免疫组织化学技术培训ppt课件

免疫组织化学技术免疫组织化学技术免疫组织化学技术1免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免免疫细胞化学疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。免疫组织化学技术2免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称 基本原理基本原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使性结合的原理，通过化学反应使标标记抗体记抗体的显色剂的显色剂(荧光素、酶、金荧光素、酶、金属离子、同位素属离子、同位素)显色来确定组织显色来确定组织细胞内抗原细胞内抗原(多肽和蛋白质多肽和蛋白质)，对其，对其进行定位、定性及定量的研究。进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学技术3 基本原理免疫组织化学技术3免疫组化的特点免疫组化的特点 特异性强特异性强 敏感性高敏感性高 定位准确、形态与功能相结合定位准确、形态与功能相结合 免疫组织化学技术4免疫组化的特点免疫组织化学技术4 免疫组化的作用免疫组化的作用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如如肽类肽类、激素激素、神经递质神经递质、细胞因细胞因子子、受体受体、表面抗原表面抗原等等均可用免等等均可用免疫组织化学方法显示疫组织化学方法显示。免疫组织化学技术5 免疫组化的作用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如 实验所用标本实验所用标本石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究。细胞标本组织印片 细胞爬片 细胞涂片组织标本石蜡切片冰冻切片病理切片组织芯片免疫组织化学技术6 实验所用标本石蜡切片是制作组织标本最常用、最 实验设备实验设备 恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊片机、烤片机、冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以及离心机和免疫组化试剂等免疫组织化学技术7 实验设备 恒温冰冻切片机、脱免疫组织化学技术8免疫组织化学技术8免疫组织化学技术9免疫组织化学技术9 脱水机、石蜡包埋机免疫组织化学技术10 免疫组化技术分类免疫组化技术分类 1、免疫荧光方法、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法、放射免疫自显影法免疫组织化学技术11 免疫组化技术分类 1、免疫荧光方法免疫组酶联免疫组织化学酶联免疫组织化学 ABC法法 S-P法法免疫组织化学技术12酶联免疫组织化学 ABC法免疫组织化学技术12 免疫组化操作步骤免疫组化操作步骤免疫组织化学技术13 免疫组化操作步骤免疫组织化学技术13一一.石蜡切片制作石蜡切片制作1 1、固定固定：取组织，用：取组织，用PBSPBS冲洗，放入冲洗，放入4%4%多聚甲醛磷酸盐缓冲多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定液内固定12h12h2 2、脱水脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3 3次，再用次，再用50%50%酒精冲酒精冲洗洗2 2次，用酒精逐级脱水，次，用酒精逐级脱水，70%70%酒精酒精1 1天，天，80%80%酒精过夜，酒精过夜，95%95%酒精酒精3h3h，无水酒精（，无水酒精（）、（）、（）各）各2h2h3 3、透明透明：1:11:1无水酒精二甲苯无水酒精二甲苯45min45min，二甲苯（，二甲苯（）、）、（）各）各30min30min4 4、包埋包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:11:1二甲苯石蜡二甲苯石蜡（5858）45min45min，石蜡（，石蜡（）、（）、（）、（）、（）共）共2.5h2.5h，用石蜡（用石蜡（）包埋组织）包埋组织免疫组织化学技术14一.石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7m，的石蜡带6、贴片：将组织石蜡块在50温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上 （洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）7、烤片：68恒温箱内烤片2h免疫组织化学技术155、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7m，的二二.SP.SP（链霉菌抗生物素蛋白（链霉菌抗生物素蛋白-过氧过氧化物酶连结）三步法染色步骤化物酶连结）三步法染色步骤1 1、脱蜡、水化、脱蜡、水化 6020分钟二甲苯2 10分钟100%的绝对乙醇:25分钟;95%ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟80%ethanol 2 minutes；70%ethanol 2 minutes；distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟PBS洗3次3 min。