常用的载体有质粒课件

基因工程菌的发酵工程菌的来源1工程菌的应用2工程菌的培养3氨基酸发酵的氮源选择4一、工程菌的来源基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代基因工程基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术、基因的突变技术、基因的导入技术等基因工程一、工程菌的来源表达载体 基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒外源基因插入载体中，使其处于一系列的表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体一、工程菌的来源质粒 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。质粒上常有抗生素的抗性基因一、工程菌的来源目的基因的获得 载体的选择与制备 目的基因与载体连接成重组体 转化或转染受体细胞 重组菌的筛选及目的基因的表达 构建步骤 一、工程菌的来源构建步骤 一、工程菌的来源苏氨酸基因工程菌构建策略 二、工程菌的应用就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点三、工程菌的培养基因工程细胞工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。其原因主要与基因工程细胞特点有关，首先基因工程细胞的生长速率及表达率与其所载外源DNA的稳定性及产物分泌过程有关，其中重组DNA的稳定性尤为重要基因工程细胞培养过程，重组DNA的丢失方式亦有两种，其一是细胞培养过程，由于回复突变或分配作用致使DNA丢失，称为脱落性不稳定，其二是重组DNA中编码的结构基因在宿主内发生再重组过程产生突变，不再表达目的产物，称为结构性不稳定培养特点三、工程菌的培养质粒稳定性 三、工程菌的培养在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化质粒稳定性 三、工程菌的培养使质粒稳定的措施 组建合适载体选择适当宿主施加选择压力抗生素添加法抗生素依赖变异法营养缺陷型法控制基因过量表达控制培养条件（温度、pH、DO）控制培养条件 三、工程菌的培养培养基组成：不同的培养基能影响微生物的代谢活动，也能影响质粒的稳定性。质粒在丰富培养基中比在最低限量培养基中更加不稳定 培养温度：含有重组质粒的克隆菌的比生长速率往往比受体菌要小，同样质粒导入受体菌后会使受体菌的生长温度改变。通常而言，低温有利于重组质粒稳定地遗传控制培养条件 三、工程菌的培养溶氧：携带质粒的基因工程菌相对于野生菌增加了额外的代谢负担，对氧需求量较大，发酵液中必须有足够浓度的溶解氧，才能满足菌体生长及产物合成的需要过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，菌体生长受到抑制，质粒稳定性差控制培养条件 三、工程菌的培养菌体比生长速率：比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。有时，比生长速率大有利于重组质粒稳定地遗传如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的克隆菌生长快，则重组质粒的丢失就不会导致非常严重的后果。因此调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但这点往往难以达到，因为大多数环境条件同时提高或降低这两种菌的比生长速率在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，来提高重组质粒的稳定性。