尿激酶原的研究概况课件

一、前言尿激酶原（Pro-urokinase,Pro-UK）单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(Single-Chain Urokinase-type Plasminogen Activtor)尿型纤溶酶原激活剂(Urinary-type plasminogen activtor)一、前言1二、尿激酶原的研究历史二、尿激酶原的研究历史1973 1973 年年BernikBernik从组织培养液中发现尿激酶原。从组织培养液中发现尿激酶原。1970 1970 年代末到年代末到19801980年代初人们先后从新鲜人年代初人们先后从新鲜人 尿、人和动物的正常细胞、肿瘤细胞中尿、人和动物的正常细胞、肿瘤细胞中 纯化出单链尿激酶并命名为尿激酶原。纯化出单链尿激酶并命名为尿激酶原。1980 1980 年代中期开始，欧美日等发达国家用基年代中期开始，欧美日等发达国家用基 因重组技术克隆表达尿激酶原的工程菌因重组技术克隆表达尿激酶原的工程菌 或工程细胞株纯化制备尿激酶原。或工程细胞株纯化制备尿激酶原。二、尿激酶原的研究历史1973 年Bernik从组织培养液中21985 1985 国际血栓形成和止血委员会正式命名尿激国际血栓形成和止血委员会正式命名尿激 酶原为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂。酶原为单链尿激酶型纤溶酶原激活剂。1986 1986 欧美开始小规模的临床研究，到欧美开始小规模的临床研究，到19941994年以年以 后开始大规模的临床试验，德国用大肠杆后开始大规模的临床试验，德国用大肠杆 菌表达的尿激酶原菌表达的尿激酶原(Saruplase)(Saruplase)先后完成先后完成 了了67756775例心肌梗塞病人的临床试验。例心肌梗塞病人的临床试验。1994 1994 美国美国AbotteAbotte公司研制的尿激酶原公司研制的尿激酶原(Prolyse)(Prolyse)做了做了400400多例心肌梗塞和脑梗塞病人的临多例心肌梗塞和脑梗塞病人的临 床试验，现正在做第床试验，现正在做第期临床试验。期临床试验。1985 国际血栓形成和止血委员会正式命名尿激3三、国内研究概况三、国内研究概况 七七五五期期间间，北北京京大大学学、南南京京大大学学和和军军事事医医学学科科学学院院生生物物工工程程研研究究所所开开始始研研究究重重组组人人尿尿激激酶酶原原，都都得得到到国国家家科科技技部部 863 863 委委员员会会的的资资助助。我我所所率率先先获获得得全全长长人人尿尿酶酶原原基基因因cDNAcDNA克克隆隆，接接着着又又构构建建出出高高产产工工程程细细胞胞株株。并并于于八八五五中中期期和和九九五五期期间间完完成成了了重重组组尿尿激激酶酶原原的的中中试试工工艺艺研研究究和和临临床床前前安安全全评评价价，于于20012001年完成年完成期临床试验。期临床试验。三、国内研究概况 七五期间，北京大学、南京大学和4五、五、pro-UKpro-UK的化学结构的化学结构 pro-UKpro-UK由由411411个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成的的单单链链多多肽肽（简简称称pro-UKpro-UK），分分子子量量约约为为49KD49KD左左右右，在在302302位位天天冬冬酰酰胺胺残残基基有有一一个个糖糖链链，分分子子量量约约2320Da2320Da，由由岩岩藻藻糖糖、甘甘露露糖糖、半半乳乳糖糖和和N-N-乙乙酰酰-葡葡萄萄糖糖胺胺组组成成，在在第第1818位位苏苏氨氨酸酸残残基基上上有有一一个个糖糖基基岩岩藻藻糖糖，分分子子量量180Da180Da。其其一一级级结结构构如下图所示：如下图所示：五、pro-UK的化学结构 pro-U5尿激酶原的结构尿激酶原的结构尿激酶原的结构6 Pro-UKPro-UK属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有1212对二硫键。对二硫键。pro-UKpro-UK分子按结构功能可分为四个分子按结构功能可分为四个结构域，依次为：结构域，依次为：（1 1）表皮生长因子结构域）表皮生长因子结构域(第第5-495-49位氨基酸残位氨基酸残基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促基），与表皮生长因子高度同源，其功能与促进进pro-UKpro-UK的生物合成有关，该区有三对二硫键，的生物合成有关，该区有三对二硫键，即在即在1111与与1919、1313与与3131、3333与与4242氨基酸残基之间氨基酸残基之间各有一对二硫键；各有一对二硫键；（2 2）KringleKringle（指环）结构域（第（指环）结构域（第50-13650-136位氨位氨基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞膜蛋基酸残基），其功能与血小板蛋白和细胞膜蛋白结合有关，该区也有三对二硫键，即白结合有关，该区也有三对二硫键，即 50 50 与与130130、7171与与113113、102102与与126126氨基酸残基之间各有氨基酸残基之间各有一对二硫键；一对二硫键；Pro-UK属于丝氨酸蛋白酶类，分子内有12对二硫键7（3 3）丝氨酸蛋白酶结构域）丝氨酸蛋白酶结构域(144-411(144-411位氨位氨基酸残基基酸残基),),位于其羧基端的位于其羧基端的HisHis204204、AspAsp255255与与SerSer356 356 三个氨基酸残基构成该酶的活性三个氨基酸残基构成该酶的活性中心，中心，Asn302 Asn302 为糖化位点为糖化位点,该区共有该区共有5 5对对二硫键，即在二硫键，即在 148-279 148-279、189-205189-205、197-197-268268、293-258293-258和和368-380368-380氨基酸残基之间氨基酸残基之间各有一对二硫键；各有一对二硫键；（4 4）连接区）连接区(第第136-143136-143位氨基酸残基位氨基酸残基)。