免疫组织化学染色技术课件

免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术1第一节第一节常规组织学染色技术概述常规组织学染色技术概述 宏观宏观微观微观超微结构超微结构基因水平基因水平组织形态学研究技术的种类：组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法一、病理大体组织标本的染色方法在在标标本本制制作作中中，为为了了某某种种特特殊殊目目的的，突突出出显显示示标标本本的的重重要要部部分分，借借助助组组织织切切片片的的特特殊殊染染色色方方法法对对标标本本进进行行染染色色，将将病病变变器器官官及及不不同同组组织织成成分分用用染染料料染染成成不不同同的的颜颜色色，以以便便于于区区分分大大体体标标本本的的不不同同成成分分和和病病变变特特点，如：点，如：脂肪组织染色法脂肪组织染色法目目的的：主主要要用用于于心心、肝肝、肾肾脂脂肪肪变变性性，动动脉脉粥粥样样硬化大体标本的染色硬化大体标本的染色第一节常规组织学染色技术概述宏观2 试剂：苏丹试剂：苏丹或苏丹或苏丹结果：病变处脂肪组织呈橙黄色结果：病变处脂肪组织呈橙黄色 早期心肌梗死染色法早期心肌梗死染色法目的：显示早期心肌梗死的区域目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：试剂：0.1%NBT(硝基四唑蓝硝基四唑蓝)/0.2mol/LPBS(pH7.6)方法：将方法：将2-3mm厚新鲜心肌大片放入试剂中，厚新鲜心肌大片放入试剂中，37C孵育孵育20min。结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。注意注意：新鲜标本，尸检心肌不超过：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。小时。试剂：苏丹或苏丹3二、光学显微镜下的组织学染色方法二、光学显微镜下的组织学染色方法常规常规HE染色（染色（hematoxylinandeosinstaining）组织学特殊染色组织学特殊染色1.Mallory三染色、三染色、Masson三染色三染色2.神经纤维的镀银染色神经纤维的镀银染色3.其其他他的的特特殊殊染染色色，包包括括钙钙、铁铁、铅铅、铜铜、黑黑色色素素和和脂脂褐褐素素、细胞细胞DNA和和RNA的染色等的染色等上上述述的的各各种种染染色色方方法法只只能能在在细细胞胞水水平平上上显显示示组组织织结结构构的的形态改变。形态改变。三、超微结构的观察三、超微结构的观察光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2 m有效放大倍数最高不超过有效放大倍数最高不超过2000倍。倍。电镜的分辨率最佳可达电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达，放大倍率最高可达100万倍。万倍。二、光学显微镜下的组织学染色方法4 第二节第二节免疫组织化学染色技术免疫组织化学染色技术Immunohistochemicaltechnique该该技技术术主主要要是是用用于于研研究究和和观观察察细细胞胞中中的的某某些些结结构构或或分分子子物物质质和和组组织织细细胞胞间间的的成成分分，因因此此现现又又称称为为免免疫疫细胞化学技术细胞化学技术。根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：1.免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术2.免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术3.免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术4.免疫金免疫金-银细胞化学技术银细胞化学技术5.免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术第二节免疫组织化学染色技5一、免疫组织化学染色方法的原理一、免疫组织化学染色方法的原理抗原（抗原（antigen）1.定定义义：是是一一类类在在适适合合条条件件下下能能激激发发机机体体免免疫疫系系统统发发生生免免疫疫应应答答，并并能能与与免免疫疫应应答答产产生生的的效效应应物物质质（抗抗体体和和效效应应细细胞胞）在在体体内内或或体体外外发发生生特特异异性性结结合合反应的物质。反应的物质。抗原具有两种性能抗原具有两种性能：（1）免免疫疫原原性性（immunogenicity）指指抗抗原原分分子子具有诱导机体产生免疫应答的特性。具有诱导机体产生免疫应答的特性。（2）反反应应原原性性（reactogenicity）指指抗抗原原分分子子与与抗抗体体或或效效应应T细细胞胞等等免免疫疫应应答答产产物物发发生生特特异异性性反反应应的特性。的特性。一、免疫组织化学染色方法的原理62.抗原的分类抗原的分类 完全抗原、半抗原完全抗原、半抗原免疫学分类免疫学分类胸腺依赖抗原与非依赖抗原胸腺依赖抗原与非依赖抗原外源性抗原：微生物、花粉等外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等瘤相关抗原等临临床床分分类类同种异型抗原：人类白细胞抗原、同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原等之间存在的共同抗原2.抗原的分类7抗体（抗体（antibody）1.定定义义：机机体体受受到到抗抗原原刺刺激激后后，通通过过体体液液免免疫疫应应答答，B淋淋巴巴细细胞胞活活化化、增增殖殖，分分化化为为浆浆细细胞胞，由由浆浆细细胞胞合合成成并并分分泌泌的的仅仅与与该该抗抗原原发发生生特特异异性性反反应应的的球球蛋蛋白白，称为抗体。称为抗体。大大部部分分抗抗体体电电泳泳后后位位于于 区区带带，1972年年国国际际免免疫疫学学联联合合会会正正式式将将化化学学结结构构相相同同或或相相似似的的一一类类球球蛋蛋白白分子统一命名为免疫球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。2.抗抗体体的的种种类类:五五类类，即即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免免疫疫组组织织化化学学染染色色技技术术中中，使使用用的的抗抗体体主主要要是是IgG，个别情况下使用，个别情况下使用IgG的亚型，多为的亚型，多为IgG1。