菌种的保藏与复壮课件

第二章第二章 微生物菌种的选育微生物菌种的选育第一节、微生物工业用菌种第二节、菌种的来源第三节、高产菌种的选育第四节、菌种退化和保藏第五节、菌种的扩大培养第二章微生物菌种的选育第一节、微生物工业用菌种第一节、微生物工业用菌种一、微生物工业对菌种的要求一、微生物工业对菌种的要求 微生物资源丰富，广布于土壤、水微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，其中土壤中最多。和空气等自然界中，其中土壤中最多。发展趋势：发展趋势：从野生型从野生型 突变型突变型 自然选育自然选育 代谢代谢控制育种控制育种 诱变育种诱变育种 基基因工程定向育种因工程定向育种第一节、微生物工业用菌种微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：（1 1）所需培养基易得，价格低廉；）所需培养基易得，价格低廉；（2 2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pHpH、溶解氧、渗透压等）溶解氧、渗透压等）（3 3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4 4）单产高）单产高 （选择野生型、营养缺陷型或调节（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）突变株）微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：（1）所需培养基易得，（5 5）抗病毒能力强）抗病毒能力强（6 6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7 7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全毒素），保证安全（5）抗病毒能力强二、工业上常用的微生物微生物在工业上的用途很广，包括化工、医微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。石油化工等方面。微生物的代谢产物多，已超过微生物的代谢产物多，已超过13001300多种，而多种，而用于大规模工业生产的不足用于大规模工业生产的不足100100多种；微生物多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过酶有近千种，而工业上用的不过40405050种。种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。微生物具有巨大的潜力可挖掘。工业上常用菌种举例：工业上常用菌种举例：二、工业上常用的微生物微生物在工业上的用途很广，包括化工、医1、常用的细菌 大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。1、常用的细菌 乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作乳酸杆菌枯草芽孢杆菌应用：生产淀粉酶枯草芽孢杆菌2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、红酵母、面包酵母。面包酵母。应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪。蛋白质、生产脂肪。2、酵母菌种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母红酵母、面包菌种的保藏与复壮课件啤酒酵母啤酒酵母红酵母红酵母面包酵母啤酒酵母红酵母面包酵母3、霉菌曲霉属应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶3、霉菌曲霉属应用：酱油、酱类（淀粉酶）应用：酱油、酱类（淀粉酶）应用：生产甲义丁二应用：生产甲义丁二酸酸米曲霉米曲霉应用：产糖化酶和蛋白应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲和酱油制曲应用：生产甲义丁二酸米曲霉 毛毛 霉霉应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作乳、豆豉等的制作根霉根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒应用：酿酒根霉青霉菌青霉菌青霉菌4、放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素4、放线菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素其他生物：其他生物：A:担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如生物。担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的重视，如多糖、抗癌药物的开发。多糖、抗癌药物的开发。近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中的作用进行了深入的研究，发现香菇中的“1，2-葡萄葡萄糖苷酶糖苷酶”及两种糖类物质具有抗癌作用。及两种糖类物质具有抗癌作用。其他生物：菌种的保藏与复壮课件 B：病毒：病毒(virus)其特点如下：其特点如下：1.形体微小，体积比细菌小的多。形体微小，体积比细菌小的多。2.没有细胞结构，主要由核酸和蛋白质构成。没有细胞结构，主要由核酸和蛋白质构成。3.营寄生生活不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专营寄生生活不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。一性。人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome AIDS）人类免疫缺陷病毒（humanimmunodefici噬菌体（噬菌体（phage）是病毒的）是病毒的一种。一种。噬菌体在寄主细胞中的生噬菌体在寄主细胞中的生长繁殖过程可分为吸附、浸入、长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。