（3）丝氨酸蛋白酶结构域(144-411位氨基酸残基),位于8六、六、pro-UKpro-UK的理化性质的理化性质 pro-UKpro-UK分子有四个酶切位点：分子有四个酶切位点：（1 1）第第一一个个酶酶切切位位点点在在158158位位赖赖氨氨酸酸与与159159位位异异亮亮氨氨酸酸之之间间，纤纤溶溶酶酶、激激肽肽释释放放酶酶、胰胰蛋蛋白白酶酶和和半半胱胱氨氨酸酸内内肽肽酶酶及及因因子子 可可水水解解该该酶酶切切位位点点之之间间的的肽肽键键。该该位位点点被被切切开开后后，148148位位与与279279位位的的二二硫硫键键将将A A链链和和B B链链相相连连接接，A A链链C C末末端端的的赖赖氨氨酸酸自自动动脱脱落落，pro-UKpro-UK即即变变成成具具有有高高度度催催化化活性的双链尿激酶活性的双链尿激酶(UK)(UK)；六、pro-UK的理化性质 pro-UK分子有四个酶9（2 2）第二个酶切位点在第二个酶切位点在135135和和136136两个赖两个赖氨酸之间，高分子双链氨酸之间，高分子双链UKUK可被纤溶酶继续可被纤溶酶继续水解该酶切位点，并脱去水解该酶切位点，并脱去N-N-末端的第末端的第 136 136位赖氨酸，变成低分子双链位赖氨酸，变成低分子双链UKUK，分子量为，分子量为33KD33KD，其活性与高分子，其活性与高分子UKUK相同；相同；（3 3）第三个酶切位点在）第三个酶切位点在 143 143 位谷氨酸与位谷氨酸与144 144 位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键位亮氨酸之间，蛋白酶可裂解该肽键产生分子量为产生分子量为32KD32KD的单链低分子尿激酶原的单链低分子尿激酶原(pro-UK)(pro-UK)，其溶血栓活性生花特性与高分，其溶血栓活性生花特性与高分子子pro-UKpro-UK相似；相似；（2）第二个酶切位点在135和136两个赖氨酸之间，高分子10（4 4）第第四四个个酶酶切切位位点点在在156156位位的的精精氨氨酸酸与与157157位位的的苯苯丙丙氨氨酸酸之之间间，凝凝血血酶酶可可水水解解该该位位点点的的肽肽键键，生生成成双双链链pro-UKpro-UK，由由148148位位与与279279位位的的二二硫硫键键将将A A、B B两两条条链链相相连连接接起起来来，其其活活性性只只有有双双链链UKUK的的1/5001/500，但但其其催催化化活活性性与与生生化化特特性性与与单单链链pro-UKpro-UK相相似似。纤纤溶溶酶酶可可水水解解B B链链N-N-端端第第157157和和158158两两 个个 氨氨 基基 酸酸，生生 成成 双双 链链 UKUK。pro-UKpro-UK在在溶溶液液中中不不稳稳定定，容容易易逐逐渐渐水水解解成成小小分分子子尿尿激激酶酶原原或或变变成成双双链链尿尿激激酶酶，但但其其冻冻干干品品在在44以下是稳定的以下是稳定的。（4）第四个酶切位点在156位的精氨酸与157位的苯丙氨酸之11七、尿激酶原的血栓溶解特异性七、尿激酶原的血栓溶解特异性1 1、pro-UKpro-UK本本身身活活性性很很低低，在在血血浆浆中中只只有有微微弱弱的的活活性性，对对体体内内纤纤溶溶系系统统影影响响很很小小，当当给给药药剂剂量量太太大大时时（超超过过1mg/kg1mg/kg），部部分分水水解解成成双双链链UKUK，则则对对体体内内纤纤溶溶系系统统有有影影响响。pro-UKpro-UK到到达达血血栓栓表表面面，被被那那里里的的纤纤溶溶酶酶激激活活，部部分分变变成成双双链链UKUK，后后者者激激活活结结合合在在血血栓栓表表面面构构型型有有所所改改变变的的纤纤溶溶酶酶原原变变成成纤纤溶溶酶酶，使使血血栓栓纤纤维维蛋蛋白白部部分分溶解。溶解。七、尿激酶原的血栓溶解特异性1、pro-UK本身活性很低，在122 2、当当血血栓栓纤纤维维蛋蛋白白暴暴露露出出E-E-片片段段，单单链链pro-UKpro-UK能能直直接接激激活活结结合合在在该该片片段段C-C-端端两两个个赖赖氨氨酸酸残残基基上上的的纤纤溶溶酶酶原原，其其活活性性增增加加500500倍倍，产产生生大大量量纤纤溶溶酶酶，使使血血栓栓纤纤维维蛋蛋白白迅迅速速溶溶解解，因因此此pro-UKpro-UK是是特特异异性性的的纤纤溶溶酶酶原原激激活活剂剂。单单链链pro-UKpro-UK被被纤纤溶溶酶酶、嗜嗜热热杆杆菌菌金金属属蛋蛋白白酶酶完完全全激激活活后后，其其比比活活性性与与尿尿激激酶酶相相同同（1-1.21-1.2 10105 5 IU/mgIU/mg，天天然然尿尿激激酶酶或或尿尿激激酶酶原原的的比比活活性性的的国国际际标标准准为为104,000IU/mg104,000IU/mg）。）。2、当血栓纤维蛋白暴露出E-片段，单链pro-UK能直接激活13尿激酶原作用机理示意图尿激酶原作用机理示意图 D-domain E-domain E A B E A B C D F C D F EEEDDDPro-UKplasminogenplasminogenPlasminogen plasmonogenFDPUK，t-PA，SKplasminplasminplasminplasmin EEEE尿激酶原作用机理示意图EEDDDPro-UKplasmino14八、尿激酶原的生产工艺八、尿激酶原的生产工艺1、尿激酶原工程细胞的构建、尿激酶原工程细胞的构建 将将人人体体分分泌泌尿尿激激酶酶的的Detroit562Detroit562细细胞胞RNARNA提提取取出出来来，用用反反转转录录及及基基因因重重组组技技术术得得到到构构建建了了Detroit Detroit 562562细细胞胞cDNAcDNA文文库库，用用合合成成的的基基因因探探针针筛筛选选获获得得人人尿尿激激酶酶原原全全长长cDNA，并并构构建建成成含含人人尿尿激激酶酶原原全全长长cDNAcDNA的的重重组组表表达达质质粒粒pMTSVT-dupMTSVT-du，采采用用磷磷酸酸钙钙法法将将质质粒粒转转染染CHOCHO细细胞胞。经经酶酶切切鉴鉴定定正正确确后后，最最终终挑挑选选得得到到表表达达水水平平最最高高的的CL-11GCL-11G工工程程细细胞胞株株。该该工工程程细细胞胞株株进进行行了了一一系系列列鉴鉴定定的的结结果果表表明明，它它符符合合生生物物制制品品生生产产细细胞的要求。胞的要求。八、尿激酶原的生产工艺1、尿激酶原工程细胞的构建152、细胞的微载体灌流培养、细胞的微载体灌流培养将将工工程程细细胞胞CL-11GCL-11G细细胞胞株株从从生生产产种种子子库库取取出出，复复苏苏依依次次在在方方瓶瓶、搅搅拌拌瓶瓶、转转瓶瓶内内培培养养，基基础础培培养养基基为为DMEM/F12DMEM/F12，再再转转入入5 5升升罐罐培培养养，细细胞胞密密度度达达到到1101107 7细细胞胞/ml/ml 后后转转入入20L20L罐罐培培养养，采采用用多多孔孔微微载载体体无无血血清清灌灌流流培培养养。待待细细胞胞密密度度达达到到1101107 7/ml/ml左左右右时时，采采用用间间隙隙更更换换部部分分微微载载体体的的工工艺艺，即即每每隔隔10101515天天更更换换约约1/41/4微微载载体体，每每天天收收集集培培养养上上清清1 1 1.21.2个个体体积积。我我们们用用20L20L罐罐连连续续培培养养9191天天，细细胞胞密密度度最最高高达达2.6102.6107 7/ml/ml，共共获获培培 养养 上上 清清 1909L,1909L,平平 均均 活活 性性 为为 6280IU/ml,6280IU/ml,最最 高高 达达11200IU/ml11200IU/ml，总产量达到，总产量达到113g113g。2、细胞的微载体灌流培养163 3、产品纯化制备工艺、产品纯化制备工艺 采采用用Streamline Streamline SP-SP-阳阳离离子子交交换换色色谱谱Sephacryl Sephacryl S-200HRS-200HR凝凝胶胶色色谱谱对对氨氨基基苯苯甲甲醚醚亲亲和和色色谱谱QAE-SepharoseQAE-Sepharose阴阴离离子子交交换换色色谱谱四四步步纯纯化化工工艺艺，从从19091909升升培培养养上上清清，获获得得半半成成品品80g80g，回回收收率率70%70%以以上上，纯纯度度高高于于98%98%，单单链链含含量量 98%98%。半半成成品品加加入入保保护护剂剂和和赋赋形形剂剂后后，经经无无菌菌过过滤滤、分分装装、冻冻干干，即即成成产产品品78.4g78.4g。连连续续生生产产5 5批批产产品品，其其中中三三批批样样品品送送国国家家卫卫生生部部生生物制品检定所检定，物制品检定所检定，2323项指标全部合格。项指标全部合格。3、产品纯化制备工艺 采用Stream17三批三批pro-UKpro-UK电泳结果电泳结果三批pro-UK电泳结果18九、重组人尿激酶原的九、重组人尿激酶原的 临床前安全试验临床前安全试验1 1 急性毒性试验：急性毒性试验：小小鼠鼠急急性性毒毒性性试试验验结结果果显显示示，pro-UKpro-UK的的半半数数致致死死量量（LDLD5050）97.5 97.5 mg/kgmg/kg。在在1414天天观观察察期期内内，小小鼠鼠体体重重增增加加正正常常，未未见见任任何何异异常常，死死亡亡率率为零。为零。九、重组人尿激酶原的 临床前安全试验1 急性毒性试验192 2 pro-UKpro-UK的长期毒性试验的长期毒性试验 BeagleBeagle狗狗的的长长期期毒毒性性研研究究结结果果表表明明，pro-UK pro-UK 28mg/kg28mg/kg和和8mg/kg8mg/kg组组每每次次静静脉脉滴滴注注后后可可见见牙牙龈龈不不同同程程度度充充血血，给给药药后后半半小小时时明明显显减减轻轻，4 4 小小时时内内恢恢复复正正常常。用用药药后后注注射射部部位位容容易易出出血血，需需要要适适当当延延长长压压迫迫止止血血时时间间。2mg/kg2mg/kg组组未未观观察察到到上上述述症症状状。28mg/kg 28mg/kg 组组动动物物的的TcholTchol、TPTP和和AlbAlb含含量量有有升升高高趋趋势势，凝凝血血时时间间明明显显延延长长，病病理理学学检检查查未未观观察察到到药药物物造造成直接的脏器损伤。成直接的脏器损伤。2 pro-UK的长期毒性试验 Beagle狗的长203 Wistar3 Wistar大鼠的长期毒性试验大鼠的长期毒性试验 大大鼠鼠静静脉脉注注射射pro-UK pro-UK 3 3、1010和和30mg/kg30mg/kg后后，三三个个剂剂量量组组受受试试动动物物均均未未出出现现毒毒性性反反应应症症状状，食食量量、体体重重增增长长正正常常。