细胞毒活性细胞毒活性(%)=(%)=100%100%实验孔实验孔cpmcpm值值-自然释放孔自然释放孔cpmcpm值值最大释放孔最大释放孔cpmcpm值值-自然释放孔自然释放孔cpmcpm值值2.细胞毒试验实验孔cpm值-自然释放孔cpm值最大释放孔c40 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LDH)(LDH)释放法释放法 靶细胞靶细胞(YAC-1(YAC-1细胞细胞)+)+效应细胞效应细胞(小鼠脾胞小鼠脾胞)LDHLDH释放释放+LDH+LDH底物底物(氧化型辅酶氧化型辅酶I I、吩嗪二甲酯硫酸、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝盐和硝基氯化四氮唑蓝)形成甲基化合物形成甲基化合物(色色)测定测定OD570OD570值值 NK NK细胞毒活性细胞毒活性(%)=(%)=100%100%实验孔实验孔ODOD值值-自然释放孔自然释放孔ODOD值值最大释放孔最大释放孔ODOD值值-自然释放孔自然释放孔ODOD值值 乳酸脱氢酶(LDH)释放法实验孔OD值-自然释放孔OD值41 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC）Antibody-dependent cell-media42免疫学检测技术与应用课件43Generation of effector CTLsGeneration of effector CTLs44MHC tetramersMHC tetramers45Two pathways of target-cell apoptosis stimulated by CTLsTwo pathways of target-cell ap46 In vitro cell-mediated lympholysis(CML)assay In vitro cell-mediated lympho473.3.酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT)(ELISPOT)抗原包被抗原包被 B B细胞细胞 抗体产生并附着抗体产生并附着 第第二抗体二抗体(酶标记酶标记)底物底物 显色显色 抗体抗体(抗细胞因子抗细胞因子)包被包被 +T+T细胞细胞 产生细产生细胞因子并与抗体结合胞因子并与抗体结合 +第二抗体第二抗体(酶标记酶标记)底底物物 显色显色3.酶联免疫斑点法(ELISPOT)48免疫学检测技术与应用课件49免疫学检测技术与应用课件50免疫学检测技术与应用课件51（二）体内法（二）体内法 抗原定量注入皮内，抗原定量注入皮内，48487272小时后观察结果。小时后观察结果。结果判定：结果判定：阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径0.5cm0.5cm 弱阳性：硬结直径弱阳性：硬结直径0.5cm0.5cm 阴性：无变化阴性：无变化 实际意义：实际意义：阳性阳性 细胞免疫功能正常者细胞免疫功能正常者 弱阳性或阴性弱阳性或阴性 多为细胞免疫功能低下者多为细胞免疫功能低下者 *常用的抗原为结核菌素常用的抗原为结核菌素(OT)(OT)、PHAPHA（二）体内法52皮内注射法皮内注射法皮内注射法皮内注射法皮内注射法53划痕法划痕法划痕法划痕法划痕法54免疫学检测技术与应用课件55细胞因子的检测技术细胞因子的检测技术一、一、生物学检测技术生物学检测技术 依赖细胞株测依赖细胞株测定法定法 二、二、免疫学检测技术免疫学检测技术 ELISA ELISA法法三、分子生物学检测技术三、分子生物学检测技术 分子杂交、分子杂交、PCRPCR 等检测等检测mRNAmRNA 细胞因子的检测技术56细胞因子检测的特点细胞因子检测的特点 样品含量低样品含量低样品具有时效性样品具有时效性生物效应特异性差生物效应特异性差细胞因子检测的特点57Figure 14-12Figure 14-1258免疫学检测技术与应用课件59细胞因子的功能细胞因子的功能 Cell activation Cell activation Cell growth and Cell growth and differentiation differentiation Induction of MHC Induction of MHC Induction of cytokine Induction of cytokine receptors receptors Promotion of antibody Promotion of antibody class-class-switching switching 细胞因子的功能60影响细胞因子作用特异性的因素影响细胞因子作用特异性的因素 Only antigen-activated lymphocytes express Only antigen-activated lymphocytes express receptors receptors Different combinations of receptor subunits Different combinations of receptor subunits result in low-,intermediate-,or high-result in