第03章-高效液相色谱法课件

1 第六节第六节 高效毛细管电泳高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳仪器一、高效毛细管电泳仪器1 第六节 高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳仪22334二、高效毛细管电泳基本原理二、高效毛细管电泳基本原理在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为的现象，称之为电泳电泳。由于。由于不同离子所带电荷及性质的不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离不同，迁移速率不同可实现分离。经典电泳分离法的不足：所用经典电泳分离法的不足：所用分离柱的柱径大，柱较短，分分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于离效率不高（远低于HPLC），），温度影响大。温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。了两项重要改进。4二、高效毛细管电泳基本原理5高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了一是采用了0.05mm内径的毛细管；内径的毛细管；二是采用了高达数千伏的电压。二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到米，特殊柱子可以达到数百万。数百万。5高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：6电泳现象与电渗流现象电泳现象与电渗流现象电泳现象电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度：带电离子在电场作用下的迁移，速度v电泳电泳电渗流现象电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基玻璃表面存在硅羟基,pH3时时,形成双电形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度速度v电渗流电渗流6电泳现象与电渗流现象7分离过程：分离过程：电场作用下电场作用下,柱中出现：柱中出现：电泳现象电泳现象和和电渗流现象电渗流现象带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和电泳和电渗流两种速度的矢量和正离子：两种效应的运动方向一致正离子：两种效应的运动方向一致,在负极最先流出在负极最先流出中性粒子无电泳现象中性粒子无电泳现象,受电渗流影响受电渗流影响,在阳离子后流出在阳离子后流出阴阴离离子子：两两种种效效应应的的运运动动方方向向相相反反，v电电渗渗流流 v电电泳泳时时,阴阴离离子子在在负负极极最最后后流流出出,在在这这种种情情况况下下,不不但但可可以以按按类类分分离离,除除中中性性粒粒子子外外,同同种种类类离离子子由由于于受受到到的的电电场场力力大大小小不不一一样样也同时被相互分离。也同时被相互分离。7分离过程：8 分离类型分离类型 1.毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE）最普遍、最基本的一种分离模式。最普遍、最基本的一种分离模式。2.毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、可分离测定蛋白质、DNA等。等。8 分离类型2.毛细管凝胶电泳（CGE）93.毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC）在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的外部带负电的胶束胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且由于电泳流和电渗流的方向相反，且v电渗流电渗流 v电泳电泳，则带负，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。93.毛细管胶束电动色谱（MECC）101011三、仪器装置三、仪器装置 电压：电压：030KV。分离柱不涂敷任何固定液，分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：（可检测到：10-1910-21 mol/L）11三、仪器装置 电压：030KV。12四、影响柱效的因素及改进方法四、影响柱效的因素及改进方法热效应热效应：焦耳热是影响柱效的主要因素。采用外部冷却：焦耳热是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微微安，一般几十微安。安，一般几十微安。电渗流控制电渗流控制：电渗流的大小和方向，依赖于毛细管壁与：电渗流的大小和方向，依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂，则可以改变电渗流的方向。入反转剂，则可以改变电渗流的方向。12四、影响柱效的因素及改进方法热效应：焦耳热是影响柱效的主13五、主要特点和应用五、主要特点和应用高分辨率高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度高灵敏度：可检测出低至：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。浓度的物质。高分析速度高分析速度：可在：可在3分钟内分离分钟内分离30种阴离子；种阴离子；1.7分钟分离分钟分离19种阳离子种阳离子;4分钟可分离分钟可分离10种蛋白质种蛋白质.试样用量少试样用量少：仅需几：仅需几nL（10-9 L）的试样的试样仪器简单，操作成本低仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。：分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：不足之处：进样不够方便。进样不够方便。应用范围相对较窄。应用范围相对较窄。13五、主要特点和应用高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至14第七节第七节 纸层析和薄层层析法纸层析和薄层层析法一、纸层析和薄层层析分离过程一、纸层析和薄层层析分离过程纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。纸层析和薄层层析流动相的移动是纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用依靠毛细作用。将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。14第七节 纸层析和薄层层析法15比移值比移值15比移值161617二、操作技术二、操作技术层析纸和层析板层析纸和层析板:特制的色层滤纸。特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。17二、操作技术层析纸和层析板:特制的色层滤纸。按需要剪裁181.展开剂展开剂展开剂：由一种或多种溶剂按一定比例组成。展开剂：由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1181.展开剂192.点样点样点点样样:用用微微量量注注射射器器或或玻玻璃璃毛毛细细管管吸吸取取一一定定量量试试样样点点在在原原点点上上。试试样样点点的的直直径径一一般般应应小小于于5mm。可可并并排点多个试样同时展开。排点多个试样同时展开。192.点样203.显色检测显色检测有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法常用的显色方法:喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。203.显色检测21三、特点及应用三、特点及应用优点：优点：平板色谱简单、方便、及操作费用低；平板色谱简单、方便、及操作费用低；可可以以在在一一块块层层析析板板上上同同时时展展开开多多个个试试样样及及将将多多条条滤滤纸纸同时展开；同时展开；采采用用方方形形薄薄层层板板还还可可以以方方便便的的进进行行二二维维展展开开，即即按按一一般般方方法法展展开开后后，改改变变方方向向和和展展开开剂剂再再次次展展开开，进进一一步步改善分离效果；改善分离效果；试样一般不需要经过预处理即可分离。试样一般不需要经过预处理即可分离。21三、特点及应用