法医学 法医DNA分型课件

第18章 法医DNA分型 第18章 法医DNA分型 法医物证学 基本概念：对涉及法律问题的生物性检材进行检验，解决对涉及法律问题的生物性检材进行检验，解决 个人识别和亲权鉴定问题的法医学分支学科个人识别和亲权鉴定问题的法医学分支学科 基本任务：个人识别-揭示个体身份揭示个体身份 亲权鉴定-判定备检者之间是否存在生物学亲缘关系判定备检者之间是否存在生物学亲缘关系 法医物证学 基本概念：对涉及法律问题的生物性检材进行检验，一、基本概念：1.基因(gene)：染色体上一段特定的DNA片段。2.基因座/位点(locus)：基因在染色体上的特定位置。3.等位基因(allele):一个基因座上的基因存有DNA一级结构差异。4.基因型(genetype)：基因座上成对等位基因的组合。5.表型(phenotype)：通过一定手段观察到的个体性状。一、基本概念：1.基因(gene)：染色体上一段特定的DN法医常用遗传标记法医常用遗传标记 法医常用遗传标记 遗传标记的检测方法：?血清学方法 检验红细胞血型、白细胞血型、红细胞酶型、血清型?DNA检验技术 RFLP 技术、PCR技术 遗传标记的检测方法：?血清学方法 二、DNA水平的遗传标记 1、DNA的分子结构 二、DNA水平的遗传标记 1、DNA的分子结构 DNA的二级结构-双螺旋结构 1953年，Watson 和Crick 提出了DNA双螺旋结构模式。变性：双链间氢键的断裂，形成两条多核苷酸单链的过程 DNA的二级结构-双螺旋结构 1953年，Watso 引起DNA变性的因素主要有高温、强酸强碱、有机溶剂等。DNA变性后，性质发生改变。引起DNA变性的因素主要有高温、强酸强碱、有机溶核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)根据核酸分子变性及复性的性质，通过碱基配对使不同来源的两条多核苷酸链相互结合。核酸分子杂交(hybridization)根据核酸 在某些因素的影响下，例如紫外线、DNA酶等，可以使DNA分子中的 磷酸二酯键断裂，形成多个分子量更小的DNA片段，这个过程叫作DNA降解。在某些因素的影响下，例如紫外线、DNA酶等，可以使2、DNA多态性 等位基因（或 DNA片段）存在 两种以上形式，且每种等位基因 频率0.01，本质为碱基构成发生改变（点突变、缺失、插入或置换），分为长度多态性和序列多态性。2、DNA多态性 等位基因（或DNA片段）存在两种以DNA长度多态性 由同一基因座上各等位基因之间DNA片段长度差异构成的多态性。DNA序列多态性 基因组DNA核苷酸序列在个体排列上存在巨大差异，这种差异形成DNA片段序列多态性。DNA长度多态性 由同一基因座上各等位基因之间DNA片单核苷酸多态性（SNP）人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1%单核苷酸多态性（SNP）人类基因组范围内，如果任何小卫星DNA：一类由 10-100bp长度重复单位形成的卫星 DNA，序列总长度 100-20kb，又称可变数目串联重复序列（VNTR）形成机制主要是不等交换 小卫星DNA：一类由10-100bp长度重复单位形微卫星DNA：一类由2-6bp长度重复单位形成的卫星DNA，串联重复 10-60次，总长度多小于300bp，又称短串联重复序列（STR），形成机制主要为复制滑脱 微卫星DNA：一类由2-6bp长度重复单位形成的卫线粒体基因组（线粒体基因组（mtDNA）?母系遗传?单倍型遗传?多拷贝?突变率高?高度多态性?异质性 线粒体基因组（mtDNA）?母系遗传?单倍型遗传?多拷3、DNA多态性检测技术 3、DNA多态性检测技术 限制片段长度多态性（RFLP）限制性内切酶：识别双链 DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定部位以内切方式水解DNA链的核酸水解酶。由于DNA限制酶识别的序列核苷酸结构发生改变，导致酶切位点的产生、消失或移位，酶切所产生的限制性片段数目和长度改变所呈现出的DNA多态性。限制片段长度多态性（RFLP）限制性内切酶：识别双链DNARFLP 试验流程图试验流程图 RFLP试验流程图 DNA纹印：纹印：RFLP 分析杂交时使用单基因座探针，高度严格杂交条件下，仅与一个小卫星基因座等位片段杂交，形成单基因座RFLP 图谱。DNA纹印：RFLP分析杂交时使用单基因座探针，高DNA指纹：指纹：RFLP 分析杂交时，使用多基因座探针，不严格杂交条件下，与多个小卫星基因座等位片段杂交，形成多基因座 RFLP图谱。英国科学家 Jeffreys DNA指纹：RFLP分析杂交时，使用多基因座探针，采用PCR扩增VNTR或STR基因座等位基因进行DNA长度多态性分析的方法。扩增片段长度多态性分析（amp-FLP）：采用PCR扩增VNTR或STR基因座等位基因聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR)原理：原理：模拟天然DNA复制的体外DNA扩增方法。以基因组DNA为模板,以一对寡核苷酸为引物,dNTP为原料,在耐热多聚酶存在下，反复经过变性、退火、引物变性、退火、引物延伸三个步骤,使靶DNA片段得到复制。聚合酶链式反应(PCR)原理：模拟天然DNA复制的体变性(denaturation)：加热至95，使模板DNA双链的氢键断裂而解离成两条单链。退火(annealing)：降温至 55左右，引物寡核苷酸与模板DNA互补序列复性，形成模板-引物杂交双链。两引物的3端彼此相对。延伸(extension)：升温至72，在耐热DNA聚合酶的作用下，以碱基配对原则，dNTP 逐个连接在引物的3端。引物由 5端3端方向被延伸、合成与靶 DNA序列互补的DNA新链。变性(denaturation)：加热至95，使模板DNA 经过变性?退火?延伸的一次循环，靶DNA片段被复制一次。新合成的 DNA链又可成为下一循环的模板。经过n次循环后，产生在两引物间的靶 DNA短片段数量为2n-2n条。30次循环后，理论上 DNA拷贝数可达105-107。PCR产物经电泳分离，显带 杂合子为两条长度不等的片段，纯合子为一条片段；根据片段长度判定等位基因和基因型 经过变性?退火?延伸的一次循环，靶DNA片段被复1.高灵敏度，适于陈旧、降解、腐败检材；2.特异性高；3.可复合扩增；4.种属特异性；5.实验周期短，设备条件和操作相对简单。PCR技术用于法医学的特点技术用于法医学的特点 1.高灵敏度，适于陈旧、降解、腐败检材；2.特异性高；3短串联重复序列（STR）：广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，基序为 2-6bp，串联重复 10-60次，总长度多小于300bp，形成机制主要为复制滑脱。STR基因座命名原则：?编码区，依据所在基因名称命名?非编码区，依据首次进入公共数据库的序号命名 短串联重复序列（STR）：广泛存在于人类基因组中的STR基因等位基因命名原则：基因等位基因命名原则：?等位基因根据所含重复单位数目命名等位基因。?含有不完整基序的等位基因命名：在完整等位基因数后面加一小数点，小数点后面为不完整序列含有的碱基数。STR基因等位基因命名原则：?等位基因根据所含重复单位数目Ladder 5-12 Ladder 5-12 Ladder 5-12 1 2 3 4 5 6 基因型 1:(8,8);2:(8,10)3:(8,8);4:(7,9)5:(8,8);6:(8,9)Ladder 5-12 Ladder 5-12 LadderCSF1PO D5S818 D21S11 TH01 TPOX D13S317 D7S820 D16S539 D18S51 D8S1179 D3S1358 FGA VWA AMEL AMEL 性别基因 美国联合DNA检索系统（CODIS）的13个 STRs CSF1PO D5S818 D21S11 TH01 TPOX 应用于法医的STR应满足以下条件?PCR扩增产物长度在300bp以下?宜选择四核苷酸STR基因座?选多个STR基因座应不在同一条染色体上?每个STR基因座等位基因数8-10个左右?基因频率分布均匀，没有高或低频基因出现?杂合度高，最好大于0.80；?低突变率0.2%。应用于法医的STR应满足以下条件?PCR扩增产物长度在多基因座复合扩增（multiplex amplification）?在一个PCR体系中同时扩增多个基因座?如果同时检测816个STR基因座，鉴别能力能够达到DNA指纹的水平。?优点：高效、经济、快速。?目前常用的复合扩增方法有两种：银染系统、多色荧光自动检测系统 多基因座复合扩增（multiplex amplificati银染系统 多基因座复合扩增产物电泳分离后，PAG凝胶直接用银染显带。体系中多个基因座的基因长度范围必须互不重叠。操作简单，经济实用。因为片段长度范围选择受限制，能够同时扩增的基因座个数有限。银染系统 多基因座复合扩增产物电泳分离后，PAG凝胶直接用银荧光标记的自动检测系统 常采用复合扩增即在同一反应管中同时扩增多个STR基因座，自动化的激光荧光检测系统进行PCR产物分型 原理：荧光染料标记在一条PCR引物的5端，在PCR扩增时，PCR产物带上荧光标记。