low-,intermediate-,or high-affinity receptors affinity receptors Requirement of cell-cell interaction Requirement of cell-cell interaction Short half-life of cytokines Short half-life of cytokines Cytokine antagonists Cytokine antagonists Synergistic and antagonistic interactions Synergistic and antagonistic interactions among cytokines among cytokines 影响细胞因子作用特异性的因素61限制细胞因子临床应用的因素限制细胞因子临床应用的因素High local concentrations of cytokines during High local concentrations of cytokines during immune response cannot be mimicked clinically immune response cannot be mimicked clinically Short half-life of cytokines Short half-life of cytokines Pleiotropic effects can cause unpredictable Pleiotropic effects can cause unpredictable side-effectsside-effects限制细胞因子临床应用的因素62细胞因子的生物学检测细胞因子的生物学检测检测方法与原理检测方法与原理 细胞增殖或增殖抑制试验细胞增殖或增殖抑制试验 细胞病变抑制试验细胞病变抑制试验 细胞毒试验细胞毒试验 细胞趋化试验细胞趋化试验细胞因子的生物学检测63 检测中的操作注意要点检测中的操作注意要点 靶细胞的选择与培养靶细胞的选择与培养 检测标本的制备检测标本的制备 显示检测结果显示检测结果2024/6/23 检测中的操作注意要点2023/8/1064靶细胞的选择与培养靶细胞的选择与培养 1 1、对所测的细胞因子有特异的、对所测的细胞因子有特异的敏感性敏感性 2 2、易培养、保存、生物学特性、易培养、保存、生物学特性稳定稳定 3 3、有良好的生长状态、有良好的生长状态 4 4、种属适配、种属适配 2024/6/23靶细胞的选择与培养2023/8/1065 各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子 实验系统 干扰因素 IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法 IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4 IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPO IL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2 IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4 各类细胞因子检测的常用靶细胞66各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子细胞因子 实验系统实验系统 干扰因素干扰因素 IL-6 B9 IL-6 B9（M M）增殖法）增殖法 IL-4IL-4、IL-11IL-11 BM60 BM60（H H）增殖法）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b IL-7 Clone-IXN/2b（M M）增殖）增殖法法 IL-8 IL-8 中性粒细胞（中性粒细胞（M M、H H）趋化）趋化法法 GM-CSF TF-1 GM-CSF TF-1（H H）增殖法）增殖法 IL-3IL-3、IL-5IL-5 IL-6IL-6、IL-5IL-5 TNF TNF/L929 L929（M M、H H）细胞毒法）细胞毒法 IFN IFN wish wish（H H）病变保护法）病变保护法 IFN-IFN-IFN-IFN-L929 L929（M M）病变保护）病变保护法法 IFN-IFN-IFN-IFN-各类细胞因子检测的常用靶细胞67检测标本的准备检测标本的准备 1 1、分离特定的产生细、分离特定的产生细胞胞 2 2、对产生细胞进行诱、对产生细胞进行诱导、激活导、激活 3 3、选择适当的收集时、选择适当的收集时间间2024/6/23检测标本的准备2023/8/1068显示检测结果显示检测结果 1 1、细胞增殖状态的显示：、细胞增殖状态的显示：放射性核素掺入法、放射性核素掺入法、胞内酶活性显示法胞内酶活性显示法 活细胞染色法活细胞染色法 细胞荧光测定法细胞荧光测定法 2 2、细胞毒或细胞病变状态的显示、细胞毒或细胞病变状态的显示 活细胞染色法活细胞染色法 胞内酶活性显示法胞内酶活性显示法 DNA DNA断片测定法断片测定法2024/6/23显示检测结果2023/8/1069 依赖细胞株测定法依赖细胞株测定法PBMC+PHA PBMC+PHA 培养培养 取上清液取上清液+CTLL-2+CTLL-2细胞细胞 培养培养 +MTT +MTT 培养培养 测测OD570OD570值值 免疫学检测技术与应用课件70TNFTNF对靶细胞的细胞毒活性对靶细胞的细胞毒活性 TNF TNF对小鼠对小鼠L929L929成纤维细胞株具有细胞毒活性，成纤维细胞株具有细胞毒活性，细胞死亡率与细胞死亡率与TNFTNF生物学活性成正相关关系。