1313项项血血液液学学检检查查结结果果显显示示，RBCRBC、HgbHgb、RetiReti、HCTHCT、MCHCMCHC、MCHMCH与与对对照照组组比比较较有有显显著著差差别别或或非非常常显显著著差差别别（P P 0.05,0.05,P P 0.01 0.01)，但但都都在在正正常常范范围围波波动动，没没有有明明显显的的时时效效关关系系和和量量效效关关系系。TPTP、AlbAlb与与对对照照组组比比较较有有升升高高趋趋势势，APTT APTT 时时间间明明显显延延长长，组组织织病病理理学学检检查查及及脏脏器器系系数数测测定定均均未未发发现现具具有有毒毒理理学学意义的改变。意义的改变。3 Wistar大鼠的长期毒性试验 大鼠静脉注射p214.pro-UK4.pro-UK的特殊毒性试验研究结果的特殊毒性试验研究结果1).1).小鼠骨髓细胞微核试验小鼠骨髓细胞微核试验 昆昆明明小小鼠鼠静静脉脉注注射射pro-UK90mg pro-UK90mg/kg/kg后后，1212、2424、3636、4848及及7272小小时时取取材材检检查查，对对多多染染红红细细胞胞微微核核率率及及红红系系细细胞胞造造血血均均无无明明显显影影响响。各各取取样样点点的的微微核核率率及及PCE/NCEPCE/NCE值值均均在在正正常常范范围之内。围之内。4.pro-UK的特殊毒性试验研究结果1).小鼠骨髓细胞微222).pro-UK2).pro-UK的遗传毒性研究的遗传毒性研究 用用沙沙门门氏氏菌菌诱诱变变性性实实验验平平皿皿掺掺入入法法检检测测pro-UKpro-UK对对测测试试菌菌株株TA97TA97、TA98TA98、TA100TA100 和和TA102TA102的的致致突突变变作作用用。结结果果表表明明，pro-UKpro-UK在在0.10.1 20002000 g g/皿皿浓浓度度范范围围内内,在在活活化化和和非非活活化化条条件件下下，诱诱发发四四菌菌株株产产生生的的回回变变菌菌落落数数与与相相应应的的自自发发突突变变率率和和 S S9 9对对照照组组相相比比无无明明显显增增加加，表表明明pro-UKpro-UK对对沙沙门门氏氏菌菌无无致致基因突变作用。基因突变作用。2).pro-UK的遗传毒性研究 用沙门氏菌诱变233).pro-UK3).pro-UK的的CHLCHL细胞染色体畸变试验细胞染色体畸变试验 pro-UK100pro-UK100、200200、400400 g/mlg/ml分分别别与与CHLCHL细细胞胞接接触触培培养养2424、4848小小时时(加加S S9 96h)6h)收收获获细细胞胞，三三个个剂剂量量pro-UKpro-UK对对CHLCHL细细胞胞染染色色体体畸畸变变率率均均无无明明显显影影响响，也也未未见见诱诱发发CHLCHL细细胞胞染染色色体体畸畸变变及及数数目目改变。改变。3).pro-UK的CHL细胞染色体畸变试验 p244).pro-UK4).pro-UK的生殖毒性研究的生殖毒性研究 小小鼠鼠致致畸畸胎胎试试验验结结果果表表明明，小小鼠鼠妊妊娠娠后后第第6 6 1515天天，每每天天静静注注pro-UK pro-UK 1 1、5 5、1515、45mg/kg45mg/kg，连连续续1010天天，5 5、1515、45 45 mg/kgmg/kg各各剂剂量量组组均均有有流流产产和和母母鼠鼠死死亡亡，1mg/kg1mg/kg和和15mg/kg15mg/kg组组存存活活的的胎胎鼠鼠各各发发现现一一个个足足外外翻翻畸畸形形，畸畸形形率率为为 0.9%0.9%和和0.7%0.7%，均均在在正正常常范范围围，5mg/kg5mg/kg和和45mg/kg45mg/kg组组及及溶溶剂对照组存活胎鼠未发现畸形。剂对照组存活胎鼠未发现畸形。4).pro-UK的生殖毒性研究 小鼠致畸胎试验结25 1mg/kg1mg/kg剂剂量量组组未未见见母母鼠鼠流流产产、死死亡亡，但但个个别别母母鼠鼠仍仍见见宫宫内内轻轻度度出出血血。15mg/kg15mg/kg和和45mg/kg45mg/kg组组腭腭裂裂畸畸形形率率明明显显增增高高，5mg/kg5mg/kg及及1mg/kg1mg/kg组组的的腭腭裂裂畸畸形形率率与与空空白白对对照照组组相相当当。实实验验结结果果提提示示，该该药药与与其其它它溶溶栓栓药药一一样样，孕孕妇妇患患者者要要慎用。慎用。1mg/kg剂量组未见母鼠流产、死亡，但个别母鼠仍见26十、十、pro-UKpro-UK的一般药理学试验的一般药理学试验 通通过过小小鼠鼠(剂剂量量：5.25.2、10.410.4、20.8mg 20.8mg/kg)/kg)，大大鼠鼠(剂剂量量:3.6:3.6、6.06.0、12.0mg/kg)12.0mg/kg)，犬犬(剂剂量量:0.60.6、1.21.2、2.4mg/kg)2.4mg/kg)和和豚豚鼠鼠回回肠肠 (剂剂量量:1:1 1010-6-6 和和1 1 1010-5-5g/ml)g/ml)的的一一般般药药理理学学试试验验的的结结果果表表明明，pro-UKpro-UK对对受受试试动动物物的的一一般般行行为为、状状态态及及中中枢枢神神经经系系统统、心心血血管管系系统统、呼呼吸吸系系统统、消消化化系系统统等等均均无无明明显显影影响响。对对出出血血时时间间和和血血小小板板凝凝结结功功能能也也无无明明显显影影响响。仅仅发发现现犬犬实实验验中中手手术术创创面面有有渗渗血血现现象象，实实验验结结束后全身血液有类似肝素化状态。