免疫荧光技术 课件

荧光免疫技术荧光免疫技术fluoroimmunoassay荧光免疫技术1免疫荧光技术免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括免疫荧光技术包括荧光抗体技术荧光抗体技术和和荧光抗原技术荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。术，或称为免疫荧光技术。免疫荧光技术（Immunofluorescencete2该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。技术程序也还比较复杂。该技术的主要优缺点3基本原理基本原理免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或或抗原抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术。法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术。基本原理免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏4第一节第一节荧光的基本知识荧光的基本知识一、一、荧光荧光荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。合物，亦称荧光色素。第一节荧光的基本知识5二、荧光技术中有关的概念和参数二、荧光技术中有关的概念和参数1发射光谱发射光谱指固定激发波长，在不同波长下指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。所记录到的样品发射荧光的相对强度。2激发光谱激发光谱指固定检测发射波长，用不同波指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。发射强度。3荧光效率荧光效率指荧光物质将吸收的光能转变成指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。为荧光的百分率。4荧光效率荧光效率=发射激光的光量子数（荧光强度）发射激光的光量子数（荧光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）二、荧光技术中有关的概念和参数发射激光的光量子数（荧光强64荧光寿命荧光寿命指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰退到一定程度所用的时间。产生的荧光随时间而衰退到一定程度所用的时间。5荧光的猝灭荧光的猝灭指荧光物质的荧光辐射能力在受指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。6荧光偏振荧光偏振7P=FH-FLFH-FLP：偏振度；：偏振度；FH:表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度；向平行时测得的荧光强度；FL：表示以上两者方向相互垂直时测得的荧光强：表示以上两者方向相互垂直时测得的荧光强度。度。P=0,完全不偏振完全不偏振P（-1，+1），部分偏振），部分偏振4荧光寿命指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生7免疫荧光技术课件8三、荧光物质三、荧光物质1荧光色素荧光色素能够产生明显荧光并能作为染料使用的有能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于用于标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影活性基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。性结合。三、荧光物质1荧光色素9荧光色素的标记荧光色素的标记目前适于标记蛋白的荧光色素主要有：目前适于标记蛋白的荧光色素主要有：异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）四乙基罗丹明（四乙基罗丹明（rho-damineB200，RB200）四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisotheynate，TMRITC)藻红蛋白（藻红蛋白（R-RE)实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光素一实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光素一种。种。荧光色素的标记10(1)FITC标记标记FITC为黄色结晶形粉末，分为黄色结晶形粉末，分子量为子量为389.4，易溶于水和酒精等溶剂中，溶，易溶于水和酒精等溶剂中，溶解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为解后呈黄绿色荧光，最大吸收光谱为490-495nm，FITC的溶液不稳定，易因水解或迭的溶液不稳定，易因水解或迭聚而变质，故需在配好后聚而变质，故需在配好后2h内应用。内应用。FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基（主要是赖氨酸的的自由氨基（主要是赖氨酸的-氨基）结合，氨基）结合，形成荧光抗体结合物。一个分子的形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有有86个个赖氨酸残基，但一般最多只能标记赖氨酸残基，但一般最多只能标记15-20个。个。