增殖、成熟和释放。菌种的保藏与复壮课件 C：藻类（：藻类（alga）：培养培养螺旋藻螺旋藻，每公顷可收获，每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才吨，而种植大豆每公顷才可获可获4吨；吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。倍。还可通过藻类还可通过藻类将将CO转变为石油转变为石油，培养单胞藻或其他藻，培养单胞藻或其他藻类而获得的石油，可占细胞干重得类而获得的石油，可占细胞干重得5%-50%，合成的油与重，合成的油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。还可减轻因工业油相同，加工后可转变汽油、煤油等产品。还可减轻因工业生产而大量排放生产而大量排放CO造成的温室效应。造成的温室效应。国外还有人从国外还有人从“藻类农场藻类农场”获取氢能获取氢能的报道，大量培养的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。C：藻类（alga）：藻藻 类类 工工 厂厂藻类工厂第二节第二节 菌种的来源菌种的来源一、菌种的来源一、菌种的来源根根据据资资料料直直接接向向有有科科研研单单位位、高高等等院院校校、工工厂厂或菌种保藏部门索取或购买；或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。第二节菌种的来源一、菌种的来源第二节第二节 菌种的来源菌种的来源二、微生物选择性分离方法二、微生物选择性分离方法微生物样品的采集微生物样品的富集培养目的菌种的分离目的菌的筛选第二节菌种的来源二、微生物选择性分离方法1 1、微生物样品的采集、微生物样品的采集微生物主要来自土壤。寻找已经适应苛刻环境压力的微生物类群例如：从盐场分离嗜盐链霉菌，从污泥中分离甲烷菌，从酒糟中分离酵母菌等。1、微生物样品的采集2 2、微生物样品富集培养、微生物样品富集培养含有目的菌较多的土样不需要富集培养如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离。富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得。2、微生物样品富集培养含有目的菌较多的土样不需要富集培养某些细菌的富集条件某些细菌的富集条件 富集对象 接种菌样添加营养物(g)特殊培养条件好氧氨基酸氧化菌土壤好氧，pH7.0好氧性芽孢杆菌土壤，巴氏消毒 好氧，pH7.0氨基酸发酵性梭菌土壤，巴氏消毒 厌氧，pH7.0耐碱解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6 厌氧八叠球菌土壤 葡萄糖20厌氧，pH23 乳酸菌植物体或牛奶 葡萄糖20厌氧，pH6.5 肠道细菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厌氧，pH7.0 丙酸菌干酪 乳酸钠20厌氧，pH7.0 醋酸菌果实或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO4 1.0g，MgSO47H2O 0.2g，加水1000ml。一般培养在30下。某些细菌的富集条件富集对象接种菌样 添加营养物(3、目的菌种的分离分离效率取决于分离效率取决于培养基的养分、培养基的养分、pHpH、加入、加入的选择性抑制剂。的选择性抑制剂。表表2-32-3列举了分离放线菌的各种培养基配方。列举了分离放线菌的各种培养基配方。广泛应用的三种培养基即广泛应用的三种培养基即几丁质琼脂、淀几丁质琼脂、淀粉粉-酪素培养基和酪素培养基和M M3 3培养基培养基。3、目的菌种的分离因大多数因大多数放线菌放线菌都是嗜中性的，分离培养基都是嗜中性的，分离培养基的的pHpH常在常在6.7-7.56.7-7.5之间之间。如要分离嗜酸放线菌，。如要分离嗜酸放线菌，pHpH宜降低到宜降低到4.5-5.04.5-5.0。在分离培养基中广泛采用在分离培养基中广泛采用加入抗生素加入抗生素的方法，的方法，来增加来增加放线菌放线菌的筛选。的筛选。注意：要使用抗真菌抗生素，不要使用抗细菌注意：要使用抗真菌抗生素，不要使用抗细菌抗生素。抗生素。因大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH常在6.7-7.4、目的菌的、目的菌的筛选筛选涂布法涂布法：于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法用来测定各：于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法用来测定各个菌落的抗生素生产能力。个菌落的抗生素生产能力。复印平板法复印平板法：即用丝绒等把琼脂平板上的菌落转移到别的琼脂平：即用丝绒等把琼脂平板上的菌落转移到别的琼脂平板上的方法。例如在检测营养缺陷性时，首先在完全培养基琼脂板上的方法。例如在检测营养缺陷性时，首先在完全培养基琼脂平板上制备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到丝绒上，平板上制备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到丝绒上，丝绒绷在一个圆柱的光滑顶面上（圆柱的直径应比培养皿稍小），丝绒绷在一个圆柱的光滑顶面上（圆柱的直径应比培养皿稍小），再把它当作印章，复印在不含营养物的合成培养基琼脂平板上。再把它当作印章，复印在不含营养物的合成培养基琼脂平板上。因为需要某特定营养物的菌落在合成培养基琼脂平板上不能生长，因为需要某特定营养物的菌落在合成培养基琼脂平板上不能生长，所以和原来平板上的菌落相比较，就可以很容易地检测出营养缺所以和原来平板上的菌落相比较，就可以很容易地检测出营养缺陷型菌株。这种方法被广泛应用于分离突变菌株，常和诱变剂处陷型菌株。这种方法被广泛应用于分离突变菌株，常和诱变剂处理及青霉素处理法相结合使用。理及青霉素处理法相结合使用。4、目的菌的筛选这两种方法都有缺点。涂布法会使所需要这两种方法都有缺点。涂布法会使所需要的菌落污染，并且只能在每个平板上铺上的菌落污染，并且只能在每个平板上铺上一种试验菌。菌落复印平板法适合长孢子一种试验菌。菌落复印平板法适合长孢子的菌种，对不长孢子的链霉菌则不能使用，的菌种，对不长孢子的链霉菌则不能使用，也不适用于游动细菌的筛选。