抗体（antibody）8免疫组织化学染色的反应原理及显色原理免疫组织化学染色的反应原理及显色原理1.免疫组织化学染色的反应原理免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。通通过过对对针针对对标标本本中中相相应应抗抗原原的的抗抗体体上上标标记记某某种种发发色色剂剂或或酶酶类类，再再通通过过激激发发发发色色剂剂或或使使用用某某种种显显色色剂剂，在在显显微微镜镜下下使使标标本本中中抗抗原原抗抗体体反反应应的的部部位位产产生生肉肉眼眼可可观观察察到到的的颜颜色色以以确确定定所所要要检检测测的的抗抗原原是否存在。是否存在。通通过过免免疫疫组组织织化化学学染染色色技技术术，在在光光学学显显微微镜镜下下即即可可检检测测到到所所要要研研究究的的蛋蛋白白分分子子类类物物质质的的存存在在与与否。否。免疫组织化学染色的反应原理及显色原理92.免疫组织化学染色的显色原理免疫组织化学染色的显色原理(1)基本原理基本原理 荧荧光光标标记记或或酶酶标标抗抗体体的的染染色色分分为为直直接接法法和和间间接接法法。其其中以酶标抗体法应用最为广泛。中以酶标抗体法应用最为广泛。直直接接法法：是是将将酶酶直直接接标标记记在在第第一一抗抗体体上上，用用酶酶标标抗抗体体与与切切片片上上待待检检测测的的组组织织或或细细胞胞中中抗抗原原反反应应，再再用用底底物物显显色色，显显示出所检测的目的抗原的部位。示出所检测的目的抗原的部位。间间接接法法：是是将将酶酶标标记记在在第第二二抗抗体体或或与与第第二二抗抗体体具具有有亲亲和和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。间间接接法法中中所所用用的的一一抗抗是是针针对对组组织织或或细细胞胞中中某某种种抗抗原原的的特特异异性性抗抗体体，多多数数抗抗体体是是由由家家兔兔制制备备的的多多克克隆隆抗抗体体或或由由小小鼠鼠制制备的单克隆抗体。备的单克隆抗体。2.免疫组织化学染色的显色原理10 第第二二抗抗体体是是第第一一抗抗体体的的抗抗体体，所所以以只只要要不不同同的的第第一一抗抗体体均均来来自自同同一一种种属属动动物物，与与标标记记的的第第二二抗抗体体结结合合就就能能用用来来显显示示不不同同特特异异性性抗抗原原的的存存在在。这这样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。通通过过某某种种技技术术增增加加第第二二抗抗体体上上标标记记酶酶的的含含量量，可提高免疫组织化学染色的敏感度。可提高免疫组织化学染色的敏感度。IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。技术中，绝大多数以间接法为常用。（2）显色的基本程序）显色的基本程序1抗抗孵孵育育切切片片或或细细胞胞涂涂片片2抗抗（酶酶标标抗抗体体）孵育切片孵育切片发色剂显色发色剂显色（核复染）（核复染）第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的第一抗体11（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂）酶标抗体法的显色原理及显色剂 辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（horseradish peroxidase，HRP）HRP+H2O2HRPH2O2HRPH2O2+DH2HRP+D+2H2OHRP催催化化的的酶酶促促反反应应第第一一步步是是特特异异的的，其其余余反反应应是是非非特特异异的的，因因此此，可可选选用用各各种种供供氢氢体体作作为为显显色色剂剂，可可使使反反应的终产物呈现不同的颜色，如：应的终产物呈现不同的颜色，如：CN为蓝色为蓝色TMB为深蓝色为深蓝色AEC为红色为红色DAB为棕色为棕色（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂12碱性磷酸酶碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)以以AS-Mx（色色酚酚AS-MX磷磷酸酸盐盐）为为底底物物，FB/FR(Fastblue/Fastred)为发色剂，生成蓝色为发色剂，生成蓝色/红色不容性沉淀物。红色不容性沉淀物。ALP标标记记的的抗抗体体主主要要用用于于内内源源性性过过氧氧化化物物酶酶含含量量较较高高的的血细胞、淋巴细胞等的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。染色。由由于于组组织织细细胞胞内内含含有有内内源源性性ALP，在在显显色色液液中中需需加加入入终终浓浓度度为为2-4mol/L的的左左旋旋咪咪唑唑(levamisole)，大大多多数数内内源源性性ALP活性可被抑制。活性可被抑制。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)以以葡葡萄萄糖糖为为底底物物的的酶酶，其其显显色色方方法法为为-D-葡葡萄萄糖糖67mg、NBT 6.7mg、PMS(吩吩 嗪嗪 硫硫 酸酸 甲甲 酯酯,phenazine methyl-sulfate)0.167mg、0.05mol/LPBS(pH8.2)10.0ml，37C孵孵育育1小小时时，生生成成蓝蓝色色不不溶溶性性沉沉淀淀物物，该该终终产产物物不不溶溶于于有有机机溶溶剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。剂，切片可经脱水、透明后封片，长期保存。碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,A13（4）核复染）核复染在在显显色色后后，特特别别是是用用DAB显显色色后后，切切片片可可用用苏苏木木素素染染料料进进行行核核复复染染，经经水水化化后后细细胞胞核核显显示示蓝蓝色色，与与胞胞质质中中的的DAB棕棕色色形形成成对对比比。但但用用AEC显显色色后后不不能能用用苏苏木木素素做做核核复复染染，因因为为配配制制苏苏木木素素染染料料中中使使用用酒酒精精作作为为介介质质，可可使使AEC的的红红色色终终产产物物褪褪色色，且且AEC显显色色后后只只能能用用水水溶溶性封固剂封片。