束后全身血液有类似肝素化状态。十、pro-UK的一般药理学试验 通过小鼠(剂量：27十一、十一、pro-UKpro-UK的药效学试验结果的药效学试验结果 11.1 pro-UK11.1 pro-UK对家兔外源性血栓的溶栓作用对家兔外源性血栓的溶栓作用:用用体体外外血血栓栓形形成成仪仪制制备备血血栓栓，染染色色后后经经颈颈静静脉脉注注入入家家兔兔体体内内，观观察察不不同同剂剂量量 pro-UKpro-UK的的溶溶栓栓作作用用，并并与与UKUK进进行行比比较较。结结果果表表明明，pro-UKpro-UK与与UKUK同同等等剂剂量量的的溶溶栓栓作作用用相相似似，pro-UKpro-UK的的溶溶血血栓栓功功能能随随剂剂量量增增加加而而增增强强，其其溶溶栓栓率率与与对对照照组组比比较较差差异异非非常常明明显显 (P P 0.0010.001)，正正常常家家兔兔对对注注入入的的血血栓栓有有一一定定生生理理性性溶溶解解作作用用。揭揭示示pro-pro-UKUK对家兔试验性血栓有明显的溶解作用。对家兔试验性血栓有明显的溶解作用。十一、pro-UK的药效学试验结果 11.1 pro-UK28表表1 pro-UK1 pro-UK对实验兔肺血栓的溶解作用对实验兔肺血栓的溶解作用组别组别剂量剂量动物数动物数原血栓重原血栓重24h后栓重后栓重溶栓率溶栓率(U/kg)(只只)(mg)(mg)(%)对照组对照组0832.25 2.0523.88 2.3025.95 5.4210000831.75 1.5815.38 4.9652.47 14.58UK20000830.25 1.4913.38 4.7256.27 14.9040000730.43 1.629.71 3.2568.30 9.7080000731.43 1.9911.71 6.2963.12 18.82pro-UK10000532.00 2.3515.40 5.1352.48 14.4720000830.25 1.2815.88 3.1851.54 9.7540000832.38 1.7712.88 3.9459.72 14.1980000831.25 1.499.50 3.6369.69 11.25160000832.38 1.858.25 3.3374.44 10.25 表1 pro-UK对实验兔肺血栓的溶解作用2911.2 pro-UK11.2 pro-UK对猪冠状动脉血栓的对猪冠状动脉血栓的 溶栓作用及相关指标的影响溶栓作用及相关指标的影响 中中国国试试验验小小型型猪猪直直接接用用电电刺刺激激冠冠状状动动脉脉形形成成冠冠脉脉内内血血栓栓，用用不不同同剂剂量量pro-UKpro-UK进进行行溶溶栓栓治治疗疗，结结果果表表明明，UKUK和和pro-UKpro-UK对对猪猪冠冠脉脉血血栓栓有有显显著著的的溶溶栓栓作作用用，pro-UKpro-UK4104104 4IU/kgIU/kg、8 810104 4 IU/kgIU/kg、161610104 4IU IU/kg/kg 三三个个剂剂量量组组与与对对照照组组相相比比均均能能明明显显缩缩小小冠冠脉脉血血栓栓横横切切面面积积，减减轻轻心心肌肌缺缺血血程程度度和和范范围围，缩缩小小梗梗塞塞区区。UK UK(80000 80000 IU/kg)IU/kg)溶溶栓栓率率为为 40.1 40.1%，pro-UK pro-UK 三三个个剂剂量量组组的的溶溶栓栓率率依依次次为为34.4%34.4%、45.6%45.6%、47.3%47.3%；对对照组自溶率为照组自溶率为6.7%6.7%。11.2 pro-UK对猪冠状动脉血栓的 溶栓作用及相关指30对照对照UK UK（8 8万万IU/kg)IU/kg)U-PA(4U-PA(4万万IU/kg)IU/kg)U-PA(8U-PA(8万万IU/kg)IU/kg)U-PA(16U-PA(16万万IU/kg)IU/kg)UKUK和和u-PAu-PA对冠脉血栓溶解的作用对冠脉血栓溶解的作用对照UK（8万IU/kg)U-PA(4万IU/kg)U31pro-UKpro-UK对猪冠状动脉血栓对猪冠状动脉血栓的溶栓作用的溶栓作用pro-UK对猪冠状动脉血栓的溶栓作用32 pro-UKpro-UK的的三三个个剂剂量量组组的的纤纤溶溶指指标标均均无无明明显显变变化化。试试验验结结果果揭揭示示，pro-UKpro-UK和和UKUK对对猪猪冠冠脉脉血血栓栓均均有有明明显显溶溶解解作作用用，pro-UK pro-UK 对对全全身身纤纤溶溶系系统统影影响响很很小小，UKUK明明显显降降低低 2 2-AP-AP含量。含量。pro-UK的三个剂量组的纤溶指标均无明显变化。试验33尿激酶原的研究概况课件34尿激酶原的研究概况课件35尿激酶原的研究概况课件36十二、十二、pro-UKpro-UK动物体内的动物体内的药代动力学研究药代动力学研究1、用用HPLCHPLC法法研研究究家家兔兔pro-UKpro-UK和和UKUK的的药药代代动动力力学学结结果果表表明明，单单链链pro-UK pro-UK 和和双双链链 UKUK分分别别按按双双指指数数函函数数和和单单指指数数函函数数衰衰减减。单单链链pro-UKpro-UK的的初初相相半半衰衰期期(t(t1/21/2()=7=7 2 2分分钟钟)与与双双链链UKUK的的初初相相半半衰衰期期（t t1/21/2()=9 9 3 3分分钟钟比比较较接接近近；单单链链pro-UKpro-UK的的末末相相半半衰衰期期为为 t t1/21/2()=43=43 1010分分钟钟，提提示示单单链链 pro-UKpro-UK在在体体内内的的作作用用机机理理与与双双链链UKUK不不同同。