也不适用于游动细菌的筛选。这两种方法都有缺点。涂布法会使所需要的菌落污染，并且只能在每三、重要工业微生物的分离方法三、重要工业微生物的分离方法 施加选择压力的分离方法：施加选择压力的分离方法：1、富集液体培养、富集液体培养：指能增加混合菌群中所：指能增加混合菌群中所需菌株的数量的一种技术。需菌株的数量的一种技术。要领：要领：给混合菌群提供一些有利于所需菌株给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌群生长的条件。生长或不利于其他菌群生长的条件。e.g.供给特殊的基质或加入某些抑制剂。供给特殊的基质或加入某些抑制剂。三、重要工业微生物的分离方法注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其他微生物生长。其他微生物生长。解决办法：把富集培养物接种到新鲜的同一解决办法：把富集培养物接种到新鲜的同一种培养基中可以重新建立选择压力，重复移种培养基中可以重新建立选择压力，重复移植几次后，将富集培养物再接到固体培养基植几次后，将富集培养物再接到固体培养基上。上。注意：所需类型的菌株生长的结果，有时会改变培养基的性质，从而、固体培养基培养、固体培养基培养：常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。e.g.碱性蛋白酶的分离碱性蛋白酶的分离用不同用不同pH的土壤作为原始种子。土壤必须经过巴的土壤作为原始种子。土壤必须经过巴氏灭菌消毒，以减少不产孢子的微生物，然后铺在氏灭菌消毒，以减少不产孢子的微生物，然后铺在pH为为910的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面。面。碱性蛋白酶的产生菌能消化平板的不溶性蛋白，碱性蛋白酶的产生菌能消化平板的不溶性蛋白，产生一清晰圈。产生一清晰圈。、固体培养基培养：3、随机分离方法随机分离方法：有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处。因此常随机地分离所需菌种，高产培养基成性好处。因此常随机地分离所需菌种，高产培养基成分的选择准则如下：分的选择准则如下：1、制备一系列含有各种类型营养成分（生长限制因、制备一系列含有各种类型营养成分（生长限制因素）培养基；素）培养基；2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代谢物阻遏）；谢物阻遏）；3、加入缓冲液以减少、加入缓冲液以减少pH的变化；的变化；4、确定含有所需的辅助因子、确定含有所需的辅助因子Co2+,Mn2+,Mg2+,Fe2+等等。3、随机分离方法：eg:抗生素生产菌的筛选抗生素生产菌的筛选：把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平把潜在的产生菌生长在含有试验菌的平板上，可以鉴定产生菌的抗微生物作用。板上，可以鉴定产生菌的抗微生物作用。也可以将微生物分离株生长在液体培养也可以将微生物分离株生长在液体培养基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性。基中，检测其无细胞滤液的抗菌活性。eg:抗生素生产菌的筛选：eg:药理活性化合物生产菌的筛选药理活性化合物生产菌的筛选：一种化合物如果能在体外抑制某种关键一种化合物如果能在体外抑制某种关键的人体酶，它就可能在体内具有药理作用。的人体酶，它就可能在体内具有药理作用。若将体外筛选出的活性化合物，再用动若将体外筛选出的活性化合物，再用动物作试验，可筛选出新的药理活性化合物生物作试验，可筛选出新的药理活性化合物生产菌。产菌。eg:药理活性化合物生产菌的筛选：eg:eg:生长因子产生菌的筛选：生长因子产生菌的筛选：通过观察分离菌能否促进通过观察分离菌能否促进营养缺营养缺陷型陷型（auxotrophauxotroph）的生长，便可检出生长）的生长，便可检出生长因子产生菌。因子产生菌。eg:生长因子产生菌的筛选：eg:eg:多糖生产菌的筛选多糖生产菌的筛选：从制糖工业的废水中可获得分离株，从制糖工业的废水中可获得分离株，在适当的培养基中生长，可从菌落的粘液在适当的培养基中生长，可从菌落的粘液状外观识别这类产生菌。状外观识别这类产生菌。eg:多糖生产菌的筛选：第三节第三节 高产菌种选育高产菌种选育菌种选育菌种选育是一门应用科学技术应用科学技术，其理论基础理论基础是微生物遗传学、生物化学遗传学、生物化学等，而其研究目的目的是微生物产品的高产优质高产优质和发展新品种新品种为生产不断地提供优良提供优良菌种菌种，从而促进生产发展。目前菌种选育常采用自然选育自然选育和和诱变育种诱变育种等方法，带有一定的盲目性盲目性，尚属于经典育种经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法定向的育种方法。第三节高产菌种选育菌种选育是一门应用科学技术，其理论1、自然选育自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自自然然突变突变而进行菌种筛选菌种筛选的过程叫做自然选育自然选育。所谓自自然然突突变变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两两个个原原因因：即多多因因素素低低剂量的诱变效应剂量的诱变效应和和互变异构效应互变异构效应。菌种的自然突变往往有两种可能性:菌种衰退,生产性能下降;代谢更加旺盛,生产性能提高。1、自然选育2、诱变育种、诱变育种诱变育种的基本原理诱变育种的基本原理诱变育种的理理论论基基础础是是基基因因突突变变，所谓突突变变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变染色体畸变和和基因突变基因突变二大类。（1）染色体畸变染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易缺失、易位、逆位、重复位、逆位、重复等。（2）基因突变基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变点突变）。2、诱变育种根据突变发生的原因又可分为自然突变自然突变和和诱发突变诱发突变。诱诱发发突突变变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱诱变变因因素素的种类很多，有物物理理的的、化化学学的的和和生生物物的的三三大大类类。