性封固剂封片。（4）核复染14第三节第三节免疫组织化学染色步骤免疫组织化学染色步骤（一）（一）ABC或或SP法进行石蜡切片染色的主要步骤法进行石蜡切片染色的主要步骤 1.组织材料的采取；组织材料的采取；2.组织块的固定；组织块的固定；3.组织块的脱水、透明及石蜡包埋；组织块的脱水、透明及石蜡包埋；4.石蜡切片的制备；石蜡切片的制备；5.石蜡切片的脱蜡及水化；石蜡切片的脱蜡及水化；6.抑制内源性过氧化物酶活性；抑制内源性过氧化物酶活性；7.PBS洗涤切片；洗涤切片；8.抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；抗原修复或蛋白酶消化切片，修复或暴露抗原；9.PBS洗涤切片；洗涤切片；第三节免疫组织化学染色步骤（一）ABC或SP法进行石蜡切1510.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时加入加入BSA）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；）孵育切片，防止抗体的非特异性吸附；11.用特异性一抗用特异性一抗(单克隆、多克隆单克隆、多克隆)孵育切片；孵育切片；12.PBS（可加入（可加入Tween20#，PBST）洗涤切片；）洗涤切片；13.用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；用针对一抗的生物素化的二抗孵育切片；14.用用PBS或或PBST洗涤切片；洗涤切片；15.滴加滴加SP试剂或试剂或ABC试剂；试剂；16.PBS或或PBST洗涤切片；洗涤切片；17.DAB或或AEC显色；显色；18.自来水洗涤切片，终止显色；自来水洗涤切片，终止显色；19.用苏木素做核复染；用苏木素做核复染；20.切片脱水、透明，树胶封片。切片脱水、透明，树胶封片。10.用与二抗来源相同的动物非免疫正常血清（或同时16（二）各染色步骤的具体操作及注意事项（二）各染色步骤的具体操作及注意事项1.组织材料的采取组织材料的采取 活检组织活检组织组织标本组织标本手术切除标本手术切除标本尸检标本尸检标本实验组织或培养细胞实验组织或培养细胞活检组织活检组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内窥镜钳取的组织体体积积小小，因因活活检检钳钳直直接接钳钳取取，常常受受压压过过度度而而变变性性，因因此此，活活检检钳钳的的刃刃口口必必须须锐锐利利，以以免免组组织织受受压压，活活检检时时应应采采取取主主要要的的病灶区。病灶区。抗抗原原在在组组织织中中的的分分布布不不均均一一，故故病病灶灶较较大大的的切切除除标标本本应应考考虑虑切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。切取主要病灶。病灶与正常组织交界区及远距病灶的正常区。（二）各染色步骤的具体操作及注意事项1.组织材料的采取17尸检组织尸检组织 由由于于取取材材时时一一般般均均已已超超过过死死亡亡后后2小小时时以以上上，组组织织有有不不同同程程度度自自溶溶，其其抗抗原原或或变变性性消消失失或或有有严严重重的的弥弥散散现现象象。法法医医尸尸检检一一般般多多在在24小小时时以以上上，甚甚至至数数月月后后，检检材材受受死死后后变变化化影影响响严严重重，而而影影响响染染色色结结果果。手手术术切切除除的的组组织织较较新新鲜鲜，取取材材后后应应立即固定，以保存组织结构和抗原。立即固定，以保存组织结构和抗原。实验动物标本实验动物标本新新鲜鲜，可可按按需需要要取取材材；很很多多情情况况下下是是在在灌灌流流固固定定后后取取材材，组织结构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。组织结构和抗原保持良好，非常适用于免疫组织化学染色。取材标本的大小取材标本的大小尸尸检检组组织织材材料料大大小小以以1cm 1cm 0.2cm为为宜宜。实实验验动动物物常常用用大大鼠鼠或或小小鼠鼠，其其脏脏器器体体积积小小，有有利利于于取取材材。一一般般标标本本体体积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。积不宜过大，防止固定不透，影响抗原的保存，也浪费试剂。尸检组织182.组织块的固定、水洗组织块的固定、水洗（1）固定液：）固定液：种类较多，常用的有以下种类较多，常用的有以下2种：种：4%甲醛甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：配制方法：10ml40%甲醛甲醛(formalin)+90mlPBS使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀使用新鲜甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛多聚甲醛)，还可形成甲酸，影响染色结果。，还可形成甲酸，影响染色结果。(可以用粉笔溶可以用粉笔溶)4%多聚甲醛多聚甲醛/PBS(pH7.2-7.4)配制方法：配制方法：40g多聚甲醛多聚甲醛(paraformaldehyde)+500ml0.1mol/LPB(pH7.2-7.4)，搅拌、加热至，搅拌、加热至60C，同时滴入，同时滴入1NNaOH至溶液完全透明。冷却后用至溶液完全透明。冷却后用1NHCl调调PH值至值至7.2-7.4，再用，再用0.1mol/LPB将溶液加至将溶液加至1000ml。固定时间：固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。小时。固定原理：固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。不利作用：不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。2.组织块的固定、水洗19（2）水洗）水洗 冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时冲洗时间与标本的种类、组织块的大小和固定时间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗间长短有关。