免疫印迹法的实验技术培训ppt课件

LOGO免疫印迹法的免疫印迹法的实验实验技技术术免疫印迹法的实验技术1 一、Western-Blot简介vWestern Blot，又称为免疫印迹又称为免疫印迹（Immunoblot）,是是70年代末年代末80年代初发年代初发展起来的蛋白质测定技术。展起来的蛋白质测定技术。v蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治学的乔治斯塔克（斯塔克（George Stark）。在尼）。在尼尔尔伯奈特（伯奈特（Neal Burnette）于）于1981年年所著的分析生物化学（所著的分析生物化学（Analytical Biochemistry）中首次被称为）中首次被称为Western Blot。免疫印迹法的实验技术2 一、Western-Blot简介Western Blot，v印迹法（印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。方法。vWestern Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合液印迹方法，是检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的体中某种特定目的蛋白的定性方法定性方法，也可作为确，也可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的条件下的相对含量的半定量方法。相对含量的半定量方法。免疫印迹法的实验技术3免疫印迹法的实验技术3v实验主要内容：实验用途实验用途2实验注意事项实验注意事项 4实验方法及步骤实验方法及步骤3 3 实验原理实验原理3 1免疫印迹法的实验技术4实验主要内容：实验用途2实验注意事项 4实验方法及步骤33 实验原理实验原理v 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物（硝酸纤维素膜或PVDF 膜）上 用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合 用ECL发光或DAB显色检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄色条带蛋白条带。免疫印迹法的实验技术5实验原理 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶【SvWestern Blot采用的是聚丙采用的是聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳，泳，被被检测检测物是蛋白物是蛋白质质，“探探针针”是抗体，是抗体，“显显色色”用用标标记记的二抗。的二抗。经过经过PAGE分离的蛋白分离的蛋白质样质样品，品，转转移移到固相到固相载载体（例如硝酸体（例如硝酸纤维纤维素薄膜）上，固相素薄膜）上，固相载载体以非共价体以非共价键键形式吸附蛋白形式吸附蛋白质质，且能保持，且能保持电电泳分泳分离的多离的多肽类肽类型及其生物学活性不型及其生物学活性不变变。以固相。以固相载载体体上的蛋白上的蛋白质质或多或多肽肽作作为为抗原，与抗原，与对应对应的抗体起免的抗体起免疫反疫反应应，再与，再与酶酶或同位素或同位素标记标记的第二抗体起反的第二抗体起反应应，经过经过底物底物显显色或放射自色或放射自显显影以影以检测电检测电泳分离的特泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。异性目的基因表达的蛋白成分。该该技技术术也广泛也广泛应应用于用于检测检测蛋白水平的表达。蛋白水平的表达。免疫印迹法的实验技术6Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物实验用途v用于检测样品中特异性蛋白质是否存蛋白质是否存在。在。v对特异性蛋白质进行半定量半定量分析。免疫印迹法的实验技术7实验用途免疫印迹法的实验技术7蛋白免疫印迹组成凝胶电泳凝胶电泳1SDS-聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳，使泳，使待待测样测样品中的蛋品中的蛋白白质质按分子量大按分子量大小在凝胶中分成小在凝胶中分成带带2把凝胶中已分成把凝胶中已分成条带的蛋白质转条带的蛋白质转移到一种固相支移到一种固相支持物上持物上样品的印迹样品的印迹3用特异性的抗体用特异性的抗体检测出已经印迹检测出已经印迹在膜上的所要研在膜上的所要研究的相应抗原究的相应抗原免疫学检测免疫印迹法的实验技术8蛋白免疫印迹组成凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待实验步骤v 