第3章植物细胞培养课件

第3章 植物细胞工程_植物细胞培养与杂交第3章 植物细胞工程_植物细胞培养与杂交1通常采用的通常采用的技术手段技术手段 植物组织培养植物组织培养 植物体细胞杂交植物体细胞杂交所采用技术所采用技术 的理论基础的理论基础 植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞工程通常采用的技术手段 植物组织培养 植物体细胞杂交21、定义：、定义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。的潜能的特性。的潜能的特性。的潜能的特性。2、原理：、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。一个活细胞都应该具有全能性。一个活细胞都应该具有全能性。一个活细胞都应该具有全能性。3、差异：、差异：（1 1 1 1）受精卵的全能性最高受精卵的全能性最高受精卵的全能性最高受精卵的全能性最高 4、潜在全能性的原因：、潜在全能性的原因：基因表达的选择性基因表达的选择性基因表达的选择性基因表达的选择性 （2 2 2 2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的受精卵分化后的细胞中，体细胞的受精卵分化后的细胞中，体细胞的受精卵分化后的细胞中，体细胞的 全能性比生殖细胞的低。全能性比生殖细胞的低。全能性比生殖细胞的低。全能性比生殖细胞的低。一、细胞的全能性一、细胞的全能性1、定义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特3二、植物组织培养1.概念概念科学研究表明，处于离体状态的植物科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是条件下实现的这一过程，就是植物组植物组织培养织培养。二、植物组织培养概念4组织培养的分类据外植体不同据外植体不同:植株培养、器官植株培养、器官培养、组织培养（含愈伤组织）培养、组织培养（含愈伤组织）据操作方法不同：固体培养、液据操作方法不同：固体培养、液体培养（包括振荡培养、旋转培体培养（包括振荡培养、旋转培养、静止培养）养、静止培养）组织培养的分类据外植体不同:植株培养、器官培养、组织培养（含5离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织或细胞或细胞 (外植体外植体)愈愈伤伤组组织织根根芽芽植植物物体体脱分化脱分化再分化再分化脱分化脱分化脱分化脱分化 由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再分化再分化再分化再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。胞的再分化。二、植物组织培养2.植物组织培养过程植物组织培养过程离体的植物器官、组织或细胞 (外植体)愈伤组织根植物6关于外植体的制备（一）培养材料（全能细胞）采集（一）培养材料（全能细胞）采集1、受精卵、受精卵2、分生组织细胞：如分生组织、根尖、分生组织细胞：如分生组织、根尖、嫩茎、幼叶、花等的细胞嫩茎、幼叶、花等的细胞快速繁殖多用茎尖细胞；无病毒培养多快速繁殖多用茎尖细胞；无病毒培养多仅取茎尖分生组织细胞仅取茎尖分生组织细胞3、配子和单倍体细胞、配子和单倍体细胞关于外植体的制备（一）培养材料（全能细胞）采集7（二）培养材料的消毒（二）培养材料的消毒材料洗净、沥干、切成小块材料洗净、沥干、切成小块 70%酒精或酒精或-10H2O2浸泡浸泡30-60s（无菌（无菌环境）环境）消毒消毒10min（饱和漂白粉液或（饱和漂白粉液或0.01%HgCl2）无菌水冲洗干净无菌水冲洗干净(3-4次次)（二）培养材料的消毒8（三）制备外植体（三）制备外植体将消毒材料按培养要求进行处理将消毒材料按培养要求进行处理如：切成如：切成0.2-0.5cm厚的小块厚的小块(片片);去除芽的鳞片、嫩枝的外皮、种皮去除芽的鳞片、嫩枝的外皮、种皮胚乳等。但叶片不需剥皮胚乳等。