尸检组织和大动物组织一般冲洗24小时，小动物组织冲洗小时，小动物组织冲洗2-10小时。小时。新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固新鲜标本固定时间短，冲洗时间也相应缩短，固定时间长的标本，冲洗时间也需延长。定时间长的标本，冲洗时间也需延长。冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎冲洗时组织放在广口瓶中，瓶口用纱布罩好并扎紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一端紧，防止组织块漏出。用一根适当的胶管，一端接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将接自来水，一端插入瓶底，使水缓慢流出，或将组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。组织块放入洗涤筐中，放在水盆内冲洗。对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水对于过小组织或穿刺组织和小动物组织多次换水浸泡即可。浸泡即可。（2）水洗203.组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋（1）脱水）脱水脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常脱水剂：酒精、丙酮、异丙醇、正丁醇，最常用酒精。用酒精。酒酒精精可可以以与与水水以以任任何何比比例例混混合合，脱脱水水能能力力强强，并并可可硬硬化化组组织织。酒酒精精对对组组织织的的穿穿透透速速度度很很快快，对对组组织织有有较较明明显显的的收收缩缩作作用用。为为避避免免组组织织过过度度收收缩缩，应应从从低低浓浓度度开开始始，然然后后再再依依次次增增加加其其浓浓度度。在在常常温温下下或或4C下进行，以减少抗原的损失。下进行，以减少抗原的损失。70%80%90%95%100%100%3.组织块的脱水、透明、浸蜡和包埋21（2）透明）透明为为使使石石蜡蜡能能浸浸入入组组织织块块，组组织织经经脱脱水水后后，必必须须经经过过一一种种既既能能与与酒酒精精相相溶溶，又又能能溶溶解解与与石石蜡蜡的的溶溶剂剂。通过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。通过溶剂的媒介作用而达到石蜡浸入组织块的目的。透透明明剂剂：二二甲甲苯苯、苯苯、甲甲苯苯、氯氯仿仿等等，最最常常用用 二甲苯。二甲苯。一一般般经经过过23次次纯纯二二甲甲苯苯溶溶液液透透明明，每每次次1015分分钟钟，同同时时应应根根据据组组织织的的种种类类和和组组织织块块大大小小以以及及二甲苯的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。二甲苯的新鲜程度加以调整，不应机械照搬。（2）透明22（3）浸蜡）浸蜡组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。浸蜡。为使石蜡充分渗入组织只，常需经过为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡浸次石蜡浸渍。渍。用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温蜡，在蜡，在60C以下浸透。以下浸透。（4）包埋）包埋浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡到入包埋盒，冷却后取出，修块。到入包埋盒，冷却后取出，修块。（3）浸蜡234.石蜡切片的制作石蜡切片的制作（1）载玻片涂片的制作）载玻片涂片的制作防防脱脱片片剂剂：3-氨氨基基丙丙基基三三乙乙氧氧基基硅硅烷烷（3-aminopropyltriethoxysilane,APES）、多多聚聚赖赖氨氨酸（酸（Poly-L-lysine）、甲醛）、甲醛-甘油明胶。甘油明胶。APES涂片的制作涂片的制作原原理理：APES是是一一种种新新型型玻玻片片粘粘附附剂剂，与与一一般般的的粘粘附附剂剂不不同同，它它是是通通过过对对玻玻璃璃表表面面起起化化学学修修饰饰作作用用，改改变变其其表表面面的的化化学学物物理理特特性性，使使组组织织切切片片牢牢固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。固地贴于玻璃片上，不易脱落，保留时间较久。具体操作方法具体操作方法：将将载载玻玻片片用用酸酸处处理理后后，用用95%酒酒精精浸浸泡泡，再再用用绸布擦干，清除表面的污渍；绸布擦干，清除表面的污渍；4.石蜡切片的制作24将干净的载玻片放入丙酮内将干净的载玻片放入丙酮内5min；将载玻片用镊子夹住浸入将载玻片用镊子夹住浸入APES试剂（试剂（1mlAPES+50ml丙酮）丙酮）1-2次；次；纯丙酮内洗纯丙酮内洗2次后，次后，37C过夜，干燥；过夜，干燥；用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。用铝箔包好，室温下存放，可存放半年。多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，PLL）试剂配制：试剂配制：PLL0.5g+蒸馏水蒸馏水100ml也也可可根根据据提提供供的的方方法法配配制制。可可于于4C或或-20C保存备用，可反复冻存，效果无明显影响。保存备用，可反复冻存，效果无明显影响。涂涂片片前前将将其其稀稀释释10-50倍倍，均均匀匀涂涂在在处处理理后后干干净净的的载玻载玻片上，片上，37C下干燥过夜。下干燥过夜。将干净的载玻片放入丙酮内5min；25甲醛甲醛-甘油明胶甘油明胶试剂：试剂：40%甲醛甲醛2.5ml，明胶，明胶0.5g，蒸馏水加至，蒸馏水加至100ml。配制方法：用一部分蒸馏水（约配制方法：用一部分蒸馏水（约80ml）加热溶解明）加热溶解明胶，待完全溶化后加入甲醛，最后补充蒸馏水至胶，待完全溶化后加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml，混匀即可。，混匀即可。粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经粘附切片的效果较上述两种方法差，特别是切片经抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。抗原热修复或酶消化后，有时易脱片。（2）制做切片）制做切片切片机：旋转式或滑动式切片机。切片机：旋转式或滑动式切片机。切片厚度：切片厚度：5-7 m。展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展展片：切片放入玻璃平皿中的温水中展开切片（水浴锅上加热平皿）。开切片（水浴锅上加热平皿）。捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。捞片：用涂有防脱片剂的载玻片捞取切片。切片干燥：切片干燥：37C过夜，干燥。过夜，干燥。甲醛-甘油明胶265石蜡切片的脱腊及水化石蜡切片的脱腊及水化 脱蜡：脱蜡：将切片放入将切片放入染色筐染色筐中，二甲苯中，二甲苯、各各15分钟脱腊，分钟脱腊，水化：水化：100%酒精酒精、中各中各10分钟、分钟、95%ALC5分钟、分钟、90%ALC5分钟、分钟、80%ALC5分钟、分钟、70%ALC5分钟，蒸馏水浸洗。分钟，蒸馏水浸洗。6清除内源性过氧化物酶活性清除内源性过氧化物酶活性由由于于常常规规免免疫疫组组织织化化学学染染色色的的最最后后显显色色是是用用辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶(horseradishperoxidase,HRP)和和DAB(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，而而组组织织中中常常含含有有内内源源性性过过氧氧化化物物酶酶，为为防防止止出出现现假假阳阳性性反反应应和和减减少少背背景景染染色色，需需要要先先清清除除内内源源性性过过氧化物酶活性。氧化物酶活性。5石蜡切片的脱腊及水化27染染色色框框染色框28具体方法：具体方法：将切片置入甲醇将切片置入甲醇(PBS)-H2O2液中液中2030分钟分钟试剂：试剂：纯甲醇纯甲醇99ml30%，H2O21ml充分混匀，使最后浓充分混匀，使最后浓度为度为0.3%，或，或0.01mlPBS(pH7.27.4)99ml30%H2O21ml7PBS洗涤切片洗涤切片经经甲甲醇醇-H2O2或或PBS-H2O2处处理理后后的的切切片片先先用用蒸蒸馏馏水水洗洗一次一次5min，再用，再用PBS洗洗5min3次。次。0.01mol/LPBS(pH7.27.4)的配制：的配制：NaH2PO42H2O0.45gNa2HPO412H2O3.23gNaCl8.0g蒸馏水蒸馏水加至加至1000ml为为防防止止抗抗体体与与组组织织发发生生静静电电吸吸附附而而产产生生非非特特异异性性染染色色，可可在在PBS中中加加入入Tween 20#，制制成成含含0.1%Tween 20#的的PBS。Tween20#为一种除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。为一种除污剂，可清除和封闭组织中的静电荷。具体方法：将切片置入甲醇(PBS)-H2O2液中20298抗原修复（抗原修复（antigenretrieval,AR）某某些些抗抗原原的的免免疫疫组组化化染染色色不不需需要要此此步步骤骤即即可可染染色色，如如横横纹纹肌肌中中的的myoglobin(Mb)、actin、myosin、脑脑组组织织中中的的S-100蛋蛋白白、GFAP、血血型型抗抗原原A、B、H、生生长长激激素素(growthhormone)、胰胰 岛岛 素素、波波 形形 蛋蛋 白白(vimentin)、降降 钙钙 素素(calcitonin)等等。但但有有一一部部分分抗抗原原物物质质或或检检测测的的因因子子等等由由于于组组织织经经甲甲醛醛固固定定后后，因因蛋蛋白白质质的的交交联联，将将抗抗原原封封闭闭或或发发生生变变性，因此需要热修复或蛋白酶消化。性，因此需要热修复或蛋白酶消化。目目前前机机理理清清楚楚，但但是是以以高高温温、高高压压对对常常规规固固定定的的石石蜡蜡切切片片进进行行抗抗原原修修复复处处理理经经验验表表明明，可可以以提提高高抗抗原原抗抗体体阳阳性性检检测测率率，同同时时也也会会出出现现假假阳阳性性，现现已已广广泛泛用用于于技技术术中中。尤尤其其对对原原来来仅仅表表达达在在冰冰冻冻切切片片上上的的抗抗原原，利利用用后后大大部部分分抗抗体体能能用用于于常规甲醛固定的石蜡切片上。常规甲醛固定的石蜡切片上。8抗原修复（antigenretrieval,A30（1）抗原热修复）抗原热修复 方方法法微波中微波中961020min直接加热法直接加热法10010min高压锅高压锅/消毒锅消毒锅12010min其他：水浴锅其他：水浴锅10010min2及真空加热及真空加热10min等。等。热修复的介质热修复的介质0.01mol/LpH6.0柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液0.05mol/LTris-HCl缓冲液缓冲液(pH112)0.01mol/LpH7.0PBS2%硫酸铝硫酸铝2%硝酸铅硝酸铅生理盐水生理盐水蒸馏水蒸馏水 溶溶液液的的摩摩尔尔浓浓度度对对修修复复效效果果无无任任何何影影响响，而而pH值值则则影影响响较较大大，缓缓冲冲液液以以柠柠檬檬酸酸缓缓冲冲液液和和Tris-HCl缓冲液较常用。缓冲液较常用。（1）抗原热修复溶液的摩尔浓度对修复效果无任31 温度与修复时间的关系：温度与修复时间的关系：许许多多的的实实验验结结果果表表明明：温温度度高高修修复复时时间间短短，如如Ki-67和和P-gp的的检检测测，利利用用同同一一切切片片，达达到到相相同同染染色色结结果果需需要要：10020min；9030min；8050min；7020h操作流程操作流程微微波波处处理理：将将切切片片插插入入25片片塑塑料料架架上上，在在250ml塑塑盒盒内内加加入入200ml缓缓冲冲液液，将将微微波波高高档档加加温温缓缓冲冲液液至至90+，取取出出后后自然冷却至室温后蒸馏水洗，自然冷却至室温后蒸馏水洗，PBS洗。洗。水水浴浴锅锅法法：一一种种传传统统的的抗抗原原修修复复方方法法，首首先先调调节节水水温温达达95左左右右，将将切切片片置置入入内内含含200ml缓缓冲冲液液的的塑塑料料盒盒或或烧烧杯杯内内，放放入入水水浴浴锅锅，温温度度平平衡衡后后开开始始计计算算时时间间20min，取取出出容容器器后后自然冷却到室温。