(1)FITC标记FITC为黄色结晶形粉末，分子量为11异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)异硫氰酸荧光素(FITC)12(2)RB200标记标记本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶本品为无定形褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存，分子量为子量为580，最大吸收光谱为，最大吸收光谱为570nm，呈明亮，呈明亮的橙色荧光，因与的橙色荧光，因与FITC的黄绿色有明显区别，的黄绿色有明显区别，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。的荧光抗体的双重染色。结合时间持续结合时间持续12-18h。(2)RB200标记13免疫荧光技术课件14FITC+RB200标记标记FITC+RB200标记15(3)TMRITC标记标记TMRITC为紫红色粉末，性能比较稳定，为紫红色粉末，性能比较稳定，分子量为分子量为443，最大吸收光谱为，最大吸收光谱为550nm，呈，呈橙红色荧光。其结合方法与橙红色荧光。其结合方法与FITC的直接标的直接标记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的记法相同，只是所加色素量为蛋白质量的1/30-1/40，结合时间持续，结合时间持续16-18h。(3)TMRITC标记162其它荧光物质其它荧光物质31）镧系螯合物）镧系螯合物铕、铽、钐、铈等铕、铽、钐、铈等42）酶作用后产生荧光的物质（荧光底物）酶作用后产生荧光的物质（荧光底物）54甲基伞酮甲基伞酮-D半乳糖苷半乳糖苷6四、荧光免疫分析常用仪器设备四、荧光免疫分析常用仪器设备7荧光显微镜荧光显微镜8荧光分光光度计荧光分光光度计9流式细胞仪流式细胞仪其它荧光物质17免疫荧光技术课件18免疫荧光技术课件19荧光显微镜荧光显微镜1光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯2滤板：隔热滤板、激光滤板（滤板：隔热滤板、激光滤板（UG、BG）、）、吸收滤板（吸收滤板（OG、GG）3光路：透射光、落射光光路：透射光、落射光荧光显微镜20a透射光透射光b落射光落射光a透射光b落射光21第二节第二节荧光抗体的制备荧光抗体的制备1.免疫血清的制备免疫血清的制备制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功制备高效价的特异性抗血清是免疫荧光技术成功的前提。通常以高效价的免疫血清为好，因为用的前提。通常以高效价的免疫血清为好，因为用这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特这种血清制备荧光抗体，即使其中含有少量非特异抗体，也可以通过稀释法将其除去。异抗体，也可以通过稀释法将其除去。为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大为提高血清效价，在制备免疫原时，通常采用大剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂剂量加佐剂，长程免疫，其中以弗氏不完全佐剂最常用。即按抗原最常用。即按抗原1份，无水羊毛脂份，无水羊毛脂1份，液体石份，液体石蜡蜡2份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能份混合，待充分乳化后，免疫动物，即可能获得高效价的免疫血清。获得高效价的免疫血清。第二节荧光抗体的制备22搅拌法（直接标记法）搅拌法（直接标记法）取抗体球蛋白溶液取抗体球蛋白溶液10ml，碳酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液3ml，生理盐水，生理盐水17ml，混合，在，混合，在4电磁搅拌下电磁搅拌下加加FITC3mg（先溶解在（先溶解在3ml缓冲液中），在缓冲液中），在4继续搅拌继续搅拌4-6h，将结合物通过已平衡好的，将结合物通过已平衡好的SephadexG25柱，以除去未结合的游离荧光柱，以除去未结合的游离荧光素。素。2荧光素标记荧光素标记搅拌法（直接标记法）2荧光素标记23透析标记法透析标记法适用于小体积的标记。适用于小体积的标记。将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液将抗体球蛋白溶液用碳酸盐缓冲液（0.25mol/L，pH9.0调动调动1%(W/V)，并装入，并装入透析袋中，按蛋白质量的透析袋中，按蛋白质量的1/20称取称取FITC溶于溶于10倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸倍抗体溶液量的碳酸盐缓冲液中，将透析袋浸没于没于FITC液中，于液中，于4搅拌搅拌16-18h取出透析袋取出透析袋于于0.01mol/L，pH7.2PBS中透析中透析4h，将结合物，将结合物通过已平衡好的通过已平衡好的SephadexG25柱，去除游离荧柱，去除游离荧光素。光素。透析标记法24影响标记的主要因素影响标记的主要因素温度温度:温度低，标记时间长，温度高，标记时间温度低，标记时间长，温度高，标记时间应短。应短。时间时间:FITC0-4以以6-12h为宜，为宜，20-25以以1-2h为为宜，宜，3730-45min为宜。为宜。酸碱度酸碱度:pH低时，标记较慢，低时，标记较慢，pH值偏高（值偏高（10），），抗体易变性，抗体易变性，pH值值9.0-9.5最为适宜。最为适宜。标记量标记量:抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含20-25mg蛋白为宜。蛋白为宜。