提取提取细细胞或胞或组织组织蛋白蛋白测测定蛋白定蛋白含量含量制制备备SDS-PAGE胶胶蛋白蛋白变性、上样变性、上样电泳电泳 转膜转膜封闭封闭一抗一抗TBST洗膜洗膜HRP标记标记的二抗的二抗TBST洗膜洗膜ECL底物显底物显色色X光片曝光、显色光片曝光、显色结果分析结果分析免疫印迹法的实验技术9实验步骤 提取细胞或组织蛋白测定蛋白含量制备SDS-PA免疫印迹法的实验技术10免疫印迹法的实验技术10二、蛋白样本的制备和浓度的测定二、蛋白样本的制备和浓度的测定v蛋白的提取：一般包括蛋白的提取：一般包括组织组织蛋白提取、蛋白提取、细细胞蛋白胞蛋白的提取的提取 组织组织蛋白提取蛋白提取v组织组织和裂解液（和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，加入蛋白酶抑制剂，为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例配制）按比例配制-置于玻璃置于玻璃匀匀浆浆器中，充分研磨（冰上操作）器中，充分研磨（冰上操作）4离心，离心，12000rpm，10min取上清分装取上清分装1.5ml离心管离心管中中20保存。保存。（低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解。）v 蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根据具体情况具体选择。免疫印迹法的实验技术11二、蛋白样本的制备和浓度的测定蛋白的提取：一般包括组织蛋白注意事项注意事项 v注意个人防护。注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即，立即用大量水冲洗。用大量水冲洗。v所用离心机需提前预冷。所用离心机需提前预冷。v为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。v吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。免疫印迹法的实验技术12注意事项免疫印迹法的实验技术12蛋白浓度的测定蛋白浓度的测定原因：原因：vWestern Blot作为一项半定量实验技术，作为一项半定量实验技术，电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含量测定。量测定。v蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至甚至会影响此电泳方法的分辨力。会影响此电泳方法的分辨力。免疫印迹法的实验技术13蛋白浓度的测定原因：免疫印迹法的实验技术13方法：方法：v目前常用的有五种目前常用的有五种经经典的方法，即定氮法、双典的方法，即定氮法、双缩缩脲脲法（法（Biuret法）、法）、Folin酚酚试剂试剂法（法（Lowry法）、紫外吸收法以及考法）、紫外吸收法以及考马马斯亮斯亮蓝蓝法法Bradford法）。法）。v目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如BCA法试法试剂盒剂盒.免疫印迹法的实验技术14方法：免疫印迹法的实验技术14BCA法工作原理vBCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白质的原理与Lowery法相似。即在碱性在碱性环境下蛋白境下蛋白质分子中分子中肽键结构与构与Cu2+络合并将合并将Cu2+还原原成成Cu1+。BCA特异地与特异地与Cu1+结合形成合形成稳定的定的紫紫蓝色复合物，在色复合物，在562 nM处有最大光吸收有最大光吸收值并并与蛋白与蛋白质浓度成正比，度成正比，颜色的深浅与蛋白色的深浅与蛋白质的含的含量成正比，可以根据吸收量成正比，可以根据吸收值测定蛋白定蛋白质浓度。度。该测定方法灵敏度高，操作定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的及其形成的颜色复合物色复合物稳定性俱佳，并且受干定性俱佳，并且受干扰物物质去垢去垢剂等影响小。等影响小。免疫印迹法的实验技术15BCA法工作原理BCA(bicinchoninic acidSDS-PAGE电泳SDS-PAGE电电泳法，即十二泳法，即十二烷烷基硫酸基硫酸钠钠聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳法。泳法。原理原理v1在蛋白在蛋白质质混合混合样样品中各蛋白品中各蛋白质组质组分的迁移率主要取决分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所于分子大小和形状以及所带电带电荷多少。