经诱变处理后，微生物的遗传物质、DNA和RNA的化化学学结结构构发生改变，从而引起微生物的遗传变异遗传变异。菌种的保藏与复壮课件诱变育种的一般步骤诱变育种的一般步骤 （1）出发菌株的选择自然界直接分离到的野生型菌株经历过生产条件考验的菌株已经历多次育种处理的菌株诱变育种的一般步骤（1）出发菌株的选择2 2、制备菌悬液、制备菌悬液待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件；均一性和环境条件；尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象，避免尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象，避免表型延迟表型延迟。表型延迟表型延迟就是指某一突变在就是指某一突变在DNADNA复制和细胞分裂后，复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。3 3、诱变处理、诱变处理根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处理剂量。理剂量。一般突变率随诱变剂量的增大而增高，但达到一定一般突变率随诱变剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，突变率会下降。剂量后，突变率会下降。2、制备菌悬液4 4、突变菌株的筛选、突变菌株的筛选（1 1）营养缺陷型突变株的筛选）营养缺陷型突变株的筛选 生物合成途径的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，生物合成途径的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。（2 2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选 调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此不再起反馈阻遏作用；不再起反馈阻遏作用；编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。4、突变菌株的筛选（3 3）组成型突变株的筛选）组成型突变株的筛选分批限量加入诱导物法，解除菌株对诱导物的依赖分批限量加入诱导物法，解除菌株对诱导物的依赖交替培养法交替培养法（4 4）抗性突变株的筛选）抗性突变株的筛选抗生素抗性突变抗生素抗性突变抗噬菌体菌株的选育抗噬菌体菌株的选育条件抗性突变条件抗性突变敏感突变敏感突变（3）组成型突变株的筛选原种（出发菌株）原种（出发菌株）纯化纯化斜面培养斜面培养完全培养完全培养基同步培养基同步培养离心洗涤离心洗涤玻璃珠震荡分散玻璃珠震荡分散过滤过滤单细胞或孢子悬浮液单细胞或孢子悬浮液 活菌计数活菌计数诱变处理诱变处理 诱变处理预备实验诱变处理预备实验 处理液活菌计数处理液活菌计数平板分离平板分离 形态变异并计算其变异率形态变异并计算其变异率斜面培养斜面培养 初筛、复筛初筛、复筛 自然分离和再复筛自然分离和再复筛 保藏及扩大试验保藏及扩大试验诱变育种原种（出发菌株）纯化斜面培养完全培养基同步培养离心洗 出发菌株的选择出发菌株的选择 诱变剂的选择诱变剂的选择 诱变操作及培养诱变操作及培养 突变株的筛选突变株的筛选 突变高产基因的表现突变高产基因的表现 形态突变形态突变 高产突变高产突变 耐药性突变耐药性突变 营养缺陷型突变营养缺陷型突变 结构类似物抗性突变结构类似物抗性突变出发菌株的选择形态突变型形态突变型：指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变型。型。生化突变型生化突变型：没有形态效应的突变型，如营养缺陷型。没有形态效应的突变型，如营养缺陷型。致死突变型致死突变型：生活力下降的突变型。生活力下降的突变型。条件致死突变型条件致死突变型：在某些条件下能成活，在另一些条件下在某些条件下能成活，在另一些条件下是致死的突变型。是致死的突变型。营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株：由于代谢障碍而成为必须添加某种物由于代谢障碍而成为必须添加某种物质才能生长的突变株。质才能生长的突变株。温度敏感性突变株温度敏感性突变株：可在某一温度下生长而在另一温度下可在某一温度下生长而在另一温度下不能生长的突变型。不能生长的突变型。形态突变型：指发生细胞形态变化或菌落形态变化的突变型。出发菌株选择应考虑的问题出发菌株选择应考虑的问题出发菌株的稳定性出发菌株的稳定性选用具备优良特性的菌株选用具备优良特性的菌株挑选对诱变剂敏感的菌株挑选对诱变剂敏感的菌株注意菌株的生理状态及生长发育时间注意菌株的生理状态及生长发育时间 出发菌株出发菌株 野生菌株野生菌株 自发突变后获得的高产菌株自发突变后获得的高产菌株 已经诱变过的菌株已经诱变过的菌株出发菌株选择应考虑的问题出发菌株的稳定性出发菌株考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNADNA的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因子易的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因子易出现出现“饱和饱和”或恢复突变现象，因此或恢复突变现象，因此诱变时常诱变时常采用多种不同的诱变因子或复合诱变因子。采用多种不同的诱变因子或复合诱变因子。诱诱 变变 剂剂 的的 选选 择择菌悬液的制备菌悬液的制备 单细胞悬浮液：单细胞悬浮液：10106 6个个/mL/mL 孢子悬浮液：孢子悬浮液：10108 8个个/mL/mL诱变：预实验确定适宜的诱变条件诱变：预实验确定适宜的诱变条件筛选：选择合适的筛选方法筛选：选择合适的筛选方法考虑试验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变3、杂交育种杂交育种发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱诱变变育育种种方方法法。