中药质量标准制定的新方法课件

中药质量标准制定的新方法中药质量标准制定的新方法中药的指纹图谱控制技术中药的指纹图谱控制技术中药的指纹图谱控制技术中药的指纹图谱控制技术 一、概述一、概述二、中药指纹图谱的分类及研究思路二、中药指纹图谱的分类及研究思路三、三、高效液相色谱法高效液相色谱法制定中药特征指纹制定中药特征指纹图谱图谱的方法与技术要求的方法与技术要求 四、应用示例四、应用示例 一、概述一、概述（一）（一）.问题问题双黄连注射液事件双黄连注射液事件（二）（二）.中药指纹图谱提出的背景中药指纹图谱提出的背景1.中药材和中药复方制剂能发挥治疗效中药材和中药复方制剂能发挥治疗效 果的物质基础是其果的物质基础是其化学成分化学成分。2.无论是中药材，还是复方制剂，从现无论是中药材，还是复方制剂，从现 代科学观点来看，均是代科学观点来看，均是复杂体系复杂体系。3.对于复杂体系必须采用多种高新科技对于复杂体系必须采用多种高新科技 来来表征其不同的特性表征其不同的特性。（二）（二）.中药指纹图谱提出的背景中药指纹图谱提出的背景4.4.现行的中药质量标准现行的中药质量标准中列入了显微鉴中列入了显微鉴 别、理化鉴别、含量测定等多种方别、理化鉴别、含量测定等多种方 法，尚且法，尚且不足不足。5.5.国际上目前较通用国际上目前较通用指纹图谱法指纹图谱法。（三）中药指纹图谱的定义中药指纹图谱：中药指纹图谱：是指中药经过适当的处是指中药经过适当的处 理后，采用一定的分析手段，得到的能理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该够标示该中药特性中药特性的的共有峰共有峰的的图谱图谱。(一）一）.中药指纹图谱按中药指纹图谱按应用对象应用对象分类分类:1.1.中药材中药材(原料药材原料药材)指纹图谱。指纹图谱。2.2.中药原料药中药原料药(包括饮片、配伍颗粒包括饮片、配伍颗粒)指指 纹图谱。纹图谱。3.3.中药制剂指纹图谱。中药制剂指纹图谱。二二.中药指纹图谱的分类中药指纹图谱的分类(二）中药指纹图谱按测定手段分类中药指纹图谱按测定手段分类 1.1.中药中药化学化学（成分）指纹图谱（成分）指纹图谱 2.2.中药中药生物生物指纹图谱。指纹图谱。二二.中药指纹图谱的分类中药指纹图谱的分类(二）中药指纹图谱按测定手段分类二）中药指纹图谱按测定手段分类 1 1）中药化学（成分）指纹图谱）中药化学（成分）指纹图谱定义定义 中药化学（成分）指纹图谱系中药化学（成分）指纹图谱系指采用指采用光谱、色谱光谱、色谱和和其他分析方法其他分析方法建立的用以建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。表征中药化学成分的特征的指纹图谱。光谱光谱最常用的是红外光谱（最常用的是红外光谱（IR）。色谱色谱最常用的是薄层色谱（最常用的是薄层色谱（TLC）、气相色谱）、气相色谱(GC)、高效液相色谱、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳和毛细管电泳(CE)。其他方法其他方法包括包括波谱波谱和和联用技术联用技术。中药化学指纹图谱首推中药化学指纹图谱首推色谱方法色谱方法和和联用技术。联用技术。(二）中药指纹图谱按测定手段分类中药指纹图谱按测定手段分类 1.1.中药中药化学化学（成分）指纹图谱（成分）指纹图谱 2 2）中药）中药化学化学（成分）指纹图谱制定技术（成分）指纹图谱制定技术3）几种色谱指纹图谱方法的优缺点）几种色谱指纹图谱方法的优缺点 TLC 法简便易行，但提供信息量有限，法简便易行，但提供信息量有限，很难反映几十种、上百种化学成分组成的很难反映几十种、上百种化学成分组成的复杂体系。复杂体系。GC 法法适用于挥发性化学成分适用于挥发性化学成分。HPLC 适用于非挥发性成分，中药中大适用于非挥发性成分，中药中大部分化学成分均可用部分化学成分均可用HPLC法得出良好的指法得出良好的指纹图谱。纹图谱。CE 适用于大部分化学成分，特别是生适用于大部分化学成分，特别是生物大分子物大分子肽和蛋白的分离，但其重现性肽和蛋白的分离，但其重现性有待提高。有待提高。3）几种色谱指纹图谱方法的优缺点）几种色谱指纹图谱方法的优缺点 联用技术是最有效的建立指纹图谱的方法，联用技术是最有效的建立指纹图谱的方法，如如GC/MS，HPLC/MS，HPLC/MS/MS等可大等可大量提供各种信息，符合解决中药复杂体系的要量提供各种信息，符合解决中药复杂体系的要求，但仪器价格昂贵。不易推广使用。求，但仪器价格昂贵。不易推广使用。总之，目前使用最多的中药化学指纹图谱总之，目前使用最多的中药化学指纹图谱是用是用HPLC方法。方法。3）几种色谱指纹图谱方法的优缺点几种色谱指纹图谱方法的优缺点(二）中药指纹图谱按测定手段分类中药指纹图谱按测定手段分类 2.2.中药中药生物生物指纹图谱指纹图谱 中药生物指纹图谱生物指纹图谱包括中药材DNA指纹图谱和研究中的中药基因组学中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱。(二）中药指纹图谱按测定手段分类中药指纹图谱按测定手段分类 2.2.中药中药生物生物指纹图谱指纹图谱 中药基因组学图谱和中药蛋白组学指纹图谱系指用中药制剂作用于某特定细胞或动物后，引起的基因和蛋白的复杂的变化情况，这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。三三.高效液相色谱法高效液相色谱法制定中药特征指纹图谱制定中药特征指纹图谱的方法与技术要求的方法与技术要求（一）用（一）用HPLC法建立特征指纹图谱的法建立特征指纹图谱的方法学考察方法学考察1 1样品处理方法考察样品处理方法考察 1 1）样品提取方法、提取溶剂、纯化方法样品提取方法、提取溶剂、纯化方法等等考察。应选择提取率高、操作简便的提取、考察。应选择提取率高、操作简便的提取、纯化方法。纯化方法。2 2）考察）考察1010份份以上同一批号的样品，要求以上同一批号的样品，要求1010份样品的份样品的指纹图谱指纹图谱完全一致，特征色谱峰面完全一致，特征色谱峰面积的积的RSD%RSD%不得大于不得大于5%5%。2 2特征指纹图谱确定特征指纹图谱确定 1)1)确定特征指纹图谱必须具有充分的确定特征指纹图谱必须具有充分的代代表性表性和和特异性特异性，至少对，至少对1010个产地个产地以上不以上不同等级的样品进行分析，或对同等级的样品进行分析，或对同一产地同一产地不同规格的不同规格的1010批批以上的样品进行考察。以上的样品进行考察。（一）用（一）用HPLC法建立特征指纹图谱的法建立特征指纹图谱的方法学方法学考察考察2 2特征指纹图谱确定特征指纹图谱确定 2)2)对对1010批以上的样品进行考察，从中归纳批以上的样品进行考察，从中归纳出各批合格样品所出各批合格样品所共有的、峰面积相对稳定共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为的色谱峰作为指纹峰指纹峰。所选取色谱峰的组合。所选取色谱峰的组合必须具备必须具备特异性特异性，对于原药材多来源的品种，对于原药材多来源的品种，必须考察种间的特异性。必须考察种间的特异性。（一）用（一）用HPLC法建立特征指纹图谱的法建立特征指纹图谱的方法学方法学考察考察3 3特征指纹图谱的精密度考察特征指纹图谱的精密度考察 将同一份样品，连续进样将同一份样品，连续进样5 5次，所得次，所得特特征指纹图谱征指纹图谱的各色谱峰的的各色谱峰的峰面积峰面积的的RSD%不得大于不得大于 5%，各色谱峰的，各色谱峰的相对相对保留时间保留时间应在平均保留时间应在平均保留时间 1 min内。内。5 5特征指纹图谱的稳定性考察特征指纹图谱的稳定性考察 取同一份样品取同一份样品,分别在分别在0，1，2，4，8，12，24，36，48小时测定，以特征指小时测定，以特征指纹图谱峰面积和相对保留间为指标，考纹图谱峰面积和相对保留间为指标，考察样品的稳定性。察样品的稳定性。6 特征指纹图谱各色谱峰面积比值范围的确定 根据10个以上产地不同的合格样品(或同一产地不同等级的样品)的分析结果，制定特征色谱峰的峰面积比值范围。7.7.原料药与注射剂指纹图谱之间相关性的研究原料药与注射剂指纹图谱之间相关性的研究 为了确保制备工艺的科学性和稳定性，应根为了确保制备工艺的科学性和稳定性，应根原料药和注射剂的指纹图谱，研究二者之间的相原料药和注射剂的指纹图谱，研究二者之间的相关性。可采用关性。可采用加入某种原料药的供试加入某种原料药的供试品或制备某品或制备某一原料药的一原料药的阴性样品阴性样品的方法，研究二者之间的相的方法，研究二者之间的相关性。关性。8确证特征色谱峰的化合物结构 采用色谱方法分离特征性成分，采用UV、IR、NMR、MS等光谱、波谱方法鉴定化合物的结构，提高指纹图谱的可信度。9对药材基源的要求 对于多来源的中药材品种，由于不同品种的药材，其所含的成分和杂质有一定的区别，在目前中药成分尚不十分明确的状况下，建议中药注射剂所用的药材固定一个品种，确保中药注射剂的稳定性安全性。-GAP四、四、研究实例研究实例决明子HPLC指纹图谱的研究1.仪器条件仪器条件 色谱柱色谱柱:SunfireTM C18柱柱(4.6 mm150 mm，5m)；流动相；流动相:乙腈乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱，流速磷酸水溶液，梯度洗脱，流速:0.8 mL/min，检测波长，检测波长:280 nm；柱温：；柱温：30。梯度洗脱条件见表。梯度洗脱条件见表1。1.1.仪器条件仪器条件2.2.供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取决明子药材粉末取决明子药材粉末(20目目)0.5 g，精密，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇称定，置锥形瓶中，加甲醇 50 mL50 mL，称，称重，回流处理重，回流处理 60 min60 min，放冷，称重，用，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45m微微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。