自然冷却到室温。压压力力锅锅法法：不不锈锈钢钢高高压压锅锅内内加加入入一一定定量量的的缓缓冲冲液液，加加热热锅锅使使液液体体煮煮沸沸，将将切切片片加加入入切切片片架架并并置置入入锅锅内内，盖盖上上锅锅盖盖，不不加加阀阀，开开始始冒冒气气计计时时50min，关关闭闭气气阀阀，使使之之加加压压10min。再再将将压压力力锅锅置置于于流流水水槽槽中中冲冲洗洗10min，冷冷却却后后取取出出切切片片，PBS洗。洗。温度与修复时间的关系：32 最佳修复方法的选择最佳修复方法的选择 选择最佳的修复方法设计表选择最佳的修复方法设计表 柠檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 10-11Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波100 10min2 slide 1 slide 2 slide 3压力锅120 10min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴90 30min slide 7 slide 8 slide 9 slide 10 作对照，不作任何处理 最佳修复方法的选择33 抗原热修复应注意的问题抗原热修复应注意的问题 有有些些抗抗体体在在石石蜡蜡或或冰冰冻冻切切片片上上呈呈阴阴性性反反应应，但但石石蜡蜡切切片片用用抗抗原原修修复复后后却却能能很很好好显显示示，对对某某些些应应表表达达在在胞胞浆浆或或膜膜上上的的抗抗原原，经经修修复复后后，绝绝大大部部分分表表达达在在核核内内。而而有有些些表表达达在在核核内内的的抗抗原原经经修修复复后后会会出出现现在在胞胞浆浆内内，因因此此，在在使使用用该该方方法法时时一一定定要要小小心心，对对结结果果的的判判定定也也要要做做出出客客观观的的分分析析，同同时时在在操操作作过过程程中还中还注意以下问题：注意以下问题：抗原热修复应注意的问题34热处理后应自然冷却切片。热处理后应自然冷却切片。不能煮干修复液。不能煮干修复液。不要任何抗原的检测都使用该方法。不要任何抗原的检测都使用该方法。一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。一批抗原的检测其温度和时间应保持一致。一一般般经经高高温温修修复复后后胞胞浆浆无无明明显显的的破破坏坏，但但对对细细胞胞核核的的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染现象。如如果果在在常常用用的的缓缓冲冲（修修复复）液液中中无无法法实实现现抗抗原原修修复复，得得不不出出好好的的染染色色结结果果，或或经经修修复复后后，抗抗原原定定位位发发生生改改变变，可可改改用用一一些些不不常常用用的的缓缓冲冲液液或或加加一一些些鳌鳌合合剂剂，如如EDTA或或EGTA等可能取得较好的效果。等可能取得较好的效果。热处理后应自然冷却切片。35 （2）蛋白酶消化法）蛋白酶消化法原原理理：蛋蛋白白酶酶消消化化可可以以去去除除覆覆盖盖在在抗抗原原决决定定簇簇表表面面的的杂杂蛋蛋白白，更更为为重重要要的的是是因因甲甲醛醛固固定定而而引引起起的的交交联联被被酶酶消消化化打打开开而而引引起起暴暴露露抗抗原原决决定定簇簇的的作作用用，使使第一抗体能与抗原部分结合，提高阳性检测率。第一抗体能与抗原部分结合，提高阳性检测率。注注意意事事项项：用用于于IHC切切片片消消化化的的酶酶有有多多种种，所所选选择择酶酶的的种种类类、使使用用的的浓浓度度、pH值值、消消化化时时间间及及温温度度等等均均要要视视组组织织固固定定的的不不同同、所所检检测测抗抗原原的的性性质质、组织类型的不同而异，通过预实验确定。组织类型的不同而异，通过预实验确定。（2）蛋白酶消化法36常用的消化酶类：常用的消化酶类：胰胰蛋蛋白白酶酶和和蛋蛋白白酶酶K：检检测测细细胞胞内内抗抗原原切切片片的的消化，如消化，如Keratin、CEA、GFAP等。等。胃胃蛋蛋白白酶酶：细细胞胞间间质质抗抗原原检检测测切切片片的的消消化化，如如纤连蛋白纤连蛋白(fibronectin)，各型胶原等。，各型胶原等。消消化化时时间间及及温温度度：一一般般消消化化时时间间与与组组织织固固定定的的长长短短呈呈正正比比。蛋蛋白白酶酶的的消消化化时时间间51020min，视切片固定时间的长短而定。视切片固定时间的长短而定。常用的消化酶类：37（3）酶消化液的配制）酶消化液的配制 除除了了商商业业销销售售的的成成品品，可可按按说说明明书书使使用用外外，还还可自行配制。可自行配制。0.1%胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶0.1g0.1%氯化钙氯化钙(pH7.8)100ml配配制制方方法法：先先配配制制0.1%的的CaCl2，用用0.1mol/L的的NaOH将将其其pH调调至至7.8，然然后后加加入入胰胰蛋蛋白白酶酶0.1g，溶溶解解之之。用用前前将将胰胰蛋蛋白白酶酶液液过过滤滤，并并在在水水浴浴中中预预热热至至37，室室温温下下消消化化时时间间530min，多多用用于于细细胞胞内内抗原的暴露。抗原的暴露。（3）酶消化液的配制380.4%胃蛋白酶胃蛋白酶 胃蛋白酶胃蛋白酶400mg0.1NHCl100ml多多用用于于间间质质组组织织免免疫疫组组化化染染色色切切片片的的消消化化，37下下消消化化时间约时间约30min。0.06%蛋白酶蛋白酶K 蛋白酶蛋白酶K0.06g0.05mol/LTris-HCl(PH7.5)100ml用法同上。用法同上。在在免免疫疫组组化化染染色色中中，有有时时经经过过度度固固定定的的标标本本，影影响响一一抗抗与与抗抗原原的的结结合合，用用蛋蛋白白酶酶溶溶液液消消化化，起起到到暴暴露露抗抗原原部部分分的的作作用用。消消化化时时间间应应根根据据不不同同组组织织而而异异。总总之之，在在保保持持组组织织形形态态不不破破坏坏的的前前提提下下，宜宜尽尽量量消消化化时时间间延延长长。以以上上三三种种酶酶消消化化液液，以第一种最为常用。以第一种最为常用。0.4%胃蛋白酶399.经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。10.用用与与制制备备二二抗抗相相同同的的动动物物非非免免疫疫血血清清孵孵育育切切片片防防止止一一抗抗的的非特异性吸附。非特异性吸附。组组织织中中非非抗抗原原抗抗体体反反应应出出现现的的阳阳性性染染色色称称为为非非特特异异性性背背景景染色染色。