但叶片不需剥皮注意：注意：整个过程无菌操作；严禁用手触整个过程无菌操作；严禁用手触摸材料摸材料（三）制备外植体9离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织或细胞或细胞 (外植体外植体)愈愈伤伤组组织织根根芽芽植植物物体体脱分化脱分化再分化再分化植物组织培养过程植物组织培养过程离体的植物器官、组织或细胞 (外植体)愈伤组织根植物10关于接种与培养关于接种与培养接种：外植体植入培养基上（接种：外植体植入培养基上（4-10个个/瓶）瓶）封口：培养瓶、管等用无菌材料密封封口：培养瓶、管等用无菌材料密封愈伤组织培养：外植体膨大形成愈伤组愈伤组织培养：外植体膨大形成愈伤组 织（脱分化）织（脱分化）增殖：继代培养与分化培养。增殖：继代培养与分化培养。25C左右左右 培养出新梢，分株或切段后于增培养出新梢，分株或切段后于增 殖培养基上继续培养成芽苗殖培养基上继续培养成芽苗关于接种与培养接种：外植体植入培养基上（4-10个/瓶）11含有全部营养成分的含有全部营养成分的培养基培养基、一定的、一定的温度、空气、无菌环境、适合的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。适时光照等。二、植物组织培养3.植物组织培养条件：植物组织培养条件：含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的12植物组培流程植物组培流程13无菌操作及操作车间无菌操作无菌操作无菌操作车间无菌操作车间无菌操作及操作车间无菌操作无菌操作车间14植物组培室植物组培室15关于培养基培养基大致由培养基大致由6种成分组成：种成分组成：（1）糖类）糖类（2）多种无机盐类）多种无机盐类（3）微量元素）微量元素（4）氨基酸、酰胺、嘌呤：）氨基酸、酰胺、嘌呤：如如BA（5）维生素；生长素）维生素；生长素:如如NAA、IBA目前以目前以Ms （Murashige and Skoog）培养基配方培养基配方为最常用的一种基本培养基，为最常用的一种基本培养基，它利于一般植物组织和细胞的快速生长。它利于一般植物组织和细胞的快速生长。关于培养基培养基大致由6种成分组成：164.植物组织培养的应用：植物组织培养的应用：（1 1）试管苗的快速繁殖）试管苗的快速繁殖（2 2）无病毒植物的培育）无病毒植物的培育（3 3）品种选育品种选育（4 4）人工种子）人工种子（5 5）转基因植物的培育）转基因植物的培育4.植物组织培养的应用：17品种选育利用组织培养解决杂交育种中的种胚败利用组织培养解决杂交育种中的种胚败育问题，获得了杂种子代，使育问题，获得了杂种子代，使远缘杂交远缘杂交得以成功得以成功；用花药培养和对未传粉的子房进行离体用花药培养和对未传粉的子房进行离体培养，获培养，获得了单倍体植株，得了单倍体植株，从而从而开辟了开辟了单倍体育种的途径单倍体育种的途径；通过胚乳离体培养，获得了三倍体植株，通过胚乳离体培养，获得了三倍体植株，为改良农、林、果树和蔬菜的为改良农、林、果树和蔬菜的三倍体育三倍体育种提供了新的方法种提供了新的方法；品种选育利用组织培养解决杂交育种中的种胚败育问题，获得了杂种18人工种子所谓所谓人工种子人工种子，就是将组织培养产生，就是将组织培养产生的体的体细胞胚或不定芽细胞胚或不定芽包裹在能提供养包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具具有保护功能和防止机械损伤的外膜有保护功能和防止机械损伤的外膜，造成一种类似于种子的结构。造成一种类似于种子的结构。人工种子所谓人工种子，就是将组织培养产生的体细胞胚或不定芽包19人工种子1978年年Murashige提出人工种子提出人工种子欧共体将人工种子的研制列欧共体将人工种子的研制列入入“尤里卡尤里卡”计划计划.国外成功了胡萝卜、苜蓿、芹菜、国外成功了胡萝卜、苜蓿、芹菜、莴苣、花椰菜、花旗参、天竺葵等莴苣、花椰菜、花旗参、天竺葵等我国于我国于1987年将其列入年将其列入863计划。经过计划。经过20多年的努力，人工种子研究已取得了很多年的努力，人工种子研究已取得了很大进展大进展，成功了旱芹、花椰菜、杂交水，成功了旱芹、花椰菜、杂交水稻等的人工种子稻等的人工种子。人工种子1978年Murashige提出人工种子20人工种子优点：优点：结构完整，体积小，便于运输和储藏；结构完整，体积小，便于运输和储藏；体细胞繁殖快，占用空间小，可批量生产人体细胞繁殖快，占用空间小，可批量生产人工种子；工种子；可增加产品产量，改进商品品质，提高作物可增加产品产量，改进商品品质，提高作物抗性；抗性；对于育性不佳的材料，可保持种质资源，不对于育性不佳的材料，可保持种质资源，不致退化。