生物学活性成正相关关系。结晶紫染色死细胞结晶紫染色死细胞 MTT MTT检测活细胞检测活细胞 如同时加用转录抑制剂放线菌素如同时加用转录抑制剂放线菌素D D，可提高靶，可提高靶细胞对细胞对TNFTNF的敏感性的敏感性10-10010-100倍。倍。TNF对靶细胞的细胞毒活性71 滤膜：计数受趋化细胞滤膜：计数受趋化细胞趋化因子趋化因子细胞细胞趋化试验原理示意趋化试验原理示意滤膜：计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化试验原理示意72 细胞因子的免疫学检测细胞因子的免疫学检测 分泌型细胞因子的检测分泌型细胞因子的检测 ELISA ELISA ELISPOT ELISPOT RT-PCR RT-PCR（分子（分子生物学）生物学）细胞内细胞因子的检测细胞内细胞因子的检测 免疫组化技术免疫组化技术 细胞因子的免疫学检测73细胞因子受体的存在细胞因子受体的存在 形式形式 膜型细胞因子受体膜型细胞因子受体 分泌型细胞因子受体分泌型细胞因子受体2024/6/23细胞因子受体的存在 形式2023/8/1074细胞因子受体的检测方法细胞因子受体的检测方法 膜型细胞因子受体的检测：膜型细胞因子受体的检测：配体检测法配体检测法 抗体检测法抗体检测法 分泌型细胞因子受体的检测：分泌型细胞因子受体的检测：标记抗体检测法标记抗体检测法2024/6/23细胞因子受体的检测方法2023/8/1075 细胞因子检测临床意义细胞因子检测临床意义细胞因子细胞因子 正常对照正常对照 病人病人 疾病疾病 年代年代及受体及受体 （pg/mlpg/ml）（pg/mlpg/ml）IL-1 IL-1 0.160.17 0.530.57 0.160.17 0.530.57 肾细胞癌肾细胞癌 2003 2003 0.3 0.3 18.8 18.8 心绞痛心绞痛 19961996 166.7 166.7 38.528.8 38.528.8 胰腺炎胰腺炎 19941994 IL-2 2.40.8 10.81.8 IL-2 2.40.8 10.81.8 急性缺血性综合征急性缺血性综合征 1999 1999 IL-4 3.340.84 4.051.02 IL-4 3.340.84 4.051.02 支气管高反应性支气管高反应性 2003 2003 IL-6 54.1 485.2 IL-6 54.1 485.2 疟疾疟疾 2004 2004 1.792.03 1.792.03 8.9113.12 8.9113.12 肾细胞癌肾细胞癌 20022002 42 42 1620 1620 败血症败血症 20012001 2.10.1 2.10.1 101.6 101.6 风湿风湿 20002000 2.55 2.55 4.29 4.29 非酒精性脂非酒精性脂肪肝肪肝 2003 2003 1.10.1 1.10.1 18.62.1 18.62.1 原发性甲状旁原发性甲状旁腺功腺功 1996 1996 能亢进症能亢进症 4.340.9 4.340.9 97.30.97 97.30.97 宫外孕宫外孕 19961996 12.30.8 12.30.8 9412.1 9412.1 类风湿关节炎类风湿关节炎 19991999 0.39 16 0.39 16 关节炎关节炎 2004 2004 1.20.6 1.20.6 10.81.8 10.81.8 急性缺血性综急性缺血性综合征合征 1999 1999IL-6IL-6受体受体 25.11(ng/ml)41.71.2(ng/ml)25.11(ng/ml)41.71.2(ng/ml)原发性甲状旁腺功能原发性甲状旁腺功能 1996 1996（可溶性）（可溶性）亢进症亢进症 细胞因76 续续表表细细胞因子胞因子 正常正常对对照照 病人病人 疾病疾病 年代年代及受体及受体 （pg/mlpg/ml）（pg/mlpg/ml）IL-8 63 331 IL-8 63 331 败败血症血症 2001 2001 3.8 43.68 3.8 43.68 非酒精性脂肪肝非酒精性脂肪肝 2003 2003 16.3 1078181.5 16.3 1078181.5 泌尿道感染泌尿道感染 1993 1993 1 17.6 1 17.6 肝癌肝癌 2003 2003 4.80.5 27.52.6 4.80.5 27.52.6 轻轻度子度子宫宫内膜异位症内膜异位症 2003 2003 530.265.1 530.265.1 重度子重度子宫宫内膜异位症内膜异位症IL-10 14.1 1099.3 IL-10 14.1 1099.3 严严重重疟疟疾疾 2004 2004 9.21.5 17.74.4 9.21.5 17.74.4 非小非小细细胞肺癌胞肺癌 2002 2002 214.2 214.2 转转移癌移癌IL-13 35.2012.70 92.699.87 IL-13 