常用分子生物学技术原理及应用课件

目录目录常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology目录目录分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique目录目录n核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)n在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子单链分子放在同一溶液中，或把放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的碱的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目录目录复性复性RNADNA目录目录（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NCNC等各种膜上，使之成为固相化分子。这等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为称之为“blotting”“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。目录目录用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NCNC膜上的核苷酸膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术（二）探针技术目录目录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹(Southern blotting)（二）（二）RNA印迹印迹(Northern blotting)（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。目录目录n其他：其他：n斑点印迹斑点印迹(dot blotting)n原位杂交原位杂交(in situ hybridization)nDNA点阵点阵(DNA array)nDNA芯片技术芯片技术(DNA chip)目录目录三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验目录目录放放射射自自显显影影照照片片目录目录DNA芯片芯片技术技术目录目录PCR技术的原理与应用技术的原理与应用The Principle and Application of PCR Technology目录目录5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5Template DNA一、一、PCRPCR技术的工作原理技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 目录目录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目录目录PCR技术原理示意图技术原理示意图 目录目录n PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性9595C C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目录目录模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+n PCR PCR体系基本组成成分体系基本组成成分目录目录利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直接以组织和细胞的直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利利用用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中克克隆隆基因。基因。二、二、PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆目录目录利利用用PCRPCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目目的的基基因因片片段段进进行行嵌嵌和和、缺缺失失、点点突突变等改造。变等改造。PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA的的量量要要求求很很低低，是是DNA和和RNA微微量量分分析析的的最好方法。最好方法。（三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突变（二）基因突变目录目录将将PCRPCR技技术术引引入入DNADNA序序列列测测定定，使使测测序序工工作大为简化，也提高了测序的速度；作大为简化，也提高了测序的速度；待待测测DNADNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定的的载载体体后后进进行序列测定，也可直接测定。行序列测定，也可直接测定。PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性。（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析目录目录逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。（一）逆转录（一）逆转录PCR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCRPCR衍生技术衍生技术目录目录原原位位PCR(in situ PCR)是是在在组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片上上的的单单个个细细胞胞内内进进行行的的PCR反反应应，然然后后用用特特异异性性探探针针进进行行原原位位杂杂交交，即即可可检检出出待待测测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。是否在该组织或细胞中存在。原原位位PCR方方法法弥弥补补了了PCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术的的不不足足，是是将将目目的的基基因因的的扩扩增增与与定定位位相相结结合合的的一一种最佳方法。种最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技术技术目录目录（三）实时（三）实时PCR技术技术实实时时PCR(real-time PCR(real-time PCR)PCR)技技术术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量，消消除除了了产产物物堆堆积积对定量分析的干扰，亦被称为定量对定量分析的干扰，亦被称为定量PCRPCR。目录目录n实时实时PCRPCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355目录目录n实时实时PCRPCR分类：分类：实时实时PRC非探针类非探针类探针类探针类1.TaqMan1.TaqMan探针法探针法 2.2.分子信标探针法分子信标探针法 3.FRET3.FRET探针法探针法 目录目录图图20-3 TaqMan探针法实时探针法实时PCR原理示意图原理示意图目录目录基因文库基因文库Gene Library目录目录基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n基因文库基因文库(gene library)(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列的序列的克隆群体。克隆群体。目录目录一、基因组一、基因组DNADNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的基因组文库是指生物的基因组DNADNA的信的信息（包括所有的编码区和非编码区）以息（包括所有的编码区和非编码区）以DNADNA片段片段形式贮存的克隆群体。