单单链链 pro-UKpro-UK和和双双链链UKUK的的药药时时曲曲线线下下的的面面积积(AUC)(AUC)分分别别为为398398 46KBq.min.ml46KBq.min.ml-1-1 和和151151 15 KBq.min.ml15 KBq.min.ml-1-1。十二、pro-UK动物体内的药代动力学研究1、用HPLC法372 2、用用测测定定酶酶活活力力方方法法研研究究 pro-UK pro-UK 在在猕猕猴猴体体内内的的药药代代动动力力学学结结果果表表明明，当当分分别别静静注注7500075000、150000150000和和 300000300000 IU/kg IU/kg pro-UKpro-UK后后，其其 消消 除除 半半 衰衰 期期 分分 别别 为为 6.36.3 1.81.8、11.5 11.5 2.12.1和和12.312.3 2.9min2.9min，半半衰衰期期随随剂剂量量增增加加延延长长，提提示示该该药药在在体体内内存存在在非非线线性性过过程程。静静注注UKUK150000150000IU/IU/kgkg后，其消除半衰期为后，其消除半衰期为13.713.7 2.7min2.7min。2、用测定酶活力方法研究 pro-UK 在猕猴体内的药代动力383 3、pro-UKpro-UK的的排排泄泄实实验验结结果果表表明明，pro-UK pro-UK 主主要要经经尿尿排排泄泄，其其次次少少量量经经粪粪便便排排泄泄。4848小小时时经经尿尿和和粪粪便便排排泄泄 86.2 86.2%，经经尿尿排排出出的的大大部部分分是是pro-UKpro-UK的的降降解解产产物物碎碎片片。组组织织分分布布实实验验结结果果表表明明，pro-UK pro-UK 进进入入体体内内主主要要分分布布于于尿尿、肾肾、肝肝脏脏、胆胆汁汁、心心脏脏、血血液液、肺肺等等血血流流丰丰富富的的组组织织，大大脑脑、脂脂肪肪等组织含量很低。等组织含量很低。3、pro-UK的排泄实验结果表明，pro-UK 主要经尿排39十三、十三、期临床耐受性试验期临床耐受性试验 1 1、健康受试者的遴选：、健康受试者的遴选：受受试试者者共共2323人人，男男1111人人，女女1212人人，年年龄龄20-3520-35岁岁，平平均均276276岁岁；体体重重51-73kg51-73kg，平平均均63.75.2kg63.75.2kg。所所有有入入选选者者的的凝凝血血和和纤纤溶溶指指标标均均合合格格，乙乙肝肝表表面面抗抗原原均均为为阴阴性性，生生化化检测和心电图正常。检测和心电图正常。十三、期临床耐受性试验 1、健康受试者的遴选：40表表2.232.23名受试者的性别、年龄、体重等情况名受试者的性别、年龄、体重等情况A组组3/325.5 1.961.8 3.1B组组3/328.5 6.359.3 2.7C组组3/327.2 6.160.2 6.2D组组2/325.0 6.457.0 4.5组别组别性别性别(男男/女女)年龄（岁）年龄（岁）体重（体重（kgkg）表2.23名受试者的性别、年龄、体重等情况 A组3/325.41表表3.233.23名受试者凝血指标的体检结果名受试者凝血指标的体检结果剂量组剂量组PT(S)PA(%)APTT(S)FIB(mg/dl)A组组11.12 0.4489.33 4.9328.50 1.22229.67 42.08B组组10.57 0.2995.73 6.8529.13 2.86229.50 42.53C组组11.22 0.6188.40 6.7431.37 2.77284.67 92.87D组组11.80 0.5782.66 5.8329.24 2.34230.00 16.43表3.23名受试者凝血指标的体检结果剂量组PTPAAPTT422 2、各各个个剂剂量量组组受受试试者者应应用用不不同同剂剂量量药药物物后后均均未未见见有有不不良良反反应应，心心率率、心心律律、血血压压、呼呼吸吸和和心心电电图图等等均均无无异异常常变变化化。药药物物注注射射局局部部也也未未见见有有刺刺激激性性反反应应表表现现或或血血肿肿、皮皮下下出出血血或或皮皮肤肤瘀瘀斑斑等等变变化化。每每位位受受试试者者均均随随访访5 57 7天天，随访期间亦未发现不良反应。随访期间亦未发现不良反应。2、各个剂量组受试者应用不同剂量药物后均未见有不良反应，心率432 2、受试者应用药物前后血常规和、受试者应用药物前后血常规和 血液生化指标的检查结果血液生化指标的检查结果 2323名名受受试试者者应应用用药药物物前前后后血血常常规规和和血血液液生生化化指指标标的的检检查查结结果果表表明明，各各个个剂剂量量组组试试验验前前与与给给药药后后2424小小时时比比较较，四四项项血血常常规规指指标标，50mg50mg组组RBCRBC稍稍有有上上升升，其其余余各各项项指指标标都都轻轻微微减减少少，其其结结果果都都在在正正常常范围，统计学分析无显著性差异；范围，统计学分析无显著性差异；2、受试者应用药物前后血常规和 血液生化指标的检查44 2323名名受受试试者者2626项项血血液液生生化化指指标标检检查查结结果果显显示示，各各个个剂剂量量组组给给药药后后 2424小小时时都都在在正正常常范范围围内内变变化化，其其中中35mg35mg组组碱碱性性磷磷酸酸酶酶、肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶，50mg50mg组组乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶、肌肌酸酸磷磷酸酸激激酶酶在在用用药药 2424小小时时后后稍稍有有降降低低，经经过过统统计计学学分分析析，虽虽然然有有显显著著性性意意义义，但但无无临床意义。