但是，一个菌种长长期期使使用用诱诱变变剂剂处处理理之之后后，其生生活活能能力力一般要逐渐下降，例如生生长长周周期期延延长长，孢孢子子量量减减少少，代代谢谢减减慢慢，产产量量增增加加缓缓慢慢，诱诱变变因因素素对对产产量量基基因因影影响响的有效性降低的有效性降低等。因此，有必要利用杂交育种方法杂交育种方法。杂杂交交育育种种是指将两个基基因因型不同的菌株经吻吻合合（或或接接合合）使遗遗传传物物质质重重新新组组合合，从中分分离离和和筛筛选选具有新性状的菌株。3、杂交育种杂交育种的目的杂交育种的目的在于：1）通通过过杂杂交交使使不不同同菌菌株株的的遗遗传传物物质质进进行行交交换换和和重重新新组组合合，从从而而改改变变原原有有菌菌株株的的遗遗传传物物质质基基础础，获获得得杂杂种菌株（重组体）；种菌株（重组体）；2）可可以以通通过过杂杂交交把把不不同同菌菌株株的的优优良良生生产产性性能能集集中中于于重重组组体体中中，克克服服长长期期用用诱诱变变剂剂处处理理造造成成的的菌菌株株生生活活力下降等缺陷；力下降等缺陷；3）通过杂交，可以）通过杂交，可以扩大变异范围扩大变异范围，改变产品的质，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；量和产量，甚至出现新的品种；4）分析杂交结果，可以总结）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传遗传物质的转移和传递规律递规律，促进遗传学理论的发展。，促进遗传学理论的发展。杂交育种的目的在于：微生物杂杂交交育育种种所使用的配配对对菌菌株株称为直直接接亲亲本本。由于多多数数微微生生物物尚尚未未发发现现其其有有性性世世代代，因此，直接亲本菌株应带有适当的遗遗传传标标记记。常用的遗传标记有颜颜色、营养要求和抗药性色、营养要求和抗药性等。营营养养标标记记菌菌株株（即营营养养缺缺陷陷型型菌菌株株）是最常用的遗传标记之一。所谓营营养养缺缺陷陷型型菌菌株株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生生化化突突变变体体。由于基基因因突突变变，它失去了合合成成某某种种物物质质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的的能能力力，在基基本本培培养养基基上上不不能能生生长长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质一定种类的有机物质后才能生长才能生长。遗传标记遗传标记微生物杂交育种所使用的配对菌株称为直接亲本。由于4 4、原生质体融合、原生质体融合步骤：步骤：选择亲株：选择亲株：对两亲株要进行标记，以提高筛选率。对两亲株要进行标记，以提高筛选率。原生质体的制备原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完整的原生质体。制得完整的原生质体。原生质体的融合与再生原生质体的融合与再生：两原生质体在促融因子的：两原生质体在促融因子的存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。存在下，发生融合，重建细胞壁，形成新的细胞。筛选优良性状融合重组子筛选优良性状融合重组子：在选择培养基上，通过：在选择培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而选择融合。两个亲本的遗传标记互补而选择融合。4、原生质体融合菌种的保藏与复壮课件2 2、特点及应用：、特点及应用：原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交法原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交法，霉菌与，霉菌与放线菌已达放线菌已达1010-1-11010-2-2，细菌与酵母已达，细菌与酵母已达1010-5-51010-6-6。原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，因此原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，因此有利有利于不同种属间微生物的杂交。于不同种属间微生物的杂交。已报道的丝状真菌已报道的丝状真菌种间种间的原生质体融合主要是曲霉属和的原生质体融合主要是曲霉属和青霉属；青霉属；属间属间原生质体融合主要在酵母中实现：热带假原生质体融合主要在酵母中实现：热带假丝酸母丝酸母饰针复膜孢酵母，酿酒酵母饰针复膜孢酵母，酿酒酵母彭贝裂殖酵母等。彭贝裂殖酵母等。2、特点及应用：重组体重组体种类种类较多；较多；遗传物质的遗传物质的传递更完整；传递更完整；采用温度、药物或紫外线照射灯处理钝化一方的采用温度、药物或紫外线照射灯处理钝化一方的亲株原生质体，再融合，可以亲株原生质体，再融合，可以提高筛选频率提高筛选频率；可以把可以把原生质体融合与其他育种方法结合原生质体融合与其他育种方法结合起来，起来，提高筛选效率。提高筛选效率。重组体种类较多；3、影响原生质体制备的因素菌体的前处理：提高细胞壁对酶的敏感性；菌体的前处理：提高细胞壁对酶的敏感性；菌体生理状态：对数生长期；菌体生理状态：对数生长期；酶的浓度：如制备酵母原生质时，加蜗牛酶的浓度：如制备酵母原生质时，加蜗牛酶酶1-2%1-2%；酶解温度：酶解温度：20-4020-40；酶解时间酶解时间渗透压：高渗条件：糖、氯化钠等；渗透压：高渗条件：糖、氯化钠等；培养基成分、培养方式、培养基成分、培养方式、pHpH等等3、影响原生质体制备的因素菌体的前处理：提高细胞壁对酶的敏感4 4、DNADNA重组技术重组技术1.1.目标目标DNADNA片断的获得片断的获得2.2.载体载体3.3.与载体与载体DNADNA分子的连接分子的连接4.4.重组重组DNADNA分子引入宿主细胞分子引入宿主细胞5.5.从中选出所需重组从中选出所需重组DNADNA分子的宿主细胞分子的宿主细胞6.6.鉴定外源基因的表达产物鉴定外源基因的表达产物4、DNA重组技术基因重组基因重组质粒的特点质粒的特点1 1、质粒的存在并非微生物生命活动必需。质粒的存在并非微生物生命活动必需。2 2、每每个个细细胞胞中中存存在在的的质质粒粒数数称称为为该该质质粒粒的的拷拷贝贝数数。不不同同类类型型的的质质粒粒其其拷拷贝贝数数各各异异，同同一一质质粒粒在在不不同同条条件件下下，拷贝数也可能差异很大，有严紧型和松弛型两种。拷贝数也可能差异很大，有严紧型和松弛型两种。