荷多少。v2在聚丙在聚丙烯酰烯酰胺凝胶系胺凝胶系统统中，加入一定量的十二中，加入一定量的十二烷烷基硫基硫酸酸钠钠（SDS），），SDS是一种阴离子表面活性是一种阴离子表面活性剂剂，能使蛋，能使蛋白白质质的的氢键氢键和疏水和疏水键键打开，并打开，并结结合到蛋白合到蛋白质质分子上分子上，在一在一定条件下，大多数蛋白定条件下，大多数蛋白质质与与SDS的的结结合合（1.4gSDS/1g蛋白蛋白质质），使各种蛋白），使各种蛋白质质SDS复合物都复合物都带带上相同密度的上相同密度的负电负电荷，其数量荷，其数量远远远远超超过过了蛋白了蛋白质质分子原有的分子原有的电电荷量，从荷量，从而掩盖了不同种而掩盖了不同种类类蛋白蛋白质间质间原有的原有的电电荷差荷差别别。此。此时时，蛋白，蛋白质质分子的分子的电电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素因素对电对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不泳迁移率的影响几乎可以忽略不计计。免疫印迹法的实验技术16SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠免疫印迹法的实验技术17免疫印迹法的实验技术17实验前的准备实验前的准备设备和材料的准备设备和材料的准备:v电泳槽的准备电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽本实验用垂直电泳槽)、电泳仪的、电泳仪的准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、烧杯、量筒烧杯、量筒试剂的准备和配置试剂的准备和配置:v双蒸水、双蒸水、30%丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为为8.8)、Tris-HCl(PH为为6.8)、10%SDS、10%过硫过硫酸铵酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲液、电泳缓、电泳上样缓冲液、电泳缓冲液、蛋白冲液、蛋白Marker免疫印迹法的实验技术18实验前的准备设备和材料的准备:免疫印迹法的实验技术18v根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度.（一般浓缩胶为（一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定），分离胶根据所测蛋白分子量定）凝胶浓度（）凝胶浓度（）线性分离范围（线性分离范围（KD)KD)151512-4312-43101016-6816-687.57.536-9436-945.05.057-21257-212免疫印迹法的实验技术19根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度.（一般浓作用作用v浓缩浓缩胶：当胶：当样样品上品上样样并接通两极并接通两极间电间电流后流后(电电泳槽泳槽的上方的上方为负为负极，下方极，下方为为正极正极)，在凝胶中形成移，在凝胶中形成移动动界面并界面并带动带动凝胶中所含凝胶中所含SDS负电负电荷的多荷的多肽肽复合物复合物向正极推向正极推进进。样样品首先通品首先通过过高度多孔性的高度多孔性的浓缩浓缩胶，胶，使使样样品中所含品中所含SDS 多多肽肽复合物在分离胶表面聚集复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区成一条很薄的区带带（或称（或称积层积层）（0.5-1cm）。v分离胶：由于胶孔径小，而且成分离胶：由于胶孔径小，而且成为为一个整体的一个整体的筛筛状状结结构，它构，它们对们对大分子阻力大，小分子阻力小，大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子起着分子筛筛效效应应，也就是蛋白，也就是蛋白质质在分离胶中，以在分离胶中，以分子分子筛筛效效应应和和电电荷效荷效应应而出而出现现迁移率的差异，最迁移率的差异，最终终达到彼此分开。达到彼此分开。