免疫组织化学技术16二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法染色步骤2、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性3、PBS冲洗2-3次，每次5min4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温5、PBS冲洗2-3次，每次5min6、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体7、滴加抗50l，室温静置1h，或者371h，或者4过夜（需在37复温45min）8、PBS冲洗2-3次，每次5min免疫组织化学技术172、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min9、滴加辣根过氧化物酶标记的抗4050l，室温静置1h，或371h10、PBS冲洗2-3次，每次5min11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37孵育30min-1h12、PBS冲洗2-3次，每次5min13、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）（A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）免疫组织化学技术189、滴加辣根过氧化物酶标记的抗4050l，室温静置1h1414、自来水冲洗、自来水冲洗1010分钟终止反应分钟终止反应1515、复染：苏木精复染、复染：苏木精复染2min2min，盐酸酒精分化，盐酸酒精分化1616、自来水冲洗、自来水冲洗10-15min10-15min1717、常规脱水、常规脱水 50%ethanol 1-2 min50%ethanol 1-2 min，70%ethanol 1-2 min 70%ethanol 1-2 min 95%ethanol 1-2 min 95%ethanol 1-2 min；95%ethanol 1-2 min 95%ethanol 1-2 min；100%absolute ethanol:(1-2)min 100%absolute ethanol:(1-2)min。透明：透明：Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min2)min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检盖上）、镜检免疫组织化学技术1914、自来水冲洗10分钟终止反应免疫组织化学技术19三三.二步法二步法免疫免疫组化染色步骤组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBSPBSPBSPBS冲洗冲洗冲洗冲洗3 3 3 3次，每次次，每次次，每次次，每次3 3 3 3分钟分钟分钟分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复 0.3%0.3%0.3%0.3%过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断过氧化氢甲醇液阻断20202020分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性化物酶的活性化物酶的活性化物酶的活性PBSPBSPBSPBS冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡冲洗、浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次正常山羊血清室温封闭正常山羊血清室温封闭正常山羊血清室温封闭正常山羊血清室温封闭10101010分钟分钟分钟分钟免疫组织化学技术20三.二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯免疫甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，甩去血清，加入适当稀释的一抗，37373737孵育孵育孵育孵育60606060分钟或分钟或分钟或分钟或4444过夜过夜过夜过夜PBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，滴加多聚螯合物，37373737孵育孵育孵育孵育30303030分钟分钟分钟分钟PBSPBSPBSPBS冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡冲洗，浸泡5 5 5 5分钟，分钟，分钟，分钟，3 3 3 3次次次次新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液新鲜配置酶底物显色液DABDABDABDAB显色显色显色显色3 3 3 310101010分钟分钟分钟分钟流水冲洗流水冲洗流水冲洗流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。苏木素复染，脱水，透明，封片。苏木素复染，脱水，透明，封片。苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照显微镜观察拍照显微镜观察拍照显微镜观察拍照IPPIPPIPPIPP软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度软件分析光密度免疫组织化学技术21甩去血清，加入适当稀释的一抗，37孵育60分钟或4过夜免几种抗原修复方法几种抗原修复方法真空负压抗原修复法：真空负压抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇真空负压处理甲醇真空负压处理甲醇真空负压处理甲醇真空负压处理5 5 5 5分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M0.01M0.01M0.01M柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（PH6.0PH6.0PH6.0PH6.0），真空负压），真空负压），真空负压），真空负压干燥箱预先调至干燥箱预先调至干燥箱预先调至干燥箱预先调至95959595，真空负压处理，真空负压处理，真空负压处理，真空负压处理10101010分钟。