电泳时，标记有荧光染料的DNA片段由激光诱发荧光而被检测。荧光标记的自动检测系统 常采用复合扩增D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 D18S51 TPOX VWA AMEL D5S818 FGA GS500 LIZ size standard 6FAM(blue)VIC(green)NED(yellow)PET(red)LIZ(orange)AmpFlSTR?Identifiler?D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D法医遗传学应用STR的特点在于：?高灵敏度?扩增的片段短?使用生物检材类型广泛?分型简单，可标准化?染色体定位明确 PCR-STR：国内外法医个人识别和亲子鉴定的主流技术 法医遗传学应用STR的特点在于：?高灵敏度?扩增的片段短长度多态性分型局限性 案发现场只发现有头发或长期暴露于外界环境的骨骼，这些检材中核DNA含量很少或降解，无法进行长度多态性（如STR）分型。长度多态性分型局限性 案发现场只发现有?PCR-ASO 技术HLA-DQAl 基因座?PCR-RFLP 技术ABO基因、mtDNA?DNA序列分析mtDNA分型 法医学上常用的序列多态性分析技术法医学上常用的序列多态性分析技术?PCR-ASO技术HLA-DQAl 基因座?PCR-PCR-RFLP 技术 利用两个片段之间的序列差异，而且这种差异刚好构成一个限制性核酸内切酶识别位点，或使原有的限制酶识别位点丢失或识别位点移动了位置，选择合适的限制酶切割PCR产物，从长度不一的DNA酶切片段，可以判断等位基因及基因型。PCR-RFLP技术 利用两个片段之DNA序列分析（一）Sanger 双脱氧末端终止法（二）循环测序（cycle sequencing）（三）荧光标记循环测序全自动分析 DNA序列分析（一）Sanger双脱氧末端终止法（二）循排除 不排除不排除/认定 个人识别的系统效能 遗传标记遗传标记 同一人？未知样本Q 已知样本K 排除 不排除/认定 个人识别的系统效能 遗传标记 同一人？个人识别能力(discrimination power,DP)：指从群体中随机抽取两名个体，其遗传标记表型不相同的概率。?评价该遗传标记系统识别无关个体效能大小的指标，即反应遗传标记区分不同人的能力；?遗传标记的多态性越高，个人识别能力越强，遗传标记的效能就越高。遗传标记个人识别的系统效能 个人识别能力(discrimination power,DP计算公式计算公式 式中 n 为一个遗传标记的表型数目，Pi 为群体中第 i 个表型的频率。Pi 2 为人群中随机抽取的两个样本，纯粹由于机会而一致的概率(Q)。计算公式 式中 n 为一个遗传标记的表型数目，Pi 累积个人识别能力（TDP）遗传标记数目越多，个人识别能力愈强。提高系统的个人识别能力可以通过增加检测的遗传标记数目来实现。若检测 k个遗传标记，其累积个人识别能力计算公式为：累积个人识别能力（TDP）遗传标记数目越多，个人识别能力愈 一名随机个体碰巧与作为证据的检材表型匹配的可能性，又称为随机匹配概率或随机个体碰巧匹配概率。是对一个特定的（组合）遗传标记表型可能出现在人群中的概率，也可以说是从一个人群中随机抽取一个样本，会出现特定表型的理论概率。匹配概率（probability of match,Pm）一名随机个体碰巧与作为证据的检材表型匹配的可能性Pm的意义的意义?当两份检材的遗传标记表型匹配时，如果现场检材不是嫌疑人留下的，而是一个从 群体中随机抽出的个体留下的，遇到这种个体的 可能性有多大。?这个概率越小，遇到这种个体的可能性就越小，说明现场检材与嫌疑人样本的表型匹配非常不像是一个随机事件，而是 支持这两个样本来自同一个人的假设，也就是支持现场检材是嫌疑人留下的假设。Pm的意义?当两份检材的遗传标记表型匹配时，如果现场检材不似然率（likelihood,LR）似然率基于两个表型组合来自同一个体的假设衡量证据的强度。?例如，现场血痕DNA和嫌疑人血液DNA表型组合均为X，可以考虑两种假设：现场血痕是嫌疑人所留（原告假设）；现场血痕是一个与案件无关的随机个体所留（被告假设）。?似然率是假设条件下现场血痕与嫌疑人的表型 组合都是 X 的概率 Pr（EHp）=1；与假设条件下现场血痕与嫌疑人的表型组合都是 X 的概率（Pr（EHd）=P（X）之 比，即 LR=1/P（X）似然率（likelihood,LR）似然率谢 谢！谢 谢！