3方法学考察3.13.1精密度试验精密度试验 精密吸取决明子供试品溶液精密吸取决明子供试品溶液10L，连续进，连续进样样5次，测定其次，测定其RP-HPLC图谱。以芦荟大图谱。以芦荟大黄素峰黄素峰(25(25号峰号峰)为参照峰，计算各共有峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的相对保留时间的RSD值值2%，相对峰面积相对峰面积的的RSD值值3%3%。表明方法精密度良好。表明方法精密度良好。3.2 3.2 稳定性试验稳定性试验 精密吸取决明子供试品溶液，分别于制精密吸取决明子供试品溶液，分别于制备后备后0、3、6、9、12、15、24 h，进样，进样，测得各共有峰相对保留时间的测得各共有峰相对保留时间的RSD值值2%，相对峰面积的，相对峰面积的RSD值值3%，表，表 明供试品溶液在明供试品溶液在24 h 稳定。稳定。3.33.3重复性试验重复性试验 取同一批决明子药材取同一批决明子药材5份，份，2.22.2项下方项下方法制备供试品溶液，分别进样，测得各法制备供试品溶液，分别进样，测得各共有峰相对保留间的共有峰相对保留间的RSD值值2%，相对，相对峰面积的峰面积的RSD值值3%。表明方法重现性。表明方法重现性良好。良好。3.43.4指纹图谱及各项技术参数指纹图谱及各项技术参数3.4.1 3.4.1 按上述液相色谱条件检测不同产地按上述液相色谱条件检测不同产地1010批决明子药材的指纹图谱批决明子药材的指纹图谱 ，分别将，分别将1010批决明子药材的指纹图谱输入批决明子药材的指纹图谱输入国家药典国家药典委员会委员会开发的开发的中药指纹图谱相似度评中药指纹图谱相似度评价系统研究版价系统研究版(2004A)(2004A)中，进行时间窗中，进行时间窗的设定、谱峰匹配，最后确定的设定、谱峰匹配，最后确定决明子决明子色色谱图谱图中含有中含有2727个共有色谱峰个共有色谱峰，见图，见图1 1、图、图2 2。3.4.2 根据中药指纹图谱相似度评价系统研究版(试行)，选择芦荟大黄素峰(25号峰)作为参照峰。各峰相对保留时间、相对峰结果面积，见表2。4指纹图谱相似度计算 将将1010批决明子样品批决明子样品指纹图谱指纹图谱的数据文的数据文件导入件导入20042004年国家药典委员会开发的年国家药典委员会开发的中药指纹图谱相似度评价系统研究版中药指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)(2004A)，计算各样品指纹图谱与生成，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱的对照图谱R R的相似度，结果见表的相似度，结果见表2 2。10 批决明子药材相似度分析结果批决明子药材相似度分析结果样品样品S1S2S3S4S5相似度相似度0.9170.9600.9450.9340.950样品样品S6S7S8S9S10相似度相似度0.9670.9410.9590.9100.95510批决明子药材相似度分析结果批决明子药材相似度分析结果中药指纹图谱建立的原则 系统性系统性 指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部所含大指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部所含大部分成分，或指标性成分的全部部分成分，或指标性成分的全部 特征性特征性 指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的优劣，成为中药自身的“化学条码化学条码”。稳定性稳定性 是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，以体现其通用性和实用性程度，以体现其通用性和实用性陈皮的薄层色谱指纹图谱陈皮的薄层色谱指纹图谱 银杏提取物的银杏提取物的HPLC指纹图谱指纹图谱GC-MS法的应用 GC-MS测定八角籽挥发油的化学组成 GC-MS测定八角籽挥发油的化学组成测定八角籽挥发油的化学组成 GC-MS测定八角籽挥发油的化学组成测定八角籽挥发油的化学组成57写在最后写在最后成功的基础在于好的学习习惯成功的基础在于好的学习习惯The foundation of success lies in good habits谢谢聆听 学习就是为了达到一定目的而努力去干,是为一个目标去战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard,Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal