第三章植物组织器官培养课件

第三章第三章 植物组织器官培养植物组织器官培养 第三章 植物组织器官培养1 1第四节 植物胚乳培养一、胚乳培养（一、胚乳培养（Endosperm culture）是指将胚乳组织从母体上分离出是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。植株的技术。第四节 植物胚乳培养一、胚乳培养（Endosperm cul2 2 胚乳在被子植物中是胚乳在被子植物中是双受精的产物，由极核双受精的产物，由极核和雄配子结合成的三倍和雄配子结合成的三倍体组织。体组织。而裸子植物胚乳在受而裸子植物胚乳在受精前形成，为单倍体。精前形成，为单倍体。仅仅4040多种植物进行胚多种植物进行胚乳培养研究，乳培养研究，2020种获得种获得再生植株，如猕猴桃等。再生植株，如猕猴桃等。多存在混倍现象。多存在混倍现象。胚乳在被子植物中是双受精的产物，由极核和雄配子结合成的三3 3二、胚乳培养的意义二、胚乳培养的意义 n n获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植株具有营养体大，无籽等特点。如无籽西瓜。株具有营养体大，无籽等特点。如无籽西瓜。株具有营养体大，无籽等特点。如无籽西瓜。株具有营养体大，无籽等特点。如无籽西瓜。n n胚乳培养也会产生较多的混倍体，可为育种胚乳培养也会产生较多的混倍体，可为育种胚乳培养也会产生较多的混倍体，可为育种胚乳培养也会产生较多的混倍体，可为育种提供丰富的不同倍性的材料，具有重要意义。提供丰富的不同倍性的材料，具有重要意义。提供丰富的不同倍性的材料，具有重要意义。提供丰富的不同倍性的材料，具有重要意义。二、胚乳培养的意义 获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植株4 4三、胚乳培养的方法三、胚乳培养的方法1.取材与接种取材与接种 取合适发育时期的幼果（细取合适发育时期的幼果（细胞型期）胞型期）常规消毒常规消毒在无菌条件下切在无菌条件下切开果实开果实 取出种子取出种子 分离出胚乳分离出胚乳 接接种种 2.常用基本培养基常用基本培养基:MS、White，B5，MT 激素组合根据培养材料而定激素组合根据培养材料而定三、胚乳培养的方法1.取材与接种 取合适发育时期的幼果（5 5一、概念一、概念 指将未授粉的胚珠或子房从母体上指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。受精的技术。第五节第五节 植物离体授粉植物离体授粉一、概念 第五节 植物离体授粉6 61、雌蕊离体授粉、雌蕊离体授粉2、离体子房授粉、离体子房授粉3、胚珠离体授粉、胚珠离体授粉二、离体授粉类型二、离体授粉类型 1、雌蕊离体授粉二、离体授粉类型 7 7 离体授粉离体授粉3种方式示意图种方式示意图(引自引自Razdan，1993)离体授粉3种方式示意图(引自Razdan，1993)8 8三、离体授粉的意义三、离体授粉的意义 可以克服远缘杂交中的不亲和性，可以克服远缘杂交中的不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除受精不育障碍或杂种胚不能发育能消除受精不育障碍或杂种胚不能发育成熟等问题。成熟等问题。三、离体授粉的意义 9 9n n造成受精障碍的因素包括：造成受精障碍的因素包括：造成受精障碍的因素包括：造成受精障碍的因素包括：花粉在柱头上花粉在柱头上花粉在柱头上花粉在柱头上不能萌发；不能萌发；不能萌发；不能萌发；花粉管不能进入胚珠，造成这花粉管不能进入胚珠，造成这花粉管不能进入胚珠，造成这花粉管不能进入胚珠，造成这种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于种现象的原因或是由于花柱太长，或是由于花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子花粉管生长速度太慢，还没长到花柱基部子房已经脱落；房已经脱落；房已经脱落；房已经脱落；花粉管在花柱中破裂。