35.2012.70 92.699.87 系系统统性性红红斑狼斑狼疮疮 2005 2005IL-15 16.24 356 IL-15 16.24 356 腹膜炎腹膜炎 2000 2000IL-16 16323 28746 IL-16 16323 28746 轻轻度子度子痫痫 2008 2008 （正常妊娠）（正常妊娠）51558 51558 严严重子重子痫痫IL-18 2811 5121 IL-18 2811 5121 充血性心力衰竭充血性心力衰竭 2000 2000IL-21 46690(ng/ml)1051335(ng/ml)IL-21 46690(ng/ml)1051335(ng/ml)原原发发性干燥性干燥综综合合征征 2007 20072024/6/23 77免疫学检测技术与应用课件78细胞内细胞因子的测定技术（细胞内细胞因子的测定技术（ICSICS）激活细胞：多克隆激活剂，如佛波酯（激活细胞：多克隆激活剂，如佛波酯（PMAPMA）和离子霉素（和离子霉素（ionomycinionomycin）等或特定的抗原；）等或特定的抗原；抑制细胞因子释放：阻断胞内高尔基体介导抑制细胞因子释放：阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，用布雷菲德菌素的蛋白质转运，用布雷菲德菌素A A（Brefeldin,Brefeldin,BFABFA）与莫能霉素（）与莫能霉素（MonensinMonensin）等药物；）等药物；增加细胞膜通透性：多聚甲醛固定和皂角苷增加细胞膜通透性：多聚甲醛固定和皂角苷破膜；破膜；荧光标记的抗细胞因子的特异抗体与细胞内荧光标记的抗细胞因子的特异抗体与细胞内细胞因子结合，通过流式细胞术（细胞因子结合，通过流式细胞术（flow flow cytometry,FCMcytometry,FCM）进行检测。）进行检测。细胞内细胞因子的测定技术（ICS）79Principle of Plate-Based ICS AssaysAntigenic stimulus+brefeldin AIncubate 6-24 h Fix cells Permeabilize Stain20 ml PBMC/WB sampleGate on cellsof interestPrinciple of Plate-Based ICS A80ICS 应用应用Measure production of cytokines in short-term stimulated whole blood,PBMC,etc.Can measure multiple cell-surface and intracellular markers in combination,using multiparameter flow cytometryCan detect rare events such as antigen-specific T cellsICS 应用Measure production of cy81Example of ICS Resultspp65 proteinpeptide mixA2 peptideCMV lysateCD8CD4anti-IFNg FITCCD69 PEExample of ICS Resultspp65 pro82CFSE AssaysCells(usually PBMC)are labeled with CFSE dye,then allowed to proliferate in vitro(or in vivo in mice)CFSE is divided equally among daughter cells,so each generation becomes half as intense in CFSE stainingCFSE AssaysCells(usually PBMC83免疫分子生物学技术免疫分子生物学技术1.1.免疫印迹试验免疫印迹试验(immunoblotting,Western(immunoblotting,Western blotting)blotting)(1)(1)电泳：抗原电泳：抗原(如蛋白质如蛋白质)在在SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶内聚丙烯酰胺凝胶内电泳，各组分按分子量大小分开。电泳，各组分按分子量大小分开。(2)(2)转印：将电泳后的蛋白质转移至硝基纤维膜上。转印：将电泳后的蛋白质转移至硝基纤维膜上。(3)(3)鉴定：用酶标记或同位素标记的抗体确定抗原的鉴定：用酶标记或同位素标记的抗体确定抗原的位置，并可得知其分子量的范围。位置，并可得知其分子量的范围。免疫分子生物学技术84免疫学检测技术与应用课件852.2.免疫免疫PCR(immuno-polymerase chain PCR(immuno-polymerase chain reaction)reaction)原理：原理：抗原包被抗原包被 +抗体抗体 +亲和素亲和素-SPA-SPA融融合蛋白合蛋白 +生物素生物素-DNA-DNA片段片段 PCR PCR扩增扩增 测定扩增产物测定扩增产物应用：应用：同一样品中多种抗原的分析与鉴定。同一样品中多种抗原的分析与鉴定。2.免疫PCR(immuno-polymerase cha86免疫学检测技术与应用课件87Thanks!Thanks!88