3 3、质质粒粒DNADNA分分子子常常呈呈现现三三种种形形态态；常常见见的的一一种种是是共共价价、闭闭环环状状DNADNA；其其次次是是由由于于一一条条链链有有缺缺口口而而产产生生的的开开环环DNADNA；第第三三种种是是由由双双环环分分子子两两段段均均断断裂裂而而产产生生的的线线性性DNADNA。质粒的特点1、质粒的存在并非微生物生命活动必需。作为载体的质粒的要求：在宿主细胞能自主复制在宿主细胞能自主复制有明显方便的筛选标记有明显方便的筛选标记存在限制性内切酶位点存在限制性内切酶位点带有多克隆位点，便于插入失活的功能筛带有多克隆位点，便于插入失活的功能筛选重组子选重组子在宿主中以多拷贝存在在宿主中以多拷贝存在带有启动子，便于外源基因表达带有启动子，便于外源基因表达能在宿主中稳定的遗传能在宿主中稳定的遗传作为载体的质粒的要求：在宿主细胞能自主复制质粒质粒DNADNA的提取方法的提取方法细菌培养和质粒扩增；细菌培养和质粒扩增；细菌的收获和裂解；细菌的收获和裂解；质粒质粒DNADNA的提取。的提取。质粒DNA的提取方法细菌培养和质粒扩增；操作步骤：操作步骤：质粒质粒DNADNA转化感受态大肠杆菌转化感受态大肠杆菌1 1从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入10ml10ml肉汤培养基中，肉汤培养基中，3737培养过夜。培养过夜。2 2取取0.5ml0.5ml培养物接入培养物接入50ml50ml肉汤中，无菌添加肉汤中，无菌添加0.4ml 0.4ml 2.5mol2.5molL MgClL MgCl2 2，于，于3737振荡培养。振荡培养。3 3将将o.1molo.1molL CaClL CaCl2 2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。4 4当培养物当培养物OD600OD600在在0.50.50.80.8左右时，开始收获细胞左右时，开始收获细胞(大大约需约需2 22.5h)2.5h)操作步骤：5 5将培养物置冰浴中冷却将培养物置冰浴中冷却10min10min。6 6取取10ml10ml培养物置培养物置2 2个冷离心管中弃去上清液。个冷离心管中弃去上清液。7 7加入加入1ml 0.1mol1ml 0.1molL CaClL CaCl2 2，再加，再加0.9ml CaCl0.9ml CaCl2 2，置冰浴中放置，置冰浴中放置20min20min。8 83000r3000rminmin离心离心10min10min，弃去上清液。，弃去上清液。9 9加入加入1ml 0.1mol1ml 0.1molL CaClL CaCl2 2，重新悬浮细胞，置，重新悬浮细胞，置冰浴中保存。冰浴中保存。1010加入加入1 120l20l待转化质粒待转化质粒 DNA DNA溶液。溶液。5将培养物置冰浴中冷却10min。1111在冰上放置在冰上放置20min20min，在，在3737处理处理2min2min。再插入。再插入冰中加入冰中加入0.9m10.9m1肉汤肉汤3737静置培养静置培养90min90min。1212以不同的量涂布选择培养基平板。以不同的量涂布选择培养基平板。1313于于3737培养过夜。鉴定转化菌落。培养过夜。鉴定转化菌落。11在冰上放置20min，在37处理2min。再插入冰中重组重组DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶逆转录酶等逆转录酶等重组DNA中常用的工具酶限制性核酸内切酶限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式限制性内切酶的剪切方式宿主细胞必须符合以下条件宿主细胞必须符合以下条件对载体的复制和扩增没有严格的限制；对载体的复制和扩增没有严格的限制；不存在特异的内切酶体系降解外源不存在特异的内切酶体系降解外源DNADNA；在重组在重组DNADNA增殖过程中，不会对它进行修饰；增殖过程中，不会对它进行修饰；重组缺陷型，不会产生体内重组；重组缺陷型，不会产生体内重组；容易导入重组容易导入重组DNADNA分子；分子；符合重组符合重组DNADNA操作的安全标准。操作的安全标准。宿主细胞必须符合以下条件对载体的复制和扩增没有严格的限制；目的基因的获取目的基因的获取1 1、通过建立基因文库分离靶基因、通过建立基因文库分离靶基因基因文库包括两类：基因组文库：利用限制基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性内切酶。性内切酶。cDNAcDNA：用：用mRNAmRNA反转录成单链反转录成单链DNADNA，再经，再经DNADNA聚聚合酶的作用产生双链合酶的作用产生双链DNADNA。可去除真核生物基。可去除真核生物基因中不表达的内含子。因中不表达的内含子。目的基因的获取1、通过建立基因文库分离靶基因2 2、化学合成法制备、化学合成法制备DNADNA片段片段从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码再依照密码合成基因合成基因。聚合酶链反应法聚合酶链反应法扩增基因片段扩增基因片段对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（），以基因组合酶链反应（），以基因组DNADNA或或cDNAcDNA模板模板扩增扩增得到目的基因片段。得到目的基因片段。2、化学合成法制备DNA片段重组重组DNADNA导入宿主菌导入宿主菌 体体外外连连接接的的重重组组DNADNA分分子子必必须须导导入入适适当当的的受受体体细细胞胞中中才才能能大大量量的的复复制制、增增殖殖和和表表达达。根根据据所所采采用用的的载载体体的的性性质质，将将重重组组DNADNA分分子子导导入入受受体体可有不同的方法。可有不同的方法。重组DNA导入宿主菌体外连接的重组DNA分子必须导入适当的1 1、转、转 化化指指以以细细菌菌质质粒粒为为载载体体，将将外外源源基基因因导导入入受受体体细细胞胞的的过过程程。转转化化时时，细细菌菌必必须须经经过过适适当当的的处处理理使使之之处处于于感感受受态态即即容容易易接接受受外外源源DNADNA的的状状态态，然然后后利利用短暂热休克使用短暂热休克使DNADNA导入细菌宿主中。导入细菌宿主中。此此外外还还可可用用电电穿穿孔孔法法转转化化细细菌菌，它它的的优优点点是是操操作作简便、转化效率高、适用于任何菌株。简便、转化效率高、适用于任何菌株。