分钟。分钟。分钟。待修复注降至室温的一，待修复注降至室温的一，待修复注降至室温的一，待修复注降至室温的一，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按次，随后按次，随后按次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。选好的免疫组化染色方法进行染色。选好的免疫组化染色方法进行染色。选好的免疫组化染色方法进行染色。免疫组织化学技术22几种抗原修复方法真空负压抗原修复法：切片脱蜡至水。0微波辐射抗原修复法：微波辐射抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理甲醇处理甲醇处理甲醇处理10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。0.01M0.01M0.01M0.01M柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（PH6.0PH6.0PH6.0PH6.0），于微波炉内），于微波炉内），于微波炉内），于微波炉内微波辐射微波辐射微波辐射微波辐射10101010分钟，如检测分钟，如检测分钟，如检测分钟，如检测ErErErEr和和和和PrPrPrPr则需要则需要则需要则需要20202020辐射分辐射分辐射分辐射分钟左右。钟左右。钟左右。钟左右。待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，待修复液降至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按选好次，随后按选好次，随后按选好次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。的免疫组织化学的染色方法进行染色。的免疫组织化学的染色方法进行染色。的免疫组织化学的染色方法进行染色。免疫组织化学技术23微波辐射抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲高压抗原修复法：高压抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1 1 1 14 4 4 4分分分分钟。钟。钟。钟。待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，待修复液恢复至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按选次，随后按选次，随后按选次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。好的免疫组织化学染色方法进行染色。好的免疫组织化学染色方法进行染色。好的免疫组织化学染色方法进行染色。免疫组织化学技术24高压抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处电炉加热抗原修复法电炉加热抗原修复法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达用温度计测量温度，当达92929292后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，后，即可拔离电源，当温度低于当温度低于当温度低于当温度低于92929292时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续时，再插上电源，如此反复持续至至至至10101010分钟左右。分钟左右。分钟左右。分钟左右。待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，待抗原修复液降至室温后，PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，随后按次，随后按次，随后按次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。选定的免疫组化染色方法进行染色。免疫组织化学技术25电炉加热抗原修复法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲胰蛋白酶消化法：胰蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。切片脱蜡至水。0.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O20.3%H2O2甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片甲醇处理切片10101010分钟。分钟。分钟。分钟。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。自来水洗，蒸馏水洗。PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次，次，1 1 1 1分钟分钟分钟分钟/次。次。次。次。滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20202020分钟左右。分钟左右。分钟左右。分钟左右。PBSPBSPBSPBS洗洗洗洗3 3 3 3次，次，次，次，2 2 2 2分钟分钟分钟分钟/次。次。次。次。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。后按选好的免疫组化染色方法进行染色。免疫组织化学技术26胰蛋白酶消化法：切片脱蜡至水。0.3%H2O2甲醇处 所用试剂所用试剂1.PBS：0.01M磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制-取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 3.63g或Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，常温保存备用2.包埋剂包埋剂包埋剂包埋剂：石蜡：石蜡：石蜡：石蜡3.3.3.3.防脱剂防脱剂防脱剂防脱剂：多聚赖氨酸（：多聚赖氨酸（：多聚赖氨酸（：多聚赖氨酸（PLL5g+PLL5g+PLL5g+PLL5g+蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml1000ml1000ml）、APESAPES（3-3-氨丙基氨丙基-3-3-乙氧基甲硅烷）乙氧基甲硅烷）免疫组织化学技术27 所用试剂1.PBS：0.01M磷酸盐缓冲4.4.固定液固定液固定液固定液：4%4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液多聚甲醛磷酸盐缓冲液多聚甲醛磷酸盐缓冲液多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4)(pH7.4)配制配制 a.0.1M a.0.1M磷酸盐缓冲液：取磷酸盐缓冲液：取A A液液400ml400ml与与B B液液80ml80ml混合后，调混合后，调pHpH于于7.47.4，再定容至，再定容至500ml500ml A A液：液：0.1mol/L Na2HPO40.1mol/L Na2HPO4（Na2HPO412H2O Na2HPO412H2O 35.8g35.8g加水定容至加水定容至1000ml1000ml）B B液：液：0.1mol/L NaH2PO40.1mol/L NaH2PO4（NaH2PO42H2O NaH2PO42H2O 15.6g15.6g加水定容至加水定容至1000ml1000ml）b.4%b.4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取多聚甲醛磷酸盐缓冲液：取20g20g多聚甲醛溶多聚甲醛溶于于500ml 0.1M500ml 0.1M磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约磷酸盐缓冲液中，加热并搅拌约2-2-3h3h后溶解后溶解5.5.细胞通透液细胞通透液：由终浓度分别为：由终浓度分别为0.3%0.3%双氧水和双氧水和0.3%Triton X-1000.3%Triton X-100（曲拉通曲拉通X-100 X-100 又称清洁剂又称清洁剂）混合而成。配制方法是先用微波加热的混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS36 ml PBS，再接着加，再接着加120 ul TritonX-100120 ul TritonX-100，并加热一会儿，并加热一会儿，冷却至临用前加冷却至临用前加0.4 ml 300.4 ml 30H2O2H2O2。免疫组织化学技术284.固定液：4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4)免疫组织化6.6.抗原修复液抗原修复液抗原修复液抗原修复液：0.01M0.01M枸橼酸缓冲液（枸橼酸缓冲液（枸橼酸缓冲液（枸橼酸缓冲液（PH 6.0PH 6.0），或或0.01M0.01M柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（柠檬酸盐缓冲液（pH6.0pH6.0）配制配制 -取取A A液液8ml8ml与与B B液液42ml42ml混合后加水至混合后加水至400ml400ml，调，调pHpH于于6.06.0，再定容至，再定容至500ml500mlA A液：液：0.1mol/L 0.1mol/L 柠檬酸（柠檬酸（C6H8O7H2O 21.01gC6H8O7H2O 21.01g加加水定容至水定容至1000ml1000ml）B B液：液：0.1mol/L 0.1mol/L 柠檬酸钠（柠檬酸钠（Na3C6H5O72H2O Na3C6H5O72H2O 29.41g29.41g加水定容至加水定容至1000ml1000ml）7.7.5 5羊血清或封闭血清羊血清或封闭血清，用，用PBSPBS稀释。稀释。含含0.030.03H2O2H2O2的的0.050.05DABDAB二氨基联苯胺二氨基联苯胺 （避光）（避光）：用：用20DAB20DAB（1 1，10 mg/ml10 mg/ml）5 ul5 ul0.1 ul 0.1 ul 30%H2O230%H2O295 ul PBS95 ul PBS。8.8.一抗一抗（特异结合底物（特异结合底物（特异结合底物（特异结合底物1:1001:100）、二抗均用、二抗均用PBSPBS稀释。稀释。9.9.二甲苯、梯度酒精二甲苯、梯度酒精（10010022、9595、8080、7070、5050）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。10.10.显色剂显色剂：DABDAB试剂盒、苏木素染液试剂盒、苏木素染液免疫组织化学技术296.抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0），或0免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则1 1、每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基、每批染色都要有特异性阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做判断；础，才能对染色结果做判断；2 2、阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能、阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视视 为阳性；为阳性；3 3、阴性结果不能视为抗原不表达，即阴性结果无判、阴性结果不能视为抗原不表达，即阴性结果无判断意义；阳性结果有强弱、多少之分，哪怕一个细断意义；阳性结果有强弱、多少之分，哪怕一个细胞阳性，只要是在抗原所表达部位，也有诊断意义。胞阳性，只要是在抗原所表达部位，也有诊断意义。4 4、当免疫组化结果与、当免疫组化结果与HEHE切片诊断有矛盾时，以切片诊断有矛盾时，以HEHE切切片诊断为准。片诊断为准。5 5、应用、应用“反正法反正法”确保免疫组化在诊断中的准确性。确保免疫组化在诊断中的准确性。6 6、避免假阴性和假阳性的发生。、避免假阴性和假阳性的发生。免疫组织化学技术30免疫组化结果的判断原则1、每批染色都要有特异性阳性对照和阴性 免疫组化的应用范围在常规病理诊断中应用免疫组化主要有在常规病理诊断中应用免疫组化主要有8 8个方面：个方面：1 1、对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断；、对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断；2 2、对肿瘤的良恶性进行综合判断；、对肿瘤的良恶性进行综合判断；3 3、发现微小转移灶；、发现微小转移灶；4 4、激素受体的检测以指导临床治疗；、激素受体的检测以指导临床治疗；5 5、激素类细胞的定性和定位，以明确内分泌、激素类细胞的定性和定位，以明确内分泌 细胞细胞的类型和功能状态。的类型和功能状态。6 6、指导肿瘤预后，如、指导肿瘤预后，如PgPPgP、CerbB-2CerbB-2、P53P53等。等。7 7、指导肿瘤分期；、指导肿瘤分期；8 8、免疫性疾病的辅助诊断，如肾小球肾炎、某些皮、免疫性疾病的辅助诊断，如肾小球肾炎、某些皮肤疾病等组织内免疫复合物的检测。肤疾病等组织内免疫复合物的检测。免疫组织化学技术31 免疫组化的应用范围在常规病理诊断中应用免疫组化免疫组化染色中的常见问题及对策 免疫组化操作方法比较简单，然而在实际工作中也免疫组化操作方法比较简单，然而在实际工作中也会遇到一些麻烦，如会遇到一些麻烦，如脱片、无特异性表达或表达脱片、无特异性表达或表达脱片、无特异性表达或表达脱片、无特异性表达或表达较弱、染色过强、背景染色强、定位不好较弱、染色过强、背景染色强、定位不好较弱、染色过强、背景染色强、定位不好较弱、染色过强、背景染色强、定位不好等。引等。引起上述问题的原因较多，主要有组织固定、脱水起上述问题的原因较多，主要有组织固定、脱水不良或浸蜡温度过高导致抗原丢失；抗原未修复；不良或浸蜡温度过高导致抗原丢失；抗原未修复；抗体或工作液失效、抗体稀释不当；在一定温度抗体或工作液失效、抗体稀释不当；在一定温度下抗原孵育时间不足、一抗和二抗不匹配；显色下抗原孵育时间不足、一抗和二抗不匹配；显色剂失效或配置方法失误等。因此，良好的组织固剂失效或配置方法失误等。因此，良好的组织固定和脱水及适当的浸蜡温度是做好免疫组化的前定和脱水及适当的浸蜡温度是做好免疫组化的前提。中性福尔马林固定有利于正确结果的显示。提。中性福尔马林固定有利于正确结果的显示。免疫组织化学技术32免疫组化染色中的常见问题及对策 免疫组化操作方法比较简单，1、脱片的可能原因与对策、脱片的可能原因与对策整批切片脱片整批切片脱片可能是载玻片未处理，玻片上有油污未清洗或未涂抹防脱片胶，或烤片时间不足致粘片不牢固。单张切片及整块组织脱片单张切片及整块组织脱片除了上述原因外，需考虑抗体热修复时液体温度过高和时间过长，或冲洗时用力过猛等因素。免疫组织化学技术331、脱片的可能原因与对策整批切片脱片免疫组织化学技术332、无特异性表达的原因、无特异性表达的原因 问问问问 题题题题确认染色过程次序是否正确认染色过程次序是否正确；是否忽略了某一过程；确；是否忽略了某一过程；是否孵育了足够的时间；是否孵育了足够的时间；是否使用了正确的抗体，是否使用了正确的抗体，以及二抗是否和一抗一致以及二抗是否和一抗一致匹配。匹配。底物显色系统是否失效底物显色系统是否失效。解解解解 决决决决 方方方方 法法法法重新实验，设立阳性对照，重新实验，设立阳性对照，以验证实验结果；仔细确以验证实验结果；仔细确定一抗与二抗种属；定一抗与二抗种属；更换显色剂（更换显色剂（DABDAB或或AECAEC）;不得使用过期试剂不得使用过期试剂盒，不同批号试剂盒不能盒，不同批号试剂盒不能混用；混用；免疫组织化学技术342、无特异性表达的原因 问 题 3、表达较弱、表达较弱 问问问问 题题题题标本固定方式不当或固定标本固定方式不当或固定时温度过高，使部分组织时温度过高，使部分组织抗原被破坏；抗原被破坏；抗原修复方式不当；抗原修复方式不当；抗体浓度过低，或者孵育抗体浓度过低，或者孵育的温度、时间不够；的温度、时间不够；冲洗后切片残留多余缓冲洗后切片残留多余缓冲液。如果阴性对照没有冲液。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，应考虑查而标本弱阳性，应考虑查标本本身原因。标本本身原因。