基因工程基因工程概述课件

第二章第二章 基因工程基因工程第二章 基因工程1第一节第一节 基因工程概述基因工程概述n n一、基因工程的含义n n按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNADNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含义。义。第一节 基因工程概述一、基因工程的含义2第一节第一节 基因工程概述基因工程概述n n二、基因工程研究的理论依据n n（一）不同基因具有相同的物质基础（一）不同基因具有相同的物质基础n n（二）基因是可以切割的（二）基因是可以切割的n n（三）基因是可以转移的（三）基因是可以转移的n n（四）多肽与基因之间存在对应关系（四）多肽与基因之间存在对应关系n n（五）遗传密码是通用的（五）遗传密码是通用的n n（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代一代第一节 基因工程概述二、基因工程研究的理论依据3第一节第一节 基因工程概述基因工程概述n n三、基因工程操作的基本技术路线第一节 基因工程概述三、基因工程操作的基本技术路线4第一节第一节 基因工程概述基因工程概述n n四、基因工程研究最突出的优点n n打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌（菌（E.coliE.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动）中表达，细菌的基因可以转移到动植物中表达。植物中表达。第一节 基因工程概述四、基因工程研究最突出的优点5第二节第二节 DNA重组重组n n一、DNA概述n n（一）（一）DNADNA的组的组成和结构成和结构第二节 DNA重组一、DNA概述6双链DNA示意图 双链DNA示意图 7第一节第一节 基因工程概述基因工程概述终止子发夹结构模式 n n一、DNA概述n n（二）（二）DNADNA的功的功能能n n1.DNA1.DNA分子能在分子能在细胞内复制细胞内复制n n2.2.携带遗传信息携带遗传信息第一节 基因工程概述终止子发夹结构模式 一、DNA概述8第二节第二节 DNA重组重组n n二、目的DNA片段的获得n n（一）限制性内切核酸酶和（一）限制性内切核酸酶和DNADNA片段化片段化n n1.1.限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶n n2.2.限制性内切核酸酶的识别序列限制性内切核酸酶的识别序列n n3.3.限制性内切核酸酶的酶切位点限制性内切核酸酶的酶切位点n n4.4.限制性内切核酸酶反应系统限制性内切核酸酶反应系统n n5.5.用限制性内切核酸酶酶切用限制性内切核酸酶酶切DNADNA的方法的方法第二节 DNA重组二、目的DNA片段的获得9限制性内切核酸酶酶切限制性内切核酸酶酶切DNA的位点和酶切片段的末端的位点和酶切片段的末端 限制性内切核酸酶酶切DNA的位点和酶切片段的末端 10DNA酶切片段电泳示意图酶切片段电泳示意图 DNA酶切片段电泳示意图 11第二节第二节 DNA重组重组n n二、目的DNA片段的获得n n（二）特异性（二）特异性DNADNA片段的片段的PCRPCR扩增扩增n n1.PCR1.PCR基本原理基本原理n n2.2.耐热性耐热性DNADNA聚合酶聚合酶n n3.PCR3.PCR引物引物n n4.DNA4.DNA片段片段PCRPCR扩增系统扩增系统第二节 DNA重组二、目的DNA片段的获得12 PCR扩增特异性扩增特异性DNA片段过程片段过程 PCR扩增特异性DNA片段过程 13第二节第二节 DNA重组重组n n二、目的DNA片段的获得n n（三）（三）DNADNA片段的化学合成片段的化学合成n n1.1.合成引物合成引物n n2.2.合成合成DNADNA寡核苷酸连杆寡核苷酸连杆n n3.3.合成基因片段合成基因片段第二节 DNA重组二、目的DNA片段的获得14第二节第二节 DNA重组重组n n三、DNA片段的连接n n（一）（一）DNADNA连接酶连接酶n n（二）（二）DNADNA片段之间的连接片段之间的连接n n1.1.互补黏性末端片段之间的连接互补黏性末端片段之间的连接n n2.2.平末端平末端DNADNA片段之间的连接片段之间的连接n n3.DNA3.DNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接n n4.DNA4.DNA片段加连杆或衔接头后连接片段加连杆或衔接头后连接第二节 DNA重组三、DNA片段的连接15第二节第二节 DNA重组重组n n三、DNA片段的连接n n（三）（三）DNADNA重组类型重组类型n n1.1.插入重组插入重组n n2.2.置换重组置换重组第二节 DNA重组三、DNA片段的连接16第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n一、质粒载体n n（一）大肠杆菌质粒载体（一）大肠杆菌质粒载体第三节 基因克隆载体一、质粒载体17第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n一、质粒载体n n（二）蓝藻和大肠杆菌穿梭质粒载体（二）蓝藻和大肠杆菌穿梭质粒载体第三节 基因克隆载体一、质粒载体18第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n一、质粒载体n n（三）农杆菌（三）农杆菌TiTi质粒载体质粒载体n n（四）酵母（四）酵母2m2m质粒载体质粒载体用于植物转基因的克隆载体示意图用于植物转基因的克隆载体示意图 第三节 基因克隆载体一、质粒载体用于植物转基因的克隆载体示意19第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n二、病毒（噬菌体）克隆载体n n（一）噬菌体克隆载体（一）噬菌体克隆载体n n1.1.噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）克隆载体20第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n二、病毒（噬菌体）克隆载体n n（一）噬菌体克隆载体（一）噬菌体克隆载体n n2.cosmid2.cosmid载体载体第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）克隆载体21第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n二、病毒（噬菌体）克隆载体n n（二）植物病毒克隆载体（二）植物病毒克隆载体35S启动子表达载体示意图启动子表达载体示意图 第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）克隆载体35S启动子表22第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n二、病毒（噬菌体）克隆载体n n（三）动物病毒克隆载体（三）动物病毒克隆载体 痘苗病毒载体示意图痘苗病毒载体示意图 第三节 基因克隆载体二、病毒（噬菌体）克隆载体 痘苗病毒载体23第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n三、人工染色体载体大片段克隆载体 HAC构建示意图构建示意图第三节 基因克隆载体三、人工染色体载体大片段克隆载体 H24第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n三、人工染色体载体大片段克隆载体第三节 基因克隆载体三、人工染色体载体大片段克隆载体25第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n四、体内同源重组整合载体（系统）n n（一）常规基因定位整合系统（一）常规基因定位整合系统第三节 基因克隆载体四、体内同源重组整合载体（系统）26第三节第三节 基因克隆载体基因克隆载体n n四、体内同源重组整合载体（系统）n n（二）基于噬菌体（二）基于噬菌体P1P1的的CreCreLoxLox定位重组系统定位重组系统第三节 基因克隆载体四、体内同源重组整合载体（系统）27 Cre介导几种可能发生的重组方式介导几种可能发生的重组方式P:启动子；启动子；：loxp；a、b、c、d、e、f、g、h：相：相关基因关基因 Cre介导几种可能发生的重组方式28第四节第四节 目的基因的制备目的基因的制备n n一、目的基因的来源n n目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基因组，特别是人和动植物染色体中蕴藏着体基因组，特别是人和动植物染色体中蕴藏着大量的基因，是获得目的基因的主要来源大量的基因，是获得目的基因的主要来源n n原核生物的染色体基因组也是目的基因来源的原核生物的染色体基因组也是目的基因来源的候选者候选者 n n质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组也有少量的基因基因组和叶绿体基因组也有少量的基因 第四节 目的基因的制备一、目的基因的来源29第四节第四节 目的基因的制备目的基因的制备n n二、分离目的基因的途径n n（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因目的基因第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径30第四节第四节 目的基因的制备目的基因的制备n n二、分离目的基因的途径n n（二）利用（二）利用PCRPCR直接扩增目的基因直接扩增目的基因第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径31第四节第四节 目的基因的制备目的基因的制备n n二、分离目的基因的途径n n（三）目的基因的化学合成（三）目的基因的化学合成第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径32第四节第四节 目的基因的制备目的基因的制备n n二、分离目的基因的途径n n（四）通过构建基因组文库或（四）通过构建基因组文库或cDNAcDNA文库分离文库分离目的基因目的基因n n1.1.基因组文库基因组文库第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径33第四节第四节 目的基因的制备目的基因的制备n n二、分离目的基因的途径n n2.cDNA2.cDNA文库文库第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径34第四节第四节 目的基因的制备目的基因的制备n n二、分离目的基因的途径n n3.3.