最最常常见见的的原原因因是是蛋蛋白白(第第一一抗抗体体)吸吸附附于于高高电电荷荷的的胶胶原原和和结缔组织成分上。结缔组织成分上。最最有有效效的的方方法法是是在在用用第第一一抗抗体体孵孵育育切切片片前前，用用与与制制备备第第二二抗抗体体相相同同动动物物的的非非免免疫疫血血清清封封闭闭组组织织上上带带电电荷荷基基团团，而而除除去与第一抗体的非特异性结合去与第一抗体的非特异性结合(在室温下进行在室温下进行)。非非免免疫疫血血清清的的稀稀释释度度1:51:20，还还可可加加入入BSA(bovineserum albumin)使使稀稀释释后后的的非非免免疫疫血血清清中中含含0.16%的的BSA，可可取取得得更更佳佳的的染染色色效效果果，阻阻止止非非特特异异性性背背景景染染色色。该方法是减少非特异性背景染色的有效方法。该方法是减少非特异性背景染色的有效方法。9.经热修复抗原或蛋白酶消化的切片经洗涤后进行下一步。4011用特异性一抗孵育切片用特异性一抗孵育切片 研研究究组组织织细细胞胞中中的的某某种种抗抗原原是是否否存存在在，应应用用免免疫疫组组化化染染色色，就就要要选选用用针针对对这这种种抗抗原原的的特特异异性性抗抗体体。现现在在国国际际上上有有许许多多公公司司生生产产免免疫疫组组化化试试剂剂，包包括括一一抗抗、二二抗抗、显显色色剂剂，并并制制成成了了成成套套的的试试剂剂盒盒，但但一一般般试试剂剂盒盒中中不不包包括括一一抗抗，研研究究者者可可根据一抗的种属性，选择含有与一抗相匹配的二抗的试剂盒。根据一抗的种属性，选择含有与一抗相匹配的二抗的试剂盒。一抗的种属来源一抗的种属来源 一一抗抗可可来来源源于于各各种种种种属属的的动动物物，常常见见是是来来自自家家兔兔、山山羊羊或或小小鼠鼠，偶偶见见来来自自马马。一一般般来来自自家家兔兔和和山山羊羊的的一一抗抗都都是是多多克克隆隆的的IgG抗抗体体，而而来来自自小小鼠鼠的的多多是是单单克克隆隆的的IgG抗抗体体。根根据据实实验动物或标本种属的不同，选择针对大鼠、小鼠或人的抗体。验动物或标本种属的不同，选择针对大鼠、小鼠或人的抗体。11用特异性一抗孵育切片41 抗体剂型及滴度检验抗体剂型及滴度检验 我我国国现现在在使使用用的的多多数数抗抗体体等等试试剂剂是是由由国国外外进进口口，包包括括一一抗和含二抗的试剂盒。抗和含二抗的试剂盒。国国外外生生产产的的一一抗抗一一般般浓浓度度都都是是100-200 g/ml，但但国国内内各各经经销销商商将将进进口口的的原原装装抗抗体体又又进进行行了了分分装装，如如分分成成0.1-0.2ml/瓶瓶等等，也经销也经销1ml/瓶抗体，价格各不相同。瓶抗体，价格各不相同。国国内内各各经经销销商商又又根根据据需需要要将将进进口口抗抗体体进进行行稀稀释释，销销售售的的品品种种又分为又分为即用型即用型和和浓缩型浓缩型(进口原装的抗体进口原装的抗体)两种。两种。在在免免疫疫组组化化染染色色中中，使使用用即即用用型型一一抗抗和和试试剂剂盒盒一一般般不不需需稀稀释释，直接在切片上滴加即可。直接在切片上滴加即可。浓浓缩缩型型必必须须在在稀稀释释后后才才能能使使用用，因因为为浓浓缩缩型型抗抗体体浓浓度度高高，可可引引起起严严重重的的非非特特异异性性染染色色，因因此此，必必须须在在正正式式染染色色前前先先用用切切片片对对不不同同滴滴度度的的抗抗体体染染色色效效果果进进行行评评价价，选选择择浓浓度度强强度度最最好好，非非特异性反应（背景染色）最低的抗体稀释度来进行正式染色。特异性反应（背景染色）最低的抗体稀释度来进行正式染色。抗体剂型及滴度检验42 一抗稀释滴度的评价一抗稀释滴度的评价（摸索实验条件时可以稀释度跨度大一些试）（摸索实验条件时可以稀释度跨度大一些试）切片编号 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5抗体稀释度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800特异性染色 +背景染色 +一抗稀释滴度的评价43一抗体的稀释一抗体的稀释 一一般般稀稀释释一一抗抗的的液液体体与与洗洗涤涤切切片片的的液液体体相相同同，即即0.01mol/LPBSpH7.2-7.4，为为进进一一步步保保证证减减少少背背景景染染色色，用用于于稀稀释释一一抗抗的的PBS中中也也应应加加入入制制备备二二抗抗的的同同种种动动物物的的非非免免疫疫正正常常血血清清，有有条件的还可加入条件的还可加入BSA，两者的浓度在，两者的浓度在1-2-5%即可。即可。一抗的孵育时间及条件一抗的孵育时间及条件 加加入入适适当当稀稀释释的的一一抗抗的的切切片片，可可在在常常温温下下或或37下下保保温温盒盒内内孵孵育育。经经过过正正常常二二抗抗同同种种动动物物非非免免疫疫血血清清孵孵育育后后的的切切片片不不能能用用PBS洗洗涤涤，在在去去除除多多余余的的非非免免疫疫血血清清后后，直直接接向向切切片片上上滴滴加稀释好的第一抗体加稀释好的第一抗体。孵育时间：。孵育时间：30-60分钟或更长。分钟或更长。如如果果待待检检的的抗抗原原量量很很少少，而而增增加加一一抗抗的的浓浓度度又又能能引引起起较较明明显显的的背背景景染染色色，可可增增加加一一抗抗的的稀稀释释倍倍数数，将将切切片片放放在在保保湿湿盒盒中置于中置于4冰箱内过夜孵育，可达到满意的效果。冰箱内过夜孵育，可达到满意的效果。一抗体的稀释4412PBS洗涤切片洗涤切片 将将用用一一抗抗孵孵育育后后的的切切片片用用PBST洗洗涤涤3次次，每每次次5min，用用冷冷PBS洗涤，可减少非特异性反应。洗涤，可减少非特异性反应。13用针对一抗的生物素化二抗孵育切片用针对一抗的生物素化二抗孵育切片 根根据据一一抗抗的的种种属属来来源源，选选择择相相应应的的二二抗抗。如如：一一抗抗是是家家兔兔抗抗某某种种抗抗原原抗抗体体，二二抗抗一一般般选选用用山山羊羊抗抗家家兔兔IgG抗抗体体。二二抗抗分分浓浓缩缩型型和和即即用用型型两两种种。即即用用型型二二抗抗不不需需稀稀释释，直直接接使使用用。浓浓缩缩型型者者一一般般用用PBS直直接接以以1:200-400倍倍稀稀释释使使用用，室室温温下下保保湿盒内孵育湿盒内孵育30-60min。