解解解解 决决决决 方方方方 法法法法新鲜组织及时固定，防止新鲜组织及时固定，防止自溶，固定时间不超过自溶，固定时间不超过2424小时；小时；封闭时间不超过封闭时间不超过1010分钟，分钟，或参考产品说明；注意复或参考产品说明；注意复染时间染时间提高抗体浓度，孵育时间提高抗体浓度，孵育时间不少于不少于6060分钟（室温低于分钟（室温低于1515，改在，改在37 37 温箱孵温箱孵育或育或4 4 冰箱过夜）冰箱过夜）免疫组织化学技术353、表达较弱 问 题 4、染色过强 问问 题题抗体浓度过高或孵育抗体浓度过高或孵育时间过长时间过长孵育温度过高，孵育温度过高，3737显色速度过快或显色显色速度过快或显色时间过长；时间过长；解解解解 决决决决 方方方方 法法法法降低抗体浓度、孵育降低抗体浓度、孵育时间；时间；室温室温1 1小时或小时或4 4过夜；过夜；缩短显色时间；显色缩短显色时间；显色时间不超过时间不超过5 51010分钟，分钟，以显微镜下观察为准；以显微镜下观察为准；免疫组织化学技术364、染色过强 问 题 解 决 方 法5、非特异性背景染色 问问问问 题题题题 操作过程中冲洗不充分；操作过程中冲洗不充分；加试剂后切片干燥；加试剂后切片干燥；组织切片折叠；组织切片折叠；组织中含过氧化物酶未阻断；组织中含过氧化物酶未阻断；组织中含内源性生物素；组织中含内源性生物素；组织抗原弥散；组织抗原弥散；切片粘附剂过厚；切片粘附剂过厚；血清蛋白封闭不充分；血清蛋白封闭不充分；解解解解 决决决决 方方方方 法法法法 每步冲洗每步冲洗3535；防止切片干燥（必要时重做）防止切片干燥（必要时重做）勿以折叠处观察染色结果；勿以折叠处观察染色结果；可配置新鲜可配置新鲜3%3%双氧水封闭，孵双氧水封闭，孵育时间延长；育时间延长；正常非免疫动物血清再封闭；正常非免疫动物血清再封闭；组织及时固定，固定液要合标组织及时固定，固定液要合标准准 重新配置粘附剂涂液；重新配置粘附剂涂液；延长血清封闭时间；延长血清封闭时间；免疫组织化学技术375、非特异性背景染色 问 题 免疫组织化学技术培训ppt课件387、封片时的注意事项封片时动作快封片时动作快切片入二甲苯后起白雾，为脱水未尽切片入二甲苯后起白雾，为脱水未尽记住切片的组织面记住切片的组织面防脱片处理防脱片处理盖片必须大于组织块盖片必须大于组织块封固剂不要滴得太多，也不要太少，防止气封固剂不要滴得太多，也不要太少，防止气 泡泡产生。产生。免疫组织化学技术397、封片时的注意事项封片时动作快免疫组织化学技术39注意事项一、抗体的保存一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在浓缩抗体：有效期内，只需放在 4 4 4 4 冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达冰箱内，保存时间可达1-31-31-31-3年。年。年。年。即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在即用型抗体：理论上在4 4 4 4 冰箱内冰箱内冰箱内冰箱内 可保存半年左右。可保存半年左右。可保存半年左右。可保存半年左右。PBSPBSPBSPBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置只可放置只可放置只可放置1-1-1-1-2 2 2 2个月。个月。个月。个月。免疫组织化学技术40注意事项一、抗体的保存免疫组织化学技术40二、出现假阳性的原因二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如组织切片质量不佳，造成假象，如 刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作 为判断阳性的依据。为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧出血和坏死：红细胞的内源性过氧 化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化 物酶均可出现假阳性反应。物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应。抗体的交叉反应。免疫组织化学技术41二、出现假阳性的原因免疫组织化学技术41三、出现假阴性的原因三、出现假阴性的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。无法补救。无法补救。无法补救。固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%10%10%10%中性福尔马林。中性福尔马林。中性福尔马林。中性福尔马林。抗体浓度过低。抗体浓度过低。抗体浓度过低。抗体浓度过低。孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液pHpHpHpH值不正确。值不正确。值不正确。值不正确。免疫组织化学技术42三、出现假阴性的原因免疫组织化学技术42免疫组织化学技术43免疫组织化学技术43免疫组织化学技术44免疫组织化学技术44免疫组织化学技术45免疫组织化学技术45免疫组织化学技术46免疫组织化学技术46免疫组织化学技术47免疫组织化学技术47免疫组织化学技术48免疫组织化学技术48免疫组织化学技术49免疫组织化学技术49免疫组织化学技术50免疫组织化学技术50免疫组织化学技术51免疫组织化学技术51免疫组织化学技术52免疫组织化学技术52免疫组织化学技术53免疫组织化学技术53必须严格设置阳性对照和阴性对照。必须严格设置阳性对照和阴性对照。DABDAB有致癌性，用后不应随处倒弃。有致癌性，用后不应随处倒弃。免疫组织化学技术54必须严格设置阳性对照和阴性对照。免疫组织化学技术54免疫组织化学技术55Thank You!免疫组织化学技术55