基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件

基因工程之基因操作的工具酶培训课件基因工程之基因操作的工具酶培训课件DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成。种类：到目前为止，已从E.coli中发现了PolI、PolII、PolIII三种DNA聚合酶。其中PolI和PolII的主要功能是参与DNA的修复过程，PolIII与DNA的复制有关。三种聚合酶中，只有PolI同分子克隆关系密切。DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，3.3.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I（E.coliDNAPolI）DNAPolI是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65DNAPolI已得到高度纯化，从100kg大肠杆菌中可以分离到约500mg纯化的酶蛋白。每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的PolI。3.3.1大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNA1.DNA Pol I在空间结构上有三个位点：在空间结构上有三个位点：(1)DNA模板结合位点结合模板(2)核苷酸-磷酸结合位点结合引物(3)dNTP结合位点结合底物1.DNAPolI在空间结构上有三个位点：2.DNA Pol I是一种多功能酶：是一种多功能酶：(1)53的聚合酶活性催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3-OH末端，沿着引物的3-OH方向按模板顺序从53延伸。每分子DNApolI每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。2.DNAPolI是一种多功能酶：(2)53的外切酶活性只作用于双链DNA（dsDNA），从5端切割下一个个单核苷酸。(2)53的外切酶活性(3)35的外切酶活性能 从 游 离 的 3末 端 降 解 单 链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用。(3)35的外切酶活性在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的35外切酶活性受到53聚合酶活性的抑制。但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由35外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以35核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要。在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的33.E.coli DNA Pol I在基因工程中的用途在基因工程中的用途:(1)可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组(2)用于DNA序列分析(3)用于制备DNA探针在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸。随着反应的进行，5一侧的核苷酸不断地被移去，3一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动缺口平移（NickTranslation）。3.E.coliDNAPolI在基因工程中的用途:应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25l总体积中含有1g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNaseI、polI、32PdNTP和未标记的dNTP。脱氧核糖核苷酸酶I（DNaseI）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5-磷酸末端的单（寡）核苷酸。应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件由于32PdNTP比较昂贵，所以一般都采用低浓度的32PdNTP（2mol/L）和高浓度的未标记的dNTP（20mol/L）。而且就大多数实验的要求，使用一种32PdNTP就足够了，其他3种均可采用未标记的dNTP，或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32PdNTP。改 变 反 应 体 系 中 DNase I的 数 量，可 以 控 制32PdNTP的参入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP参入DNA链。由于32PdNTP比较昂贵，所以一般都采3.3.2 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 I的的Klenow片段片段 （E.coliDNAPolIKlenowfragment）用蛋白酶将DNAPolI作有限水解，可得到分子量为75000dal和36000dal的两个片段，大片段即称为Klenow片段，它具有53的聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了全酶的53的核酸外切酶活性。Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5延伸末端）。3.3.2大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件对于限制性核酸内切酶EcoRI切割后形成的5延伸末端可用32PdATP标记：而 BamH I切 割 后 形 成 的 5延 伸 末 端 可 用32PdGTP标记：对于限制性核酸内切酶EcoRI切割后形成的53.3.3 T4 DNA聚合酶聚合酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一种特殊的DNA聚合酶。1.T4 DNA聚合酶也是一种多功能酶：聚合酶也是一种多功能酶：(1)53的聚合酶活性(2)35的外切酶活性其外切酶活性比E.coliDNAPolI的活性高200倍。(3)取代反应活性如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的35外切酶活性将从dsDNA的3末端降解，直到互补于这个dNTP的碱基出现为止，然后在这一位置发生取代反应。3.3.3T4DNA聚合酶基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件2.T4 DNA聚合酶在基因工程中的应用聚合酶在基因工程中的应用(1)以填充反应标记带有5延伸末端的dsDNA片段(2)将DNA的3延伸末端切成平末端(3)以取代反应标记带有3延伸末端或平末端的dsDNA片段(4)以部分消化dsDNA法标记DNA片段作为杂交探针（链特异的探针）2.T4DNA聚合酶在基因工程中的应用基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件3.3.4 逆转录酶逆转录酶是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA称cDNA，即互补DNA。1.1.逆转录酶也是一个多功能酶：逆转录酶也是一个多功能酶：(1)RNA依赖的DNA聚合酶 以RNA链为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。几乎所有真核生物的mRNA分子3末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。3.3.4逆转录酶基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件(2)DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿53方向合成DNA链。可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。(2)DNA依赖的DNA聚合酶(3)外切RNA酶活性底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种：*从RNA链5末端外切：称53外切RNA酶*从RNA链3末端外切：称35外切RNA酶2.逆转录酶在基因工程中的应用：逆转录酶在基因工程中的应用：主要用途是转录真核生物的mRNA成为cDNA，从而制备基因片段。(3)外切RNA酶活性3.商品化的逆转录酶有两种：商品化的逆转录酶有两种：(1)禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶(2)Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶AMV逆转录酶虽能更有效地拷贝复杂的mRNA，但它有很强的外切RNA酶活性。而Mo-MLV逆转录酶的外切RNA酶活性较弱，更有利于制备全长的cDNA。两种逆转录酶均无35外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。3.商品化的逆转录酶有两种：3.4 DNA和和RNA的修饰酶的修饰酶3.4.1 核酸酶核酸酶SI1.作用特点：作用特点：此酶是从米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或ssRNA，又称单链特异性酶，其降解产物是5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。3.4DNA和RNA的修饰酶核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强。高浓度的核酸酶SI可从缺口（nick）或小裂缝（gap）处降解dsDNA。2.作用条件：作用条件：需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5，这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点。3.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。(1)切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。(2)切除cDNA的发夹结构。核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA3.4.2 末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶1.作用特点：作用特点：此酶是从小牛胸腺中提取的，可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是带3-OH末端的ssDNA（Mg2+为辅因子）。平末端的dsDNA只有CO2+存在时才能作引物。2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）。3.4.2末端脱氧核苷酸转移酶基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件3.4.3 外核酸酶外核酸酶III1.作用特点：作用特点：此酶是从E.coli中分离得到的，是一种从dsDNA的3-OH末端降解产生5单核苷酸的外切酶。2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：(1)产生具有5延伸末端的DNA片段(2)制备特异的DNA探针3.4.3外核酸酶III基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件3.4.4 外核酸酶外核酸酶Bal 311.作用特点：作用特点：此 酶 是 从 乳 白 短 杆 菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。能以渐进的方式从线型DNA分子的3，5两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段。底物可以是带延伸末端或是平末端的dsDNA，对3、5两端的降解速度相同。2.作用条件：作用条件：降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal31失活。3.4.4外核酸酶Bal313.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失。3.在基因工程中的应用：3.4.5 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.作用特点：作用特点：此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的。能催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端上。3.4.5T4多核苷酸激酶2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：可用于缺乏5-磷酸的待连接DNA片段的5端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5-磷酸化。2.在基因工程中的应用：3.4.6 碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）1.作用特点：作用特点：从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP，从小牛肠中分离的简称CAP。它能特异性地切去DNA或RNA的5-磷酸。底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脱氧核糖核苷三磷酸。2.在基因工程中的应用：在基因工程中的应用：(1)在用32P标记DNA的5末端之前，除去磷酸。(2)在DNA重组技术中，除去DNA片段的5-磷酸，阻止质粒自身环化，提高转化效率。3.4.6碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）基因工程之基因操作的工具酶培训ppt课件