试剂盒：浓缩型或即用型试剂盒：浓缩型或即用型SP试剂盒、试剂盒、ABC试剂盒试剂盒试剂盒中包含：试剂盒中包含：内源性过氧化物酶阻断剂内源性过氧化物酶阻断剂二抗的同种动物非免疫血清二抗的同种动物非免疫血清生物素标记的抗生物素标记的抗IgG抗体（二抗）抗体（二抗）SP试剂试剂ABC试剂（单独购买）试剂（单独购买）12PBS洗涤切片4514PBS洗涤切片洗涤切片5min3次次15滴加滴加SP试剂或试剂或ABC试剂试剂（1）生物素）生物素-抗生物素染色（抗生物素染色（SABC或或SP法）的显色原理法）的显色原理 ABC法的染色原理法的染色原理 很很早早以以前前研研究究者者就就注注意意到到给给动动物物饲饲以以大大量量的的鸡鸡蛋蛋白白，会会引引起起明明显显的的“维维生生素素H缺缺乏乏症症”，也也称称为为“蛋蛋白白质质伤伤害害”。经经研研究究发发现现，在在鸡鸡蛋蛋白白中中含含有有一一种种碱碱性性蛋蛋白白，分分子子量量为为68kD，属属于于糖糖蛋蛋白白，当当时时命命名名为为卵卵白白素素（avidin）。机机 体体 中中 还还 有有 一一 种种 物物 质质 叫叫 维维 生生 素素 H，又又 称称 为为 生生 物物 素素（biotin），是是一一种种小小分分子子的的维维生生素素，广广泛泛分分布布于于动动植植物物组组织织中中，以以辅辅酶酶的的形形式式参参与与各各种种羟羟化化酶酶反反应应，分分子子量量为为244D。14PBS洗涤切片5min3次46 卵卵白白素素具具有有4个个同同VitaminH（生生物物素素）亲亲和和力力极极高高的的结结合合点点。给给动动物物饲饲以以大大量量的的鸡鸡蛋蛋白白所所致致的的维维生生素素H缺缺乏乏，就就是是由由于于卵卵白白素素和和大大量量维维生生素素H结结合合所所致致。研研究究者者根根据据这这两两种种物物质质的的特特点点，提提出出了了卵卵白白素素-生生物物素素免免疫疫染染色色系系统统。由由于于习习惯惯上上将将维维生生素素H称称为为生生物物素素，为为便便于于理理解解，我我国国免免疫疫细细胞胞化化学学作作者者将将卵卵白白素素称称为为抗抗生生物物素素或或亲亲和和素素，因因此此卵卵白白素素-生生物物素素免免疫疫染色系统又称为染色系统又称为抗生物素抗生物素-生物素免疫染色法生物素免疫染色法。生生物物素素的的另另一一特特点点是是它它可可以以和和抗抗体体IgG的的Fc段段结结合合，不不影影响响IgG的的活活性性。同同时时，生生物物素素经经活活化化后后还还可可同同过过氧氧化化物物酶酶或或ALP等等结结合合，而而不不影影响响酶酶的的活活性性。根根据据上上述述这这些些抗抗生生物物素素-生生物物素素的的反反应应原原理理和和特特性性，1981年年许许世世明明设设计计出出了了免免疫疫组组织织化化 学学 染染 色色 的的 ABC法法（avidin-biotin peroxidase complexmethod，ABC），并已制成了商品化的试剂盒。），并已制成了商品化的试剂盒。卵白素具有4个同VitaminH47 ABC法法免免疫疫组组化化的的试试剂剂盒盒中中除除包包括括制制备备二二抗抗的的同同一一种种属属动动物物的的非非免免疫疫血血清清、生生物物素素标标记记的的二二抗抗外外，还还包包括括：A试试剂剂(抗抗生生物物素素)和和B试试剂剂(生生物物素素-过过氧氧化化物物酶酶复复合合物物)。在在使使用用前前半半小小时时，将将两两种种试试剂剂按按说说明明书书要要求求相相互互混混合合，形形成成复复合合物物，一一般般是是在在5ml的的PBS中中加加一一滴滴A试试剂剂(约约50 l)，混混匀匀后后再再加加一一滴滴B试试剂剂(约约50 l)，混混匀匀，半半小小时时后后加加至至经经过过生生物物素素标记的二抗孵育的切片上，室温下保湿盒内孵育标记的二抗孵育的切片上，室温下保湿盒内孵育30-60分钟。分钟。SP法的染色原理法的染色原理基基本本原原理理与与ABC法法相相似似，但但与与ABC法法稍稍有有不不同同，是是采采用用生生物物素素标标记记的的第第二二抗抗体体与与链链霉霉菌菌抗抗生生物物素素蛋蛋白白连连接接的的过过氧氧化物酶化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。ABC法免疫组化的试剂盒中除包括制备二48BiotinylatedsecondantibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimaryantibodyIllustrationofABCmethodAvidin-biotin-peroxidasecomplexBiotinylatedsecondantibodyP-49AgAgBiotinStreptavidinEnzyme:HRPorAPPrimaryantibodyBiotinylatedsecondaryantibodyIllustrationofSPmethodSPcomplexAgAgBiotinStreptavidinEnzyme:50 SABC法的染色原理及特点法的染色原理及特点(1)基本原理基本原理 链链酶酶亲亲和和素素是是一一种种从从链链霉霉菌菌培培养养物物中中提提取取的的蛋蛋白白质质，分分子子量量60kD，不不含含糖糖链链，等等电电点点PI6.0。与与亲亲和和素素相相同同也也有有四四个个生生物物素素结结合合点点，亲亲和和力力极极高高。与与亲亲和和素素相相比比是是一一种种更更近近于于完完美美的的生生物物素素结结合合蛋蛋白白。链链酶酶亲亲和和素素同同一一定定浓浓度度的的生生物物素素化化酶酶混混合合后后，就就能能形形成成链链酶酶亲亲和和素素-生生物物素素-酶酶复复合合物物。这这种种复复合合物物中中至至少少存存在在一一个个尚尚未未被被生生物物素素占占据据的的亲亲和和素素结结合合位位点点，可可以以和和各各种种生生物物素素标标记记的的抗抗体体结结合合。这这种种复复合物即是合物即是SABC(streptavidin-biotincomplex)。(2)SABC的特点的特点高高敏敏感感性性；低低背背景景；简简便便快快速速；结结果果稳稳定定SABC法的染色原理及特点51EnVison系统染色原理系统染色原理与与ABC法法、SP法法及及SABC法法的的染染色色原原理理均均不不同同，是是将将二二抗抗与与多多聚聚螯螯合合物物酶酶（HRP或或AP）通通过过化化学学方方法法连连接接在在一一起起，形形成成多多聚聚螯螯合合物物，在在多多聚聚螯螯合合物物上上含含有有大大量量的的酶酶分分子子和和二二抗抗，因因此此，比比ABC法法、SP法法和和SABC法法具具有有更更显显著著的的放放大大作作用用，可可高高出出几几十十倍倍。由由于于多多聚聚物物在在人人或或动动物物体体内内不不存存在在，因因此此，无无非非特特异异性性染染色色，背背景着色极轻。景着色极轻。染染色色步步骤骤简简便