(PH为为8.8)免疫印迹法的实验技术20作用浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极实验步骤实验步骤 组组装装SDS-PAGE凝胶用玻璃槽凝胶用玻璃槽 配制和灌注分离胶配制和灌注分离胶 用水用水压线压线30-40分分钟钟直至分离胶凝固直至分离胶凝固 倒掉倒掉压线压线水配制和灌注水配制和灌注浓缩浓缩胶胶 插入插入样样品梳品梳 凝胶直至凝胶直至浓缩浓缩胶凝固胶凝固 制备样品制备样品样样品品:上上样缓样缓冲液冲液=4:1,混匀混匀1000C加加热热5分分钟钟,离心取上清离心取上清)拔出拔出样样品梳品梳 加入加入电电泳泳缓缓冲液冲液,上上样样，电电泳泳 电电泳至溴酚泳至溴酚兰兰行至行至电电泳槽下端停止泳槽下端停止夹心式垂直电泳槽夹心式垂直电泳槽免疫印迹法的实验技术21实验步骤 组装SDS-PAGE凝胶用玻璃槽夹心式垂直电泳槽蛋白变性的原因蛋白变性的原因v上上样样蛋白蛋白为为蛋白蛋白样样本和上本和上样缓样缓冲液的混合冲液的混合物，按比例配制，物，按比例配制，100煮煮5min。v其目的是将其目的是将SDS 与蛋白与蛋白质质充分充分结结合，以使合，以使蛋白蛋白质质完全完全变变性和解聚，并形成棒状性和解聚，并形成棒状结结构构同同时时使整个蛋白使整个蛋白带带上上负电负电荷荷。免疫印迹法的实验技术22免疫印迹法的实验技术22注意事项注意事项注意事项注意事项v玻璃板要清玻璃板要清洁洁,对齐对齐卡卡严严，防止漏胶。，防止漏胶。v丙丙烯酰烯酰胺和双丙胺和双丙烯酰烯酰胺在聚合前具有很胺在聚合前具有很强强的神的神经经毒性并容毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累易吸附于皮肤，其作用具有累积积性，故称量或配胶性，故称量或配胶时应时应戴戴手套及口罩手套及口罩.v过过硫酸硫酸铵铵会会缓缓慢分解，慢分解，应应隔周新隔周新鲜鲜配制配制.v溶液中一旦加入溶液中一旦加入TEMED，应应立即混匀并快速灌注入玻璃立即混匀并快速灌注入玻璃夹夹槽中槽中.v浓缩浓缩胶胶缓缓冲液冲液(PH为为6.8)、分离胶、分离胶缓缓冲液冲液(PH8.8)，PH值值要准确。要准确。v胶灌入前要充分混匀，灌胶要胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓缓慢慢,避免有气泡的避免有气泡的产产生生.v为为保持保持电电泳的平衡，在无泳的平衡，在无样样品孔中也品孔中也应应加入适量的加入适量的电电泳上泳上样缓样缓冲液冲液.v正确正确连连接接电电泳泳连线连线（负负极在上，正极在下）以保极在上，正极在下）以保证证蛋白由蛋白由上向下方向上向下方向电电泳泳。免疫印迹法的实验技术23注意事项玻璃板要清洁,对齐卡严，防止漏胶。免疫印迹法的实验技说明：说明：v不是所有的蛋白质都能用不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是影响，它的分子量是21,000，但，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。相验证。v有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。凝胶电泳的结果互相参照。免疫印迹法的实验技术24说明：免疫印迹法的实验技术24四、四、转转 膜膜v蛋白质印迹法就是将电泳后分离的蛋白质从凝胶蛋白质印迹法就是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相支持物上。中转移到固相支持物上。v常用的固相支持物有常用的固相支持物有NC（硝酸纤维素）膜、尼（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。（聚偏氟乙烯）膜。vPVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性，价附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性，价格比格比NC膜要贵。膜要贵。NC膜更常用。膜更常用。免疫印迹法的实验技术25四、转 膜蛋白质印迹法就是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移附：附：膜的选择主要根据：膜的选择主要根据：v膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的膜能结合蛋白 的载量）的载量）v膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）有两种规格：膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）有两种规格：0.45um和和0.2um（for MW20kDa)。v不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法）色方法）免疫印迹法的实验技术26附：免疫印迹法的实验技术26v转膜转膜通常有两种方法：毛通常有两种方法：毛细细管印迹法和管印迹法和电电泳印迹法。泳印迹法。电电泳印迹效率更高。泳印迹效率更高。