以上花粉管在花柱中破裂。以上花粉管在花柱中破裂。以上花粉管在花柱中破裂。以上这些都属于受精前障碍（合子期前障碍）。这些都属于受精前障碍（合子期前障碍）。这些都属于受精前障碍（合子期前障碍）。这些都属于受精前障碍（合子期前障碍）。在另外一些情况下，即使受精能正常进行，在另外一些情况下，即使受精能正常进行，在另外一些情况下，即使受精能正常进行，在另外一些情况下，即使受精能正常进行，但由于胚和胚乳之间的不亲合性或胚乳发育但由于胚和胚乳之间的不亲合性或胚乳发育但由于胚和胚乳之间的不亲合性或胚乳发育但由于胚和胚乳之间的不亲合性或胚乳发育不良，杂种胚不能发育成熟。这是属于受精不良，杂种胚不能发育成熟。这是属于受精不良，杂种胚不能发育成熟。这是属于受精不良，杂种胚不能发育成熟。这是属于受精后障碍。后障碍。后障碍。后障碍。造成受精障碍的因素包括：花粉在柱头上不能萌发；花粉管不能1010四、离体授粉的方法四、离体授粉的方法 1 1、胚珠试管受精、胚珠试管受精、胚珠试管受精、胚珠试管受精 操作方法：操作方法：操作方法：操作方法：取胚珠取胚珠取胚珠取胚珠 人工受精人工受精人工受精人工受精2 2、子房离体授粉、子房离体授粉、子房离体授粉、子房离体授粉操作方法：操作方法：操作方法：操作方法：直接引入法直接引入法直接引入法直接引入法 注射法注射法注射法注射法3 3、雌蕊离体授粉、雌蕊离体授粉、雌蕊离体授粉、雌蕊离体授粉四、离体授粉的方法 1111五五、离体授粉的程序、离体授粉的程序 1、确定开花、花药开裂及授粉时间、确定开花、花药开裂及授粉时间2、去雄后将花蕾套袋隔离、去雄后将花蕾套袋隔离3、制备无菌子房或胚珠、制备无菌子房或胚珠4、制备无菌花粉、制备无菌花粉5、胚珠或子房的试管内授粉、胚珠或子房的试管内授粉五、离体授粉的程序 1212六、影响离体授粉的因素六、影响离体授粉的因素 1、外植体的发育阶段、外植体的发育阶段2、花粉粒数量及萌发力、花粉粒数量及萌发力3、营养及环境条件、营养及环境条件 4、授粉方式、授粉方式 5、保留母体组织的影响、保留母体组织的影响 6、基因型的影响、基因型的影响 7、培养前预处理的影响、培养前预处理的影响 六、影响离体授粉的因素 1313种子seedn n裸子植物和被子植物特有的繁殖体n n由胚珠经过传粉受精形成上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 第六节第六节 人工种子人工种子种子seed裸子植物和被子植物特有的繁殖体上海海洋大学 细胞1414n n种皮保护作用保护作用n n胚乳为发育中的胚提为发育中的胚提供营养供营养n n胚发育成新的植物发育成新的植物体体上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 种皮上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 lbhuangshou1515一、人工种子的概念一、人工种子的概念人工种子：又称合成种子或体细胞种子，是指将植物离体培养的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中的类似种子的颗粒。一、人工种子的概念人工种子：又称合成种子或体细胞种子，是指将1616人工种子www.agr.hokudai.ac.jp 不定胚形成人工种子www.brs.nihon-u.ac.jp 人工种子大量生产 kankyo08.en.a.u-tokyo.ac.jp 人工种子结构示意图人工种子www.agr.hokudai.ac.jp 不定胚形1717半夏人工种子上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 半夏人工种子上海海洋大学 细胞工程 黄林彬 lbhuang1818二、人工种子的意义二、人工种子的意义n n（1 1）可对一些自然条件下不结实的或种子很）可对一些自然条件下不结实的或种子很昂贵的植物进行繁殖。昂贵的植物进行繁殖。n n（2 2）固定杂种优势，使）固定杂种优势，使F1F1杂交种可多代利用，杂交种可多代利用，使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从使优良的单株能快速繁殖成无性系品种，从而大大缩短育种年限。而大大缩短育种年限。n n（3 3）节约粮食。）节约粮食。n n（4 4）在人工种子的包裹材料里加入各种生长）在人工种子的包裹材料里加入各种生长调节物质、菌调节物质、菌 肥、农药等，可人为地影响控肥、农药等，可人为地影响控制作物生长发育和抗性。制作物生长发育和抗性。n n (5)(5)可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某可以保存及快速繁殖脱病毒苗，克服某些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等。些植物由于长期营养繁殖所积累的病毒病等。n n (6)(6)与试管苗相比成本低，运输方便与试管苗相比成本低，运输方便(体积体积小小)，可直接播种和机械化操作。，可直接播种和机械化操作。二、人工种子的意义（1）可对一些自然条件下不结实的或种子很昂1919人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子的包埋、人工胚乳的制作、人工种皮的制作、人工种子贮藏等步骤内容。1、高质量和高产量的体细胞胚诱导与同步化控制 体细胞胚的诱导与同步化控制方法：三、人工种子的制作程序三、人工种子的制作程序人工种子制备包括胚状体的诱导与同步化、人工种子的包埋、人工胚2020体细胞胚诱导与同步化控制体细胞胚诱导与同步化控制 体细胞胚诱导与同步化控制 2121a 成熟的体细胞胚；b 用无菌吸管吸取与包埋剂混合的体细胞胚 c 带体细胞胚的液滴滴入2CaCl2溶液后形成的白色半透明的包埋丸；d 人工种皮包埋制成的人工种子 人工种子的制备人工种子的制备a 成熟的体细胞胚；b 用无菌吸管吸取与包埋剂混合的体细胞胚2222苜蓿体细胞胚的生产与植株的获得苜蓿体细胞胚的生产与植株的获得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm 苜蓿体细胞胚的生产与植株的获得www.plant.uogue23232、人工种子包埋 获得发育正常、形态上较为一致的体细胞胚后，就要用适合的材料进行包埋。进行包埋时应做到以下几点：（1）包埋材料必须对体细胞胚无损害和无毒性，并能保护胚和胚发芽的能力；（2）同时在制造、贮藏、运输和种植过程中必须具有耐久性；（3）胶囊必须含有养分和植物激素以及植物生长和发育所需的成分和水分，并要求制作的人工种子适合于农业机械化播种。2、人工种子包埋 24243 包埋方法：经研究认为藻酸盐所形成的胶囊是目前最好的凝胶包埋材料，所采用的主要方法是滴注和装膜两种。（1）滴注法 制备人工种子是将选择好的体细胞胚悬浮于含2%3%的藻酸钠溶液中，然后用一个塑料吸管吸注含体细胞胚的藻酸钠悬滴加入到0.1mol/LCaCl2溶液中，这时离子间发生交换而形成胶囊，胶囊的直径依赖于吸管的内径和吸注的速度，胶囊的大小，视体细胞胚的大小和发芽能力而定，一般采用吸管口径为34mm，可得直径为45mm的胶囊。体细胞胚包在胶囊中的位置不宜处在中央，宜偏在一边以利萌发。至于聚合时间长短则依赖于所用试剂浓度。一般藻酸钠的浓度控制在23%，在CaCl2中停留时间不要超过10min，以免胶囊太硬而影响发芽。