1、转化指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。2 2、转染和感染、转染和感染 利利用用噬噬菌菌体体DNADNA作作为为载载体体时时可可经经两两种种方方式导入受体菌。式导入受体菌。一一种种是是感感染染，即即在在体体外外将将噬噬菌菌体体DNADNA包包装装成成病病毒颗粒，然后使其感染受体菌。毒颗粒，然后使其感染受体菌。另另一一种种方方式式是是转转染染，即即在在DNADNA连连接接酶酶作作用用下下使使噬噬菌菌体体DNADNA环环化化，再再象象重重组组质质粒粒一一样样地地转转化化进进受受体体菌菌。但但习习惯惯上上常常把把以以噬噬菌菌体体DNADNA为为载载体体构构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。2、转染和感染利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导3 3、重组克隆的筛选与鉴定、重组克隆的筛选与鉴定 基基因因克克隆隆的的最最后后一一步步是是从从转转化化细细菌菌菌菌落落中中筛筛选选出出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通通过过细细菌菌培培养养以以及及重重组组子子的的扩扩增增，获获得得所所需需的的基基因因片片段段的的大大量量拷拷贝贝。进进一一步步研研究究该该基基因因的的结结构构、功能，或表达该基因的产物。功能，或表达该基因的产物。3、重组克隆的筛选与鉴定基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落第第四节菌种退化和保藏四节菌种退化和保藏工工业业微微生生物物菌菌种种保保藏藏与与其其他他目目的的的的菌菌种种保保藏藏要要求有所不同。求有所不同。工工业业微微生生物物菌菌种种保保藏藏，是是要要使使菌菌种种生生产产能能力力和和与与生生产产工工艺艺相相适适应应的的优优良良性性状状保保持持稳稳定定，当当然然做做不不到到绝绝对对不不变变，只只是是力力求求把把这这种种衰衰退退现现象象推推迟减缓到最低限度。迟减缓到最低限度。第四节菌种退化和保藏工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要菌种保藏原理菌菌种种保保藏藏有有许许多多的的方方法法，其其共共同同的的目目标标是是把把菌菌株株的的优优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保保藏藏的的一一般般程程序序是是选选取取优优良良的的纯纯菌菌种种，最最好好是是用用其其分分生生孢孢子子或或芽芽孢孢等等休休眠眠体体，在在其其休休眠眠和和停停止止生生长长的的条条件件下下保保藏藏。微微生生物物生生长长要要求求适适宜宜的的温温度度、水水分分、空空气气和和营营养养物物质质等等，如如将将菌菌种种处处于于低低温温、干干燥燥、无无氧氧和和缺缺乏乏营养营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。菌种保藏原理菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良 低低温温是是保保藏藏菌菌种种的的重重要要因因素素，也也是是常常用用的的一一种种简简单单易易行行的的方方法法。在在低低温温保保藏藏时时，注注意意尽尽量量不不损损伤伤细细胞胞。在在缓缓慢慢冷冷冻冻时时，胞胞外外基基质质一一般般较较快快结结冰冰而而形形成成冰冰晶晶使使基基质质浓浓度度增增高高，造造成成细细胞胞水水分分外外渗渗而而大大量量脱脱水水，可可能能使使细细胞胞死死亡亡。如如快快速速降降温温，胞胞内内也也很很快快形形成成冰冰晶晶，胞胞内内外外渗渗透透压压基基本本平平衡衡，同同时时胞胞内内冰冰晶晶较较小小，对对细细胞胞及及原原生生质质膜膜的的损损伤伤也也较小，菌株不易死亡，影响也较小。较小，菌株不易死亡，影响也较小。低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行低温保藏法 低温定期移植法 石蜡油低温保藏法 干燥保藏 甘油管保藏法 真空冷冻干燥法 液氮超低温保存 现行的菌种保藏方法有下列诸种:低温保藏法现行的菌种保藏方法有下列诸种:一、低温保藏法 这这是是一一种种常常用用的的简简便便方方法法。一一般般的的斜斜面面孢孢子子、液液态态孢孢子子、斜斜面面种种子子以以及及用用麸麸皮皮、大大米米、小小米米或或碎碎玉玉米米制制成成的的孢孢子子，可可以以放放在在44冰冰箱箱内内保保藏藏，这这种种温温度度条条件件下下不不能能使使菌菌体体进进入入休休眠眠，而而仅仅是是抑抑制制微微生生物物的的生生命命活活动动。因因此此，保保藏藏时间不宜过长，一般不超过时间不宜过长，一般不超过1 12 2个月个月为宜。为宜。本本方方法法虽虽然然简简便便，但但由由于于菌菌株株处处于于较较高高的的水水平平活活性性下下，这这对对保保藏藏株株的的生生产产性性状状是是不不利利的的，因因此此，生生产产菌菌种种一一般般不采用此法保藏。不采用此法保藏。一、低温保藏法这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢子、液态二、低温定期移植法 把把培培养养好好的的斜斜面面菌菌种种放放在在低低温温干干燥燥处处保保存存，定定期期移移植植，一一般般3 36 6个个月月移移植植一一次次(视视菌菌种种特特征征而而定定)。也也可可以以用用穿刺培养穿刺培养，定期移植法保藏细菌，其效果也较好。，定期移植法保藏细菌，其效果也较好。穿穿刺刺培培养养是是将将含含0.60.60.80.8的的琼琼脂脂培培养养基基装装试试管管灭灭菌菌后后直直立立冷冷凝凝后后，用用接接种种针针尖尖挑挑取取少少量量菌菌体体，垂垂直直刺刺入入琼琼脂脂培培养养基基中中心心，放放在在适适当当温温度度下下培培养养，待待菌菌长长好好后后即即可可放放低低温温保保存存，此此法法较较斜斜面面保保存存有有利利，大大肠肠杆杆菌菌可保藏可保藏2 2年以上不发生明显变异年以上不发生明显变异。二、低温定期移植法把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定 斜面定期移植与穿刺移植法有其斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷缺陷:即即容易发生遗传变异；连续传代可使一些生容易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。