从基因组文库或从基因组文库或cDNAcDNA文库中获得目的基因文库中获得目的基因第四节 目的基因的制备二、分离目的基因的途径35第五节第五节 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n n一、受体细胞n n（一）原核生物细胞（一）原核生物细胞n n（二）真核生物细胞（二）真核生物细胞第五节 目的基因导入受体细胞一、受体细胞36第五节第五节 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n n二、重组二、重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞n n（一）外源（一）外源DNADNA转化方法转化方法n n化合物诱导转化法化合物诱导转化法 n n致癌农杆菌介导的致癌农杆菌介导的TiTi质粒载体转化法质粒载体转化法 n n电穿孔转化法电穿孔转化法n n微弹轰击转化法微弹轰击转化法 n n激光微束穿孔转化法激光微束穿孔转化法 n n超声波处理转化法超声波处理转化法 n n脂质体介导转化法脂质体介导转化法 n n体内注射转化法体内注射转化法 n n花粉管通道转化法花粉管通道转化法 n n精子介导法精子介导法 n n低能离子束介导转化法低能离子束介导转化法 第五节 目的基因导入受体细胞二、重组DNA分子导入受体细胞37第五节第五节 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n n二、重组DNA分子导入受体细胞n n（二）病毒（噬菌体）颗粒转导法（二）病毒（噬菌体）颗粒转导法n n用病毒（噬菌体）的用病毒（噬菌体）的DNADNA（或（或RT-DNART-DNA）构建的克）构建的克隆载体（或携带目的基因），在体外包装成病毒隆载体（或携带目的基因），在体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组重组DNADNA进入受体细胞。将此过程称为病毒（噬进入受体细胞。将此过程称为病毒（噬菌体）颗粒转导（菌体）颗粒转导（transductiontransduction）法）法,主要用于构建主要用于构建基因文库和动物的转基因，早期也用于植物的转基因文库和动物的转基因，早期也用于植物的转基因。基因。第五节 目的基因导入受体细胞二、重组DNA分子导入受体细胞38第五节第五节 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n n三、克隆子的筛选三、克隆子的筛选n n（一）根据载体标记基因筛选转化子（一）根据载体标记基因筛选转化子n n1.1.根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子筛选转化子第五节 目的基因导入受体细胞三、克隆子的筛选39第五节第五节 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n n三、克隆子的筛选三、克隆子的筛选n n（一）根据载体标记基因筛选转化子（一）根据载体标记基因筛选转化子n n2 2根据载体除草剂抗性基因和相应的性质药根据载体除草剂抗性基因和相应的性质药物筛选转化子物筛选转化子n n3.3.根据根据lacZlacZ基因互补显色筛选转化子基因互补显色筛选转化子n n4.4.根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛选转化子选转化子n n5.5.根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛选转化子选转化子第五节 目的基因导入受体细胞三、克隆子的筛选40第五节第五节 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n n三、克隆子的筛选三、克隆子的筛选n n（二）根据报道基因筛选重组子（二）根据报道基因筛选重组子n n1.-1.-葡萄糖酸苷酶基因（葡萄糖酸苷酶基因（gusgus）n n2.2.萤火虫荧光素酶基因萤火虫荧光素酶基因(luc)(luc)n n3.3.绿色荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因（gfpgfp）n n（三）根据形成噬菌斑筛选转化子（三）根据形成噬菌斑筛选转化子第五节 目的基因导入受体细胞三、克隆子的筛选41第六节第六节 重组子的鉴定重组子的鉴定n n一、根据重组一、根据重组DNA分子特征鉴定重组子分子特征鉴定重组子n n（一）根据重组（一）根据重组DNADNA分子大小鉴定重组子分子大小鉴定重组子n n（二）根据重组（二）根据重组DNADNA分子限制性内切核酸酶分子限制性内切核酸酶酶切图谱鉴定重组子酶切图谱鉴定重组子n n（三）根据（三）根据PCRPCR扩增片段鉴定重组子扩增片段鉴定重组子n n（四）采用（四）采用DNADNA杂交法鉴定重组子杂交法鉴定重组子n n（五）应用（五）应用DNADNA芯片鉴定重组子芯片鉴定重组子n n（六）根据（六）根据DNADNA核苷酸序列鉴定重组子核苷酸序列鉴定重组子第六节 重组子的鉴定一、根据重组DNA分子特征鉴定重组子42第六节第六节 重组子的鉴定重组子的鉴定n n二、根据目的基因转录产物二、根据目的基因转录产物mRNA鉴定重鉴定重组子组子n n三、根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、三、根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子多肽鉴定重组子n n（一）蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子（一）蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子（一）蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子（一）蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子n n（二）免疫检测法鉴定重组子（二）免疫检测法鉴定重组子（二）免疫检测法鉴定重组子（二）免疫检测法鉴定重组子n n1.1.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法n n2.Western2.Western印迹法印迹法印迹法印迹法n n3.3.