形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人工染色体等。目录目录n基因组文库和基因组文库和cDNAcDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选目录目录第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例目录目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以序列的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、二、cDNAcDNA文库文库目录目录生物芯片技术生物芯片技术Biological Chip Biological Chip TechniqueTechnique目录目录是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排列片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作性和定量的结果。该技术亦被称作DNADNA微阵列微阵列(DNA(DNA microarray)microarray)。一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)目录目录n基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图目录目录是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片作用原理蛋白质芯片作用原理目录目录生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study目录目录一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用蛋白质相互作用的研究技术目录目录标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。合的未知分子。目录目录标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图目录目录（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途目录目录n酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。目录目录（三）免疫共沉淀技术的基本原理和用途（三）免疫共沉淀技术的基本原理和用途免疫沉淀（免疫沉淀（immunoprecipitation IP）免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。利用抗体可与抗原特异性的蛋白的一种方法。利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。系沉淀下来。免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。互作用的有效方法。CO-IP与质谱分析与质谱分析 以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀纯化靶蛋白免体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白的结合蛋白目录目录n免疫沉淀原理图解免疫沉淀原理图解目录目录n免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解目录目录n免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解蛋白蛋白A，蛋白蛋白B 抗抗A抗体抗体C进行洗脱进行洗脱抗抗B抗体抗体D进行验证进行验证IP C ACO-IP C A+B D目录目录nCO-IPCO-IP与质谱分析流程与质谱分析流程目录目录电电 泳泳 迁迁 移移 率率 变变 动动 测测 定定(electrophoretic(electrophoretic mobility mobility shift shift assayassay，EMSA)EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel(gel shift shift assay)assay)最最初初用用于于研研究究DNADNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应DNADNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNARNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNARNA序序列列间间的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定目录目录放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图目录目录染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin(chromatin immunoprecipitation immunoprecipitation assay,assay,ChIP)ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNADNA与与蛋蛋白白质质相相互互作用的主要方法。作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法目录目录n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图目录目录二、二、RNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术RNARNA结结 合合 蛋蛋 白白 免免 疫疫 沉沉 淀淀（RNA RNA Binding Binding Protein Protein ImmunoprecipitationImmunoprecipitation，RIPRIP），是是研研究细胞内究细胞内RNARNA与蛋白结合情况的技术。与蛋白结合情况的技术。应用范围：应用范围：研究蛋白与研究蛋白与DNADNA动态作用动态作用研研究究组组蛋蛋白白的的各各种种共共价价修修饰饰与与基基因表达之间的关系因表达之间的关系研究蛋白与研究蛋白与RNARNA的相互作用的相互作用目录目录激光共聚集显微镜应用技激光共聚集显微镜应用技术术Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)目录目录激光经放大、激光经放大、分光后由物镜分光后由物镜聚焦于焦平面聚焦于焦平面上，同时，焦上，同时，焦平面上被激光平面上被激光扫描的点扫描的点F F所发所发出的一定波长出的一定波长的荧光通过检的荧光通过检测针孔光栏达测针孔光栏达到检测器，并到检测器，并成像于显示器成像于显示器上，得到相应上，得到相应的荧光图象。的荧光图象。n激光共聚焦显微镜工作原理示意图激光共聚焦显微镜工作原理示意图目录目录n人眼及各类显微镜分辩率人眼及各类显微镜分辩率人眼分辩率人眼分辩率 0.20mm光学显微镜分辩率光学显微镜分辩率 0.25um共焦显微镜分辩率共焦显微镜分辩率 0.18um电子显微镜分辩率电子显微镜分辩率 0.20nm激光共聚焦显微镜有四个荧光通道，一个透射激光共聚焦显微镜有四个荧光通道，一个透射光通道光通道目录目录n激光共聚焦显微镜的应用激光共聚焦显微镜的应用定位、定量定位、定量三维重组三维重组动态测量动态测量 活细胞或组织内游离活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化分布和浓度的变化 测量测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位蛋白质的转位活细胞内活细胞内H+浓度（浓度（pH值）的测量值）的测量线粒体膜电位的测量线粒体膜电位的测量荧光漂白恢复（荧光漂白恢复（FRAP）的测量）的测量笼锁解笼锁的测量笼锁解笼锁的测量荧光能量共振转移（荧光能量共振转移（FRET）的测量）的测量其他应用其他应用目录目录目录目录Thank you!