这这种种方法是用有孔的塑料和有方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸机玻璃板将凝胶和硝酸纤纤维维素膜素膜夹夹成成三明治三明治形状，形状，而后浸入两个平行而后浸入两个平行电电极中极中间间的的缓缓冲液中冲液中进进行行电电泳，泳，选择选择适当的适当的电电泳方向就可泳方向就可以使蛋白以使蛋白质质离开凝胶离开凝胶结结合合在膜上。在膜上。转转移后的膜就称移后的膜就称为为一个印（一个印（blot），用于），用于对对蛋白蛋白质质的的进进一步一步检测检测。免疫印迹法的实验技术27转膜通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。电泳印迹效率更实验前的准备实验前的准备v设备设备和材料的准和材料的准备备:转转移移电电泳槽的准泳槽的准备备(本本实验实验用垂直用垂直电电泳泳槽槽)、转转移移电电泳泳仪仪的准的准备备、膜、膜、滤纸滤纸、海、海绵绵垫垫、玻璃棒、玻璃棒v试剂试剂的准的准备备和配置和配置:电转电转液、甲醇（液、甲醇（PVDF膜）、（考膜）、（考马马斯亮斯亮蓝蓝染色液、染色液、丽丽春春红红染色染色液）液）免疫印迹法的实验技术28实验前的准备设备和材料的准备:免疫印迹法的实验技术28v根据待根据待测样测样品的蛋白品的蛋白质质分子量分子量选择转选择转移的移的电电流大流大小及小及时间时间.我我们们通常通常 200mA/膜，按照目的膜，按照目的蛋白蛋白分子大小、胶分子大小、胶浓浓度度选择转选择转移移时间时间，具体可以根据，具体可以根据实际实际适当适当调调整。整。目的蛋白分子大小目的蛋白分子大小(kDa)胶胶浓浓度度 转转移移时间时间(h)80-140 8%1.5-2.0 25-80 10%1.5 1540 12%0.75 20 15%0.5免疫印迹法的实验技术29根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大小及时间.我们通常实验步骤实验步骤vNC膜预处理：（剪裁与胶大小一致的膜预处理：（剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入膜，将其浸入1转移缓冲液平衡转移缓冲液平衡5分钟以上。注意：必须保证分钟以上。注意：必须保证NC膜始膜始终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，避免手上蛋终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，避免手上蛋白将膜污染。）白将膜污染。）v剪裁剪裁6层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同时时4层海绵垫也用转移液浸泡。层海绵垫也用转移液浸泡。v取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转移液中。移液中。v转膜转膜v 制作制作“三明治三明治”：由夹子的黑板（阴极）侧开始，依：由夹子的黑板（阴极）侧开始，依次为黑板次为黑板海绵垫片海绵垫片3层滤纸层滤纸胶胶NC膜膜三层滤纸三层滤纸（注意：排除气泡）（注意：排除气泡）海绵垫片海绵垫片(阳极阳极)，扣紧转膜夹板，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。图）。免疫印迹法的实验技术30实验步骤NC膜预处理：（剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1免疫印迹法的实验技术31免疫印迹法的实验技术31v 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作宜在宜在4进行）。进行）。v小心取出转移膜，做好标记，在小心取出转移膜，做好标记，在1TBST液中液中漂洗两次。漂洗两次。v（用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白（用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全转移是否完全,用丽春红染色液膜用丽春红染色液膜,检测蛋白质是检测蛋白质是否转移到膜上否转移到膜上.）免疫印迹法的实验技术32 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源免疫印迹法的实验技术培训ppt课件33实验注意事项实验注意事项vPVDF膜需膜需100%甲醇甲醇预处预处理，再用理，再用缓缓冲液平衡，冲液平衡，才能用才能用。v必必须须保保证证NC膜始膜始终终完全浸于完全浸于转转移移缓缓冲液中冲液中,滤纸滤纸要充分浸于要充分浸于转转移移缓缓冲液中冲液中.v操作要操作要轻轻，避免胶膜的破，避免胶膜的破损损。