形成胶囊后转入无菌水中冲洗，最后在1/2MS培养基上作发芽和转换试验或进一步包裹人工种皮。3 包埋方法：（1）滴注法 2525滴注法滴注法2626人工种子包埋过程示意图人工种子包埋过程示意图2727（2）装膜法 制备人工种子是把体细胞胚混合到一个温度较高的胶液中，然后滴注到一个有小坑的微滴板上，随着温度降低变为凝胶而形成胶丸。（2）装膜法 28284、人工种皮的研制 美国杜邦公司生产的Elvax4260是一种较好的“人工种皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三种物质共聚的产物，用它作为人工种子最外层的包裹剂，即人工种皮取得较好效果。4、人工种皮的研制 29291、人工种子转换定义*转换（Transformation）指人工种子在一定条件下，萌发、生长、形成完整植株的过程。2、转换方法*转换的方法可分为无菌条件下的转换和土壤条件下的转换。5、人工种子的转换试验1、人工种子转换定义 5、人工种子的转换试验3030（1）、无菌条件的转换：其也称离体条件的转换。一般是将新制成的人工种子播种在1/4MS培养基，附加1.5%麦芽糖、8g/L的琼脂中，培养后统计人工种子形成完整植株的数目，即人工种子的转化率。（2）、无菌条件转换率的高低主要取决于：（a）、对提高体细胞胚质量的培养基成分的研究；（b）、改进转换条件的研究。如麦芽糖代替蔗糖，有利于体细胞胚的萌发和转换。（1）、无菌条件的转换：其也称离体条件的转换。一般是将新制成3131（3）、土壤条件的转换：也称活体条件下的转换。人工种子真正目的是直接播种于土壤，即在活体条件下，使转换成功。（4）土壤条件下转换采用方法：a、无土培养试验：目前以蛭石或珍珠岩试验较多，附加低浓度无机盐，1/6的MS培养基，0.75%麦芽糖有利于转换。b、土壤试验：人工种子的土壤转化试验报道较少。苜蓿人工种子的直接土壤转化试验已达20%，水稻不定芽研制的人工种子经适当地过渡性培养，在土壤中的转化率为10%。（5）、土壤条件的转换人工种子转化率低的主要限制因子 a、研究无机盐在转换中的重要性时表明，没有硝酸钾、硫酸镁、氯化钙时就不会发生转换，缺乏磷酸铵，转化率从30%降至5%。显然这些无机盐成分作为人工种子营养肥料是不可缺少的。b、0.75（W/V）的麦芽糖有利于提高转化率。因此推测，碳源在人工种子转换中也是限制因子。因此，必须在人工种子中贮藏必需的养分或供给外源营养物质。（3）、土壤条件的转换：也称活体条件下的转换。人工种子真正目32321、人工种子的应用目前存在的问题（1）许多有价值的基因作物，特别是那些不易获得种子和自然增殖率极低的植物，目前尚未显示出较好的体细胞胚发生能力，或胚的生活力差；（2）有些作物虽然可以诱导出体细胞胚，但胚胎发生机制研究不够，而且同步化等技术尚未解决，因而难以达到大量控制同步化的目的；（3）人工种子的成本远高于自然种子；（4）人工种子贮藏、运输和加工以及机械化播种，尚未完全解决，许多问题尚待进一步研究和探索。四、四、人工种子应用前景人工种子应用前景1、人工种子的应用目前存在的问题 四、人工种子应用前景33332、人工种子应用应该考虑哪些方面 要想人工种子技术得到应用：（1）首先应考虑该作物的价值；（2）要考虑那些很难获得种子，而且自然增殖率极低的植物。例如：多年生名贵药材，高质量的木材和橡胶树或优质果树以及珍惜濒危植物等。3、人工种子发展前景 （1）人工种子的发展前景是客观的 （2）它将是农业中一种革命性的繁殖系统 （3）相信该技术会得到逐步完善，建立多种模式来研制人工种子，并逐步扩大应用范围。2、人工种子应用应该考虑哪些方面 3434第三章植物组织器官培养课件3535第三章植物组织器官培养课件3636第三章植物组织器官培养课件3737第三章植物组织器官培养课件3838第三章植物组织器官培养课件3939第三章植物组织器官培养课件4040第三章植物组织器官培养课件4141