影响标记的主要因素253免疫球蛋白的提纯免疫球蛋白的提纯用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，用于荧光素标记的免疫血清，需提纯后使用，这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以这样不但可以提高抗体的效价，而且还可以排除排除球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性球蛋白以外的蛋白质，减少非特异性荧光的出现。荧光的出现。从免疫血清中将特异性抗体提纯与荧光素标从免疫血清中将特异性抗体提纯与荧光素标记是免疫荧光技术的关键一环。记是免疫荧光技术的关键一环。3免疫球蛋白的提纯26在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，主要是主要是IgG类，其提纯方法很多，但以类，其提纯方法很多，但以饱和硫酸铵盐析法比较简便；饱和硫酸铵盐析法比较简便；也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤）也可用分子筛层析法（即葡聚糖凝胶过滤）；以及离子交换层析法等；以及离子交换层析法等；或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进或先用盐析法精提，然后再经过层析柱进一步纯化。一步纯化。在免疫荧光技术中所应用的特异性抗体，27标记抗体溶液标记抗体溶液透析或凝胶过滤透析或凝胶过滤DEAE-纤维素层析纤维素层析抗原交叉吸收或组织制剂吸收抗原交叉吸收或组织制剂吸收荧光抗体活性鉴定荧光抗体活性鉴定（去除游离荧光色素）（去除游离荧光色素）粗制荧光抗体粗制荧光抗体（去除过度标记的蛋白分子）（去除过度标记的蛋白分子）精制荧光抗体精制荧光抗体（去除特异交叉反应的标记抗体（去除特异交叉反应的标记抗体）免疫纯荧光抗体免疫纯荧光抗体标记抗体的纯化标记抗体的纯化F/P=1.5(固体标本）固体标本）2.4(活细胞染色）活细胞染色）标记抗体溶液透析或凝胶过28第三节 免疫荧光显微技术免疫学的基本反应是抗原免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。一种特异性荧光反应。第三节免疫荧光显微技术29一、标本的制作一、标本的制作1.涂片、印片、切片涂片、印片、切片2.标本的固定通过固定，不仅使标记的抗体易标本的固定通过固定，不仅使标记的抗体易于接近抗原，从而发生反应，而且要求标本中的于接近抗原，从而发生反应，而且要求标本中的抗原的活性不受损失，同时还要保护其自然形态抗原的活性不受损失，同时还要保护其自然形态和位置。和位置。因此，根据所研究的抗原和组织细胞种类的不同，因此，根据所研究的抗原和组织细胞种类的不同，相应地采用不同的固定方法。应用最广泛的固定相应地采用不同的固定方法。应用最广泛的固定液是丙酮和乙醇，其次是甲醇、甲醛、丙烯醛等。液是丙酮和乙醇，其次是甲醇、甲醛、丙烯醛等。切片标本大多用乙醇固定，组织培养标本主要用切片标本大多用乙醇固定，组织培养标本主要用丙酮固定。丙酮固定。一、标本的制作30二、荧光抗体染色二、荧光抗体染色1）直接法直接法1标本经固定后，标本经固定后，PBS洗涤洗涤33分钟。分钟。2加荧光素标记的抗体，湿盒内加荧光素标记的抗体，湿盒内37孵育孵育50分钟。分钟。3PBS洗涤洗涤33分钟。分钟。40.1伊文氏兰复染。伊文氏兰复染。5PBS洗洗3次，蒸馏水洗次，蒸馏水洗2次，每次次，每次3分钟，以分钟，以除去除去NaCl结晶。结晶。6缓冲甘油封片，镜检。缓冲甘油封片，镜检。二、荧光抗体染色31直接染色法直接染色法优点是：特异性高，操作简便，比较快速。优点是：特异性高，操作简便，比较快速。缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。敏感性较差。直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。对照。直接染色法32免疫荧光技术课件332）间接法间接法1标本固定后，标本固定后，PBS洗涤洗涤33分钟。分钟。2滴加一抗，滴加一抗，3740分钟或分钟或4过夜。过夜。3PBS洗涤洗涤33分钟。分钟。4滴加荧光标记二抗滴加荧光标记二抗3740分钟。分钟。5PBS洗涤洗涤33分钟。分钟。60.1伊文氏兰复染。伊文氏兰复染。7PBS洗涤洗涤33分钟。分钟。8缓冲甘油封片，镜检。缓冲甘油封片，镜检。2）间接法34间接染色法间接染色法优点：既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；优点：既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点：由于参加反应的因素较多，受干扰的可缺点：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。繁琐，对照较多，时间长。间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。层对照（即中间层加阴性血清代替阳性血清）。间接染色法35三、荧光显微镜检查三、荧光显微镜检查1染色当天即做镜检染色当天即做镜检2选择好光源和滤光片选择好光源和滤光片33阳性细胞的数量和荧光强度均可作为荧光阳性细胞的数量和荧光强度均可作为荧光显微镜检查的定量或半定量的指标。显微镜检查的定量或半定量的指标。三、荧光显微镜检查3637写在最后写在最后成功的基础在于好的学习习惯成功的基础在于好的学习习惯The foundation of success lies in good habits37写在最后成功的基础在于好的学习习惯 结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日 结束语38