如在重组质粒中克隆入抗高浓度抑制的某个基因，这样在进行高浓度底物培养时，受体菌被抑制，比生长速率下降，而重组菌仍能正常生长三、工程菌的培养在基因工程细胞培养工程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，尽可能提高细胞内质粒拷贝数在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高在基因工程细胞培养工程中，需根据其固有特点和具体情况，采取相应措施、提高质粒稳定性，增加质粒拷贝数，实现培养条件优化，提高表达效率表达效率及质粒拷贝数控制 三、工程菌的培养高密度发酵 大肠杆菌对糖类的转运能力很强，由于大肠杆菌的氧化磷酸化和TCA循环的能力有限，造成碳代谢流在糖酵解途径中过量，大肠杆菌主要通过分泌部分氧化的副产物使碳代谢流得到平衡，而乙酸就是其中的主要副产物阻断乙酸的主要产生途径；限制糖酵解途径上的碳代谢流；将过量的碳代谢流转化为其它低毒的副产物；对碳代谢流进行分流 三、工程菌的培养碳源 碳源碳源L-L-色氨酸产量色氨酸产量(g/L)(g/L)葡萄糖葡萄糖5.15.1蔗糖蔗糖8.68.6乳糖乳糖8.18.1麦芽糖麦芽糖8.38.3葡萄糖蔗糖比例葡萄糖蔗糖比例L-L-色氨酸产量色氨酸产量(g/L)(g/L)2:12:18.618.613:13:17.347.344:14:16.836.835:15:14.294.29 过低或过高的初糖浓度都不利于菌体生长和产酸三、工程菌的培养碳源 葡萄糖初始浓度 三、工程菌的培养碳源 葡萄糖维持浓度维持发酵液中低葡萄糖浓度，菌体比生长速率较小，质粒稳定性高，乙酸生成量少 应用溶氧反馈控制补料发酵 三、工程菌的培养碳源 迅速利用的氮源l氨基（或铵）态氮的氨基酸（或硫酸铵等）、玉米浆l容易被菌体利用，促进菌体生长缓慢利用的氮源l酵母、蛋白胨l延长代谢产物的分泌期、提高产物的产量；但一次投入也容易促进菌体生长和养分过早耗尽，以致菌体过早衰老而自溶发酵培养基一般选用含有快速和慢速利用的混合氮源四、氮源的选择-色氨酸 氮源的影响及控制 由图可知，以硫酸铵作无机氮源，菌体生长和产酸优于其它无机氮源，这主要是因为硫酸铵不仅为菌体生长和发酵产酸提供氮元素，其中的 SO42-也是菌体代谢中不可缺少的成分。硫元素是构成细胞物质的重要成分，其主要作用是供给甲硫氨酸、半胱氨酸和若干辅酶(如焦磷酸硫胺素、辅酶 A、硫辛酸)合成的需要，这些辅酶在微生物代谢中起重要作用四、氮源的选择-色氨酸 不同无机氮源氨氮浓度 氨氮浓度过高对菌体生长和 色氨酸均有明显的抑制作用 四、氮源的选择-色氨酸 氨氮浓度 控制方式控制方式丙酮酸（丙酮酸（g/Lg/L）乳酸（乳酸（g/Lg/L）乙酸乙酸（g/Lg/L）120 mmol/L120 mmol/L0.210.212.52.52.232.230 g/L0 g/L0.040.044.54.52.462.462 g/L2 g/L0.060.065.375.373.063.065 g/L5 g/L0.070.076.416.413.313.31四、氮源的选择-色氨酸 氨氮浓度 随着NH4+浓度的增加，菌体耗糖速率减慢，说明NH4+影响大肠杆菌对糖类的代谢四、氮源的选择-色氨酸 氨氮浓度 利用NaOH控制发酵液中NH4+浓度在120 mmol/L，减少NH4+对菌体生长和L-色氨酸生产的抑制作用四、氮源的选择-色氨酸 酵母粉作为有机氮源，对菌体生长和产酸最为有利，其次分别是蛋白胨、玉米浆、豆浓。酵母粉含有大量游离氨基酸，减少了菌体合成代谢的需求量，降低比摄糖速率，最终减少发酵过程中乙酸的产生，解除乙酸对细胞生长和产酸的抑制四、氮源的选择-色氨酸 不同有机氮源 由图可知，1.0 g/L 的酵母粉用量对菌体生长和 L-色氨酸生产最为有利;当添加量为 0.5 g/L 时，菌体生长缓慢，L-色氨酸的产量也较低;当添加量为2.5 g/L 和 5.0 g/L 时，发酵前期菌体的比生长速率和比产酸速率较高，但进入主发酵期菌体生长动力不足，活力低，导致产酸水平低。因此，氮源不足，菌体繁殖量少，产酸水平低;氮源过量，菌体生长过于旺盛，会使菌体提前衰老和自溶，最终导致产酸水平低四、氮源的选择-色氨酸 酵母粉浓度发酵过程分析 根据以上实验结果，采取酵母粉 1.0 g/L 和cNH4+10 g/L，利用 NaOH 和氨水混合补料控制NH4+浓度 120 mmol/L 以下，对产酸有利四、氮源的选择-色氨酸 工程菌是氨基酸发酵趋势对工程菌发酵而言，有机氮源是非常重要的影响因素，总氮、氨基氮、氨基酸成分对于菌体生长代谢、比生长速率、质粒拷贝数、质粒稳定性、相关酶表达活力至关重要对发酵过程控制而言，碳源和有机氮源的补料方式、溶氧控制、pH控制也是影响工程菌发酵的重要因素通过比较实验，酵母粉对工程菌生长和产酸最为有利谢 谢！