因产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。此法保藏。斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷:即容易发生遗传变异；连三、石蜡油低温保藏法 本本方方法法的的原原理理是是在在长长好好的的斜斜面面菌菌上上覆覆盖盖灭灭菌菌的的液液体体石石蜡蜡，达达到到菌菌体体与与空空气气隔隔绝绝，使使菌菌处处于于生生长长和和代代谢谢停停止止状状态态，同同时时石石蜡蜡油油还还防防止止水水分分蒸蒸发发，在在低低温温下下达达到到较较长长期期的的保保藏藏菌菌种种的的目目的的。保保藏藏温温度度要要求求在在-4-444下。液体石蜡法下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种适用于不产孢子的菌种。三、石蜡油低温保藏法本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌菌菌种种为为斜斜面面培培养养菌菌种种，斜斜面面不不宜宜过过长长；选选择择纯纯净净优优质质石石蜡蜡油油，置置三三角角烧烧瓶瓶中中经经过过121121高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌1 12h2h，将将其其放放烘烘箱箱中中(160(160左左右右)干干热热处处理理，去去除除灭灭菌菌时时渗渗入入的的水水分分，待待石石蜡蜡油油变变得得清清澈澈透透明明后后冷冷却却即即可可加加入入斜斜面面，斜斜面面上上不不能能出出现现气气泡泡，液液蜡添加量以高出斜面顶部约蜡添加量以高出斜面顶部约1cm1cm左右为宜。左右为宜。菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角四、干燥保藏 干干燥燥法法是是使使菌菌处处于于干干燥燥条条件件下下停停止止生生长长及及处处于于休休眠眠状状态，达到较长期保藏的目的。态，达到较长期保藏的目的。此此法法用用于于细细菌菌芽芽孢孢或或产产分分生生孢孢子子的的菌菌种种，是是现现在在发发酵酵工工业业生生产产中中较较常常用用的的菌菌种种保保藏藏方方法法。通通常常将将菌菌种种的的分分生生孢孢子子、芽芽孢孢，甚甚至至菌菌丝丝体体吸吸附附于于一一些些载载体体表表面面放放至至干干燥燥容容器器里里进进行行常常压压干干燥燥或或真真空空干干燥燥，所所用用载载体体有有沙沙土、滤纸、硅胶及大土、滤纸、硅胶及大(小小)米等。米等。四、干燥保藏干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状1、沙土管法 取取河河(海海)沙沙，过过0.78mm(240.78mm(24目目)筛筛，用用1010盐盐酸酸浸浸泡泡24h24h，倒倒去去盐盐酸酸用用清清水水冲冲洗洗至至pHpH呈呈中中性性，去去水水烘烘干干或或晒晒干干。取取菜菜园园或或果果园园土土粉粉碎碎过过筛筛，把把烘烘干干的的沙沙土土按按3 3：2 2或或1 1：1 1混混合合装装入入指指形形管管或或高高100mm100mm，直直径径为为10mm10mm的的小小试试管管中中，高高约约1cm(1cm(约约2g)2g)，塞塞棉棉塞塞121121灭灭菌菌1h1h，也也可可用用1702h1702h干干热热灭灭菌菌(或或蒸蒸汽汽三三次次间间歇歇灭灭菌菌)，蒸蒸汽汽灭灭菌菌后后需需烘烘干干。经经肉肉汤汤检检查查确确实实证证明明无无菌菌即即可可使使用用。将将要要保保存存的的斜斜面面菌菌种种制制成成浓浓孢孢子子悬悬液液(10(106 6/ml)/ml)，用用灭灭菌菌滴滴管管或或吸吸管管吸吸取取孢孢子子悬悬液液滴滴入入无无菌菌沙沙土土上上，每每管管约约0.30.30.5ml0.5ml，用接种环将其混合均匀。，用接种环将其混合均匀。1、沙土管法取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛也也可可将将真真菌菌分分生生孢孢子子用用接接种种环环从从斜斜面面直直接接挑挑取取放放入入沙沙土土中中。然然后后将将沙沙土土管管抽抽真真空空干干燥燥。这这时时管管内内砂砂土土松松散散，表表明明已已干干燥燥。将将干干燥燥的的砂砂土土管管放放置置在在干干燥燥器器或或密密闭闭容容器器内内、干干燥燥器器下下部部放放置置变变色色硅硅胶胶等等干干燥燥剂剂，于于44下下保保存存。从从斜斜面面取取出出的的孢孢子子放放入入沙沙土土管管中中混混匀匀后后，可可以以不不抽抽真真空空直直接接放放干干燥燥器器内内保保存。存。也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙在在沙沙土土保保藏藏初初期期，菌菌死死亡亡率率高高，以以后后逐逐渐渐减减慢慢，存存 活活 下下 来来 的的 孢孢 子子 在在 以以 后后 保保 存存 期期 间间 稳稳 定定 性性 较较 好好。用用沙沙土土管管保保藏藏的的某某些些抗抗生生素素产产生生菌菌保保藏藏期期可可达达1818年年(土土霉霉素素和和链链霉霉素素产产生生菌菌)到到2222年年(新新霉霉素素产产生生菌菌)，但但对对利利福福霉霉素素、卡卡那那霉霉素素、四四环环素素等等容容易易产产生生变变异异的的菌菌种种，就就不不适适合合作作长长期期的的沙沙土土管管保保存存。在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以菌种的保藏与复壮课件2、滤纸保藏法 本本法法是是将将要要要要保保藏藏的的微微生生物物细细胞胞或或孢孢子子吸吸附附在在灭灭菌菌滤滤纸纸上上，干干燥燥后后冷冷藏藏。其其方方法法是是3#3#滤滤纸纸剪剪成成5mm50mm5mm50mm的的小小条条，放放入入干干燥燥的的培培养养皿皿中中灭灭菌菌。将将培培养养好好的的菌菌种种用用灭灭菌菌脱脱脂脂乳乳或或奶奶粉粉复复原原乳乳制制成成孢孢子子悬悬液液，用用灭灭菌菌镊镊子子将将准准备备好好的的滤滤纸纸条条在在灭灭菌菌操操作作下下浸浸入入菌菌悬悬液液中中，充充分分吸吸附附菌菌细细胞胞，取取出出后后放放入入灭灭菌菌小小试试管管或或安安瓿瓿管管中中，在在真真空空干干燥燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。2、滤纸保藏法本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸附在灭菌3、大(小)米保藏法 是根据我国制曲原