尿常规给药前后无明显变化。临床意义。尿常规给药前后无明显变化。23名受试者26项血液生化指标检查结果显示，各个剂量453 3、受试者应用药物前后、受试者应用药物前后 凝血指标的测定结果凝血指标的测定结果 受受试试者者应应用用药药物物前前后后凝凝血血和和纤纤溶溶指指标标的的测测定定结结果果表表明明，四四个个剂剂量量组组PTPT和和INRINR值值在在给给药药后后第第2 2小小时时均均略略有有上上升升。PAPA在在给给药药后后第第2 2小小时时均均稍稍有有下下降降，24 24 小小时时后后均均恢恢复复至至用用药药前前水水平平，从从统统计计结结果果看看用用药药前前后后均均无无显显著著性性。四四个个剂剂量量组组APTTAPTT在在给给药药后后第第2 2小小时时均均略略有有延延长长，2424小小时时也也均均恢恢复复到到正正常常水水平平，虽虽然然20mg20mg组组统统计计学学分分析析有有显显著著性性，但但延延长长值值未未超超过过正正常常值值一一倍倍,没有临床意义。没有临床意义。3、受试者应用药物前后 凝血指标的测定结果 46表表4 4 各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化剂剂量量组组项项目目时间时间PT(S)PA(%)APTT(S)INRFIB(mg/dl)FDP(g/ml)PLG(%)2-AP(%)5mg给药前给药前11.43 0.6286.17 5.6047.00 35.391.15 0.06225.83 185.26 10114.67 38.7684.03 6.99给药后给药后2小时小时11.50 0.4376.55 17.9964.00 41.601.29182.75 49.48 10114.27 37.2483.55 3.65给药后给药后24小时小时11.25 0.4087.67 4.3728.33 1.751.15 0.07219.20 64.20 1040*117.03 36.33105.53 34.6020mg给药前给药前11.08 0.6490.25 6.8530.75 3.101.11 0.09192.00 34.13 1091.05 34.8788.78 9.99给药后给药后2小时小时11.92 1.7183.17 14.0554.83*14.361.27 0.30196.17*78.6610-4099.60 35.8692.95 8.94给药后给药后24小时小时11.27 0.7188.00 7.6231.67*3.081.15 0.10262.00*79.9610-40110.90 35.06113.92 31.97表4 各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化剂项 47表表5 5 各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化(续续)剂剂量量组组项项目目时间时间PT(S)PA(%)APTT(S)INRFIB(mg/dl)FDP(g/ml)PLG(%)2-AP(%)35mg给药前给药前11.10 0.1489.30 1.7231.67 4.581.13 0.02262.38 121.38 10120.07 39.07126.83 26.33给药后给药后2小时小时12.05 1.8081.82 13.5440.90 10.321.30 0.32234.50 132.610-40 4096.52 32.04110.83 22.64给药后给药后24小时小时11.87 1.5083.22 11.8829.97 2.951.26 0.26305.17 78.6810-40 40,10128.00 34.37112.35 30.8050mg给药前给药前11.66 0.6184.42 5.7928.92 2.441.22 0.10238.80 90.99 10109.42 33.9779.62 7.44给药后给药后2小时小时13.00 1.7573.20 10.9045.96 18.151.46 0.33211.40 57.58 104096.66 30.9299.02*3.24给药后给药后24小时小时11.60 0.6884.40 7.1630.20 2.391.22 0.12242.00 35.82 10120.60 40.2797.28*4.20表5 各剂量组给药前后凝血指标和纤溶指标的变化(续)剂项48尿激酶原的研究概况课件49尿激酶原的研究概况课件50尿激酶原的研究概况课件51尿激酶原的研究概况课件52结论结论 （1).231).23名名正正常常受受试试者者静静脉脉接接受受重重组组人人尿尿型型纤纤溶溶酶酶原原激激活活剂剂(pro-UK)5(pro-UK)550mg50mg后后，均均未未观观察察到到任任何何不不良良反反应应，皮皮肤肤黏黏膜膜及及其其它它部部位位未未见见出出血血；注注射射局局部部皮皮肤肤无无刺刺激激反反应应表表现现。尿尿常常规规、血血常常规规、心心电电图图以以及及血血液液生生化化2626项项测测定定指指标标也也均均在在正正常常范范围围。表表明明该该药药物物对对身身体体各各系系统统、以以及对肝、肾功能均无明显毒性作用。及对肝、肾功能均无明显毒性作用。结论（1).23名正常受试者静脉接受重组人尿型纤溶酶原激活53（2)2)给给药药后后第第2 2小小时时，受受试试者者凝凝血血指指标标有有所所变变化化，PAPA均均略略有有下下降降，APTTAPTT有有延延长长趋趋势势，仅仅在在20mg20mg组组与与用用药药前前比比较较有有显显著著性性意意义义，其其它它各各组组均均无无显显著著性性。纤纤溶溶指指标标,各各个个剂剂量量组组用用药药后后FDP FDP 稍稍有有升升高高，FIBFIB、PLG PLG 和和 2 2-AP-AP无无明明显显变变化化，说说明明本本药药对对全全身身的的纤纤溶溶系系统统影影响响小小，安安全全性性好好。但但因因有有个个体体差差异异，在在用用药药后后仍仍应应严严密密观观察察可可能能出出现现的的出出血血等等副副作作用用。试试验验结结果果可可以以认认为为pro-UKpro-UK给给药药剂剂量量在在50mg50mg以以内内是是安安全的，能耐受的。全的，能耐受的。（2)给药后第2小时，受试者凝血指标有所变化，PA均略有下54十四、健康受试者十四、健康受试者iviv重组重组pro-UKpro-UK的药代动力学的药代动力学 正正常常受受试试者者显显示示健健康康受受试试者者iviv剂剂量量为为20mg20mg，35mg35mg和和50mg50mg重重组组pro-UKpro-UK后后(其其中中25%25%推推注注，75%75%在在1h1h内内恒恒速速滴滴注注)，血血浆浆总总pro-UKpro-UK、scpro-UK scpro-UK 和和纤纤溶溶酶酶活活性性浓浓度度-时时间间变变化化的的结结果果显显示示，血血浆浆总总pro-UKpro-UK、scpro-UKscpro-UK和和纤纤溶溶酶酶活活性性浓浓度度均均依赖于剂量或滴注速度明显增高。依赖于剂量或滴注速度明显增高。十四、健康受试者iv重组pro-UK的药代动力学 55 推推注注后后1min1min至至1 1小小时时滴滴注注期期间间，各各剂剂量量组组间间的的各各个个测测定定时时间间点点之之间间都都有有非非常常明明显显的的统统计计差差别别(P P 0.0010.001)。而而且且曲曲线线呈呈稳稳定定平平坦坦形形状状，表表明明25%25%的的推推注注剂剂量量使使药药物物迅迅速速达达到到稳稳态态血血药药浓浓度度，而而恒恒速速滴滴注注药药量量有有效效地地保保持持浓浓度度在在相相应应水水平平上上。在在滴滴注注结结束束后后，所所有有成成分分的的浓浓度度都都迅迅速速下下降降，在在开开始始给给药药后后6h6h已已基基本本上上恢恢复复至至给给药药前前内内源源性性物物质质水水平平。而而且且在在滴滴注注结结束束后后1h1h内内各各剂量组间也可以观察到浓度的差异。剂量组间也可以观察到浓度的差异。推注后1min至1小时滴注期间，各剂量组间的各个测定56表表6 6 健康志愿者健康志愿者iv iv 不同剂量重组不同剂量重组pro-UKpro-UK后后血浆血浆pro-UKpro-UK的药代动力学参数的药代动力学参数参数参数单位单位20mg 35mg 50mgN=7N=6N=6AUC(0-6h)ng.h.mL-1216.950.6501.3152.5638.262.7AUC(0-)ng.h.mL-1229.056.1535.0177.1652.065.2MRTh1.50.21.50.11.20.1CLSL/h0.0920.0250.0610.0190.0460.005VSSL0.1370.0380.0900.0230.0570.006t1/2h2.40.62.60.41.90.5Cmaxng.mL-199.323.6209.021.2369.815.3tmaxh0.170.370.040.030.250.37双链双链生成率生成率(0-6h)%-6.19.915.44.227.87.6双链双链生成率生成率(0-)%-8.310.415.04.327.97.0表6 健康志愿者iv 不同剂量重组pro-UK后血浆pro57表表7 7 健康志愿者健康志愿者iviv不同剂量重组不同剂量重组pro-UKpro-UK后后血浆血浆scpro-UKscpro-UK的药代动力学参数的药代动力学参数参数参数单位单位20mg35mg50mgn=7n=6n=6AUC(0-6h)ng.h.mL-1227.243.1424.8133.6a457.126.5cccAUC(0-)ng.h.mL-1244.648.7456.1155.4a466.730.4cccMRTh1.50.11.50.2bb1.20.1cccCLSL/h0.0850.0170.0480.016aa0.0430.003cccVSSL0.1240.0280.0710.018aa0.0520.003ccct1/2h2.80.52.60.4bb1.90.2ccCmaxng.mL-192.923.7175.214.0aaa,bbb296.69.3cccTmaxh0.210.250.210.230.050.06表7 健康志愿者iv不同剂量重组pro-UK后血浆scpr58健康志愿者健康志愿者iv 20 mgiv 20 mg(),35 mg,35 mg()和和50 mg50 mg()剂量剂量重组重组pro-UKpro-UK后血浆总后血浆总pro-UKpro-UK浓度的变化浓度的变化健康志愿者iv 20 mg(),35 mg()和50 59健康志愿者健康志愿者iv 20 mgiv 20 mg(),35 mg,35 mg()和和50 mg50 mg()剂剂量重组量重组pro-UKpro-UK后血浆后血浆scpro-UKscpro-UK浓度的变化浓度的变化健康志愿者iv 20 mg(),35 mg()和50 m60