v记记住住“黑面胶，白面膜黑面胶，白面膜”，夹夹子的黑面朝架子的黑子的黑面朝架子的黑面面。v必必须须保保证证“三明治三明治”各各层层之之间间均无气泡均无气泡。v电转电转移移时时最好最好为为恒流恒流,电转电转移的移的时间时间和和电电流大小取流大小取决于凝胶的厚度和蛋白决于凝胶的厚度和蛋白质质分子量的大小分子量的大小.分子量大分子量大,电电流稍大流稍大时间长时间长;分子量大分子量大,电电流小流小时间时间短短;v注意做好膜上的注意做好膜上的标记标记。免疫印迹法的实验技术34实验注意事项PVDF膜需100%甲醇预处理，再用缓冲液平衡五、固相免疫检测五、固相免疫检测v转移结束后，借助抗原抗体反应，利用转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。免疫印迹法的实验技术35五、固相免疫检测转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增vDAB显色原理：DAB在在HRP作用下形成红褐色作用下形成红褐色不溶产物不溶产物，从而指示目的蛋白位置及强弱。，从而指示目的蛋白位置及强弱。vECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上利用二抗上标记的辣根过氧化物酶标记的辣根过氧化物酶(HRP)，使底物发生氧化，使底物发生氧化还原反应，从而发出荧光。还原反应，从而发出荧光。vECL发光相对于发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，显色而言，具有发光持久，灵敏度高灵敏度高(一般可达到一般可达到pg级以上级以上)等优点，且等优点，且DAB具有致癌性。具有致癌性。免疫印迹法的实验技术36DAB显色原理：DAB在HRP作用下形成红褐色不溶产物，从v ECL结果结果 DAB结果结果 免疫印迹法的实验技术37 ECL结果 实验前的准备实验前的准备实验前的准备实验前的准备 1.设备设备和材料的准和材料的准备备:v 洗膜用平皿洗膜用平皿v 摇摇床床v ECL发发光所需光所需(避光盒、避光盒、X-光片、光片、X-光片曝光盒等光片曝光盒等)2.试剂试剂的准的准备备和配置和配置:v 封封闭闭液液(5%脱脂奶粉、脱脂奶粉、BSA、WesternBlot 膜封膜封闭闭液）液）v 一抗一抗v 二抗二抗v 抗体稀抗体稀释释液液 v TBST缓缓冲液冲液v ECL试剂试剂盒或盒或DAB试剂试剂盒盒免疫印迹法的实验技术38实验前的准备 1.设备和材料的准备:免疫印迹法的实验技术实验步骤实验步骤v1、封封闭闭：将：将转转移后的膜浸入封移后的膜浸入封闭闭液中，室温、液中，室温、摇摇床上床上缓缓慢慢摇动摇动封封闭闭1h（或（或4过过夜）；（封夜）；（封闭闭硝酸硝酸纤维纤维素膜上剩余的疏水素膜上剩余的疏水结结合位点，使合位点，使抗体只能跟特异的蛋白抗体只能跟特异的蛋白结结合）合）v2.一抗反一抗反应应 将一抗用抗体稀将一抗用抗体稀释释液稀液稀释释到所需到所需浓浓度；度；将封将封闭闭后的膜放入一抗工作液中，后的膜放入一抗工作液中，4反反应过应过夜夜(或或37,2小小时时)。v3.洗膜洗膜 将膜从一抗中取出，将膜从一抗中取出，TBST洗洗涤涤10min3，室温下，室温下缓缓慢慢摇动摇动洗洗涤涤。v4.二抗反二抗反应应 将二抗用抗体稀将二抗用抗体稀释释液稀液稀释释到所需到所需浓浓度度。将膜放入二抗工作液中室温将膜放入二抗工作液中室温30min。v5.洗膜洗膜 TBST洗洗涤涤10min3，室温下，室温下缓缓慢慢摇动摇动洗洗涤涤v6.曝光及洗片（或曝光及洗片（或DAB显显色）色）免疫印迹法的实验技术39实验步骤1、封闭：将转移后的膜浸入封闭液中，室温、摇床上缓曝光及洗片方法曝光及洗片方法v按按1:1（v/v）混合）混合ECL试剂盒中两种液体。试剂盒中两种液体。v将上述混合液均匀铺在将上述混合液均匀铺在NC膜表面，室温作用膜表面，室温作用2分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC膜（避免膜（避免在膜的上面出现气泡）。在膜的上面出现气泡）。v在暗室中（红光下）将在暗室中（红光下）将X光胶片直接压于包裹光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。v将曝光后将曝光后X光片放入显影液中显影、清水中漂光片放入显影液中显影、清水中漂洗、定影液中定影洗、定影液中定影1分钟（具体曝光时间及显影分钟（具体曝光时间及显影时间需根据显影结果作出调整）时间需根据显影结果作出调整）免疫印迹法的实验技术40曝光及洗片方法免疫印迹法的实验技术40实验注意事项实验注意事项1.处处理膜的理膜的过过程中，切勿使膜干掉程中，切勿使膜干掉（否（否则导则导致背景致背景增高）增高）2.