质谱分析法质谱分析法质谱分析法质谱分析法第六节 重组子的鉴定二、根据目的基因转录产物mRNA鉴定重组43第七节第七节 基因工程的应用和安全性问题基因工程的应用和安全性问题n n一、基因工程的应用一、基因工程的应用n n二、基因工程的安全性问题二、基因工程的安全性问题第七节 基因工程的应用和安全性问题一、基因工程的应用44植物基因组植物基因组DNA的提取的提取n n一、实验目的一、实验目的n n理解提取基因组理解提取基因组DNADNA的原理，学习植物基因组的原理，学习植物基因组DNADNA的提取方法。的提取方法。植物基因组DNA的提取一、实验目的45植物基因组植物基因组DNA的提取的提取n n二、实验原理二、实验原理二、实验原理二、实验原理n n利用基因组利用基因组DNADNA较长的特性，可以将其与细胞器或质较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子粒等小分子DNADNA分离。采用机械研磨的方法破碎植物分离。采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞。在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强的组织和细胞。在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨。离子还原剂以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨。离子型表面活性剂，能够使型表面活性剂，能够使DNADNA得以游离出来。苯酚和氯得以游离出来。苯酚和氯仿能使蛋白质变性，并使抽提液分相，经离心后除去仿能使蛋白质变性，并使抽提液分相，经离心后除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇使细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇使DNADNA沉淀，大沉淀，大分子分子DNADNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，用玻棒取出，沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，用玻棒取出，小分子小分子DNADNA形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。絮状到提取的目的。絮状DNADNA沉淀溶于沉淀溶于TETE溶液中，即得植溶液中，即得植物基因组物基因组DNADNA溶液。溶液。植物基因组DNA的提取二、实验原理46植物基因组植物基因组DNA的提取的提取n n三、实验仪器三、实验仪器n n高速冷冻离心机，台式高速离心机，恒温水浴高速冷冻离心机，台式高速离心机，恒温水浴锅，恒温摇床，电热恒温培养箱，超净工作台，锅，恒温摇床，电热恒温培养箱，超净工作台，低温冰箱，制冰机，高压灭菌锅。低温冰箱，制冰机，高压灭菌锅。n n实验试剂与用品：实验试剂与用品：TrisClTrisCl，EDTAEDTA，NaClNaCl，KAcKAc，SDSSDS，RNARNA酶酶A A，氯仿，异丙醇，无水乙醇，氯仿，异丙醇，无水乙醇，TETE，ddHddH2 2O O植物基因组DNA的提取三、实验仪器47植物基因组植物基因组DNA的提取的提取n n四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤n n1.1.取幼嫩的组织材料取幼嫩的组织材料1g1g，用蒸馏水冲洗干净，再用灭，用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌菌ddH2OddH2O冲洗冲洗2 2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有加有500L500L提取液的离心管中，每个离心管加入提取液的离心管中，每个离心管加入0.1g0.1g，轻轻混匀。轻轻混匀。n n2.2.向管中加入向管中加入50L20%SDS50L20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组震荡以防基因组DNADNA断裂，断裂，6565保温保温10min10min，并不时摇，并不时摇动。动。n n3.3.加入加入50L5molLKAc50L5molLKAc，混匀，置冰上，混匀，置冰上2030min.2030min.n n4.44.4，15000rmin15000rmin离心离心15min15min，转移上清液到新离心管，转移上清液到新离心管中，加入中，加入0.70.7倍体积的异丙醇，混匀，倍体积的异丙醇，混匀，-20-20沉淀沉淀30min30min。植物基因组DNA的提取四、实验步骤48植物基因组植物基因组DNA的提取的提取n n四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤n n5.12000rmin5.12000rmin离心离心10min10min回收基因组回收基因组DNADNA沉淀，吹干后沉淀，吹干后加入加入1mL1mL灭菌灭菌ddH2OddH2O或或TETE溶解溶解DNADNA。n n6.6.加入加入110110体积的体积的RNAaseARNAaseA，3737保温保温20min20min，除去，除去RNARNA。n n7.7.加入加入110110体积的体积的3molLNaAc3molLNaAc、2 2倍体积冰乙醇，混匀，倍体积冰乙醇，混匀，-20-20放置放置20min20min，DNADNA形成絮状沉淀。形成絮状沉淀。n n8.8000rmin8.8000rmin离心离心5min5min回收基因组回收基因组DNADNA沉淀。沉淀。n n9.70%9.70%乙醇漂洗沉淀乙醇漂洗沉淀DNADNA，再用干净吸水纸吸干。，再用干净吸水纸吸干。n n10.DNA10.DNA重溶解于重溶解于1mLTE1mLTE，-20-20储存。储存。植物基因组DNA的提取四、实验步骤49