致退化。人工种子优点：21人工种子人工种子的制作人工种子的制作人工种子人工种子的制作22离体植离体植物细胞物细胞愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体根芽根芽植物体植物体脱分化脱分化再分化再分化二、植物组织培养 植物组织培养应用举例（一）植物组织培养应用举例（一）离体植愈伤组织胚状体根芽植物体脱分化再分化二、植物组织培养 23 紫草紫草紫草素紫草素 愈伤组织愈伤组织二、植物组织培养 植物组织培养应用举例（二）植物组织培养应用举例（二）紫草紫草素 愈伤组织二、植物组织培养 植物组织培养应用举24胚胚 状状 体体人工种皮人工种皮人工胚乳人工胚乳二、植物组织培养 植物组织培养应用举例（三）植物组织培养应用举例（三）人工种子人工种子人工种子人工种子胚 状 体人工种皮人工胚乳二、植物组织培养 植物组织培养25三、植物细胞培养三、植物细胞培养1、定义与方法、定义与方法定义：定义：指在离休条件下，将愈伤组织等指在离休条件下，将愈伤组织等置于液体培养基中振荡培养，得到分散置于液体培养基中振荡培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。术。三、植物细胞培养1、定义与方法26方法方法:(1)据培养对象据培养对象单细胞培养单细胞培养:单倍体培养单倍体培养:主要指花药培养主要指花药培养原生质体培养原生质体培养:(2)据培养系统据培养系统悬浮培养悬浮培养;液体培养液体培养;固体培养固体培养固定化培养固定化培养:将细胞包埋在海藻酸盐中进将细胞包埋在海藻酸盐中进 行固体培养行固体培养方法:272、培养基、培养基无机盐：无机盐：25mmol/L左右左右碳源：蔗糖或葡萄糖碳源：蔗糖或葡萄糖植物生长激素：生长素，如植物生长激素：生长素，如IAA;NAA 分裂素分裂素,主要为腺嘌呤衍生物主要为腺嘌呤衍生物有机氮源有机氮源:蛋白水解物蛋白水解物有机酸有机酸复合物质复合物质:主要作细胞生长调节剂主要作细胞生长调节剂2、培养基283、植物细胞培养、植物细胞培养（1）单细胞制备方法）单细胞制备方法机械法：机械法：酶解法：酶解法：愈伤组织诱导法：高频振荡使愈伤组织愈伤组织诱导法：高频振荡使愈伤组织分散成单个细胞分散成单个细胞3、植物细胞培养29(2)单细胞培养方法单细胞培养方法平板培养法平板培养法:类似于微生物的平板培养类似于微生物的平板培养看护培养看护培养:饲养层培养饲养层培养:液体浅层静置培养液体浅层静置培养:细胞悬浮培养细胞悬浮培养:(2)单细胞培养方法30(3)细胞的保存细胞的保存继代培养保存法继代培养保存法:低温培养法低温培养法:一般一般5-10C下培养保存下培养保存冰冻保存冰冻保存:-20C保存保存,可可1-2年年3、植物细胞培养应用、植物细胞培养应用紫杉醇、紫草宁、人参紫杉醇、紫草宁、人参(3)细胞的保存31四、植物原生质体培养1、原生质体的制备、原生质体的制备（1）分离：机械法（质壁分离）分离：机械法（质壁分离）酶解法酶解法（2）纯化：离心沉降法）纯化：离心沉降法 漂浮法漂浮法2、活性测定、活性测定四、植物原生质体培养1、原生质体的制备323、原生质培养、原生质培养（1）液体培养：悬浮于液体培养基中，）液体培养：悬浮于液体培养基中，密度密度104-106个个/毫升毫升（2）固体平板：）固体平板：（3）双层培养：在固体琼脂培养基上加）双层培养：在固体琼脂培养基上加一薄层液体培养基，使固体培养与液体一薄层液体培养基，使固体培养与液体培养相结合，保持良好温度利于原生质培养相结合，保持良好温度利于原生质体生长。体生长。3、原生质培养334、植株再生、植株再生（1）细胞壁再生：叶绿体重新排列，并）细胞壁再生：叶绿体重新排列，并合成新的细胞壁合成新的细胞壁（）分裂：细胞分裂（注意补充新鲜（）分裂：细胞分裂（注意补充新鲜培养基）培养基）（）愈伤组织或胚状体形成（）愈伤组织或胚状体形成（）植株再生（）植株再生4、植株再生34两相培养技术 指在培养体系中加入水溶性或脂溶性指在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上下两相，细胞在物，使培养体系形成上下两相，细胞在水相中生长，合成代谢产物分泌出来后水相中生长，合成代谢产物分泌出来后移至有机相中。移至有机相中。这是一种较新的植物细胞培养技术这是一种较新的植物细胞培养技术两相培养技术 指在培养体系中加入水溶性或脂溶性的35