选择选择合适的一抗及二抗合适的一抗及二抗浓浓度（度（浓浓度高不一定效果度高不一定效果好，好，过过高会高会导导致背景致背景变变黑）黑）3.应应考考虑虑试剂试剂的的发发光光强强度及其度及其淬灭淬灭时间时间来来选选择择合适的曝光合适的曝光时间时间。4.保鲜膜包裹保鲜膜包裹NC膜时，避免膜上有气泡，影响显膜时，避免膜上有气泡，影响显影。影。5、显影、定影要充分，、显影、定影要充分，X平要完全浸没在液面下。平要完全浸没在液面下。免疫印迹法的实验技术41实验注意事项1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉（否则导致背Western Blot常见问题分析常见问题分析vSDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 u胶不平？胶不平？胶不平？胶不平？u凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入加入加入APSAPSAPSAPS和和和和TEMEDTEMEDTEMEDTEMED的量要合适的量要合适的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀聚合不均匀聚合不均匀聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐，支架，支架，支架，支架要上紧，胶垫老化失去弹性要上紧，胶垫老化失去弹性要上紧，胶垫老化失去弹性要上紧，胶垫老化失去弹性免疫印迹法的实验技术42Western Blot常见问题分析SDS-PAGE电泳胶 uu条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？条带比正常的窄？uu“微笑微笑微笑微笑”或或或或“倒微倒微倒微倒微笑笑笑笑”条带？条带？条带？条带？uu斜坡型条带？斜坡型条带？斜坡型条带？斜坡型条带？uu条带发散不压线？条带发散不压线？条带发散不压线？条带发散不压线？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适合适合适合适，两两两两边边边边聚合不完全。聚合不完全。聚合不完全。聚合不完全。凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。电泳液过少，气泡进入上样孔，电阻电泳液过少，气泡进入上样孔，电阻电泳液过少，气泡进入上样孔，电阻电泳液过少，气泡进入上样孔，电阻过大过大过大过大 PHPH值不对，电泳液缓冲作用降低值不对，电泳液缓冲作用降低值不对，电泳液缓冲作用降低值不对，电泳液缓冲作用降低免疫印迹法的实验技术43 条带比正vv转膜及抗体检测转膜及抗体检测 uu凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？凝胶肿胀或卷曲？uu条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？条带歪斜或漂移？uu单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？单个或多个白点？uu转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡中浸泡中浸泡中浸泡5-10min5-10min5-10min5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“三三三三明治明治明治明治”结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温太高。转膜过程注意降温免疫印迹法的实验技术44转膜及抗体检测 v背景太高背景太高1、膜没有均匀浸湿或出现干膜2、膜或者缓冲液污染3、封闭不充分4、抗体与封闭剂出现交叉反应5、抗体浓度过高 原原因因对对策策1 1、转膜前用转膜前用电转液电转液将膜完全将膜完全浸湿浸湿，操作过程避免干膜，操作过程避免干膜2 2、拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3 3、检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4 4、杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度免疫印迹法的实验技术45背景太高1、膜没有均匀浸湿或出现干膜 原因对1、转膜前用电转LOGOAdd your company slogan免疫印迹法的实验技术46Add your company sloganThank Y