SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳课件

SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验目的n n了解电泳实验原理了解电泳实验原理n n掌握电泳实验操作规程掌握电泳实验操作规程n n用电泳方法测定蛋白分子量用电泳方法测定蛋白分子量实验目的电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。性相反的电极移动的现象。电泳技术电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。的技术。电泳基本原理：电泳基本原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的 COO-COO-COOH +H+H+Pr Pr Pr +OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PHPI电泳用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理：带电颗粒在电场作用下所受的力：带电颗粒在电场作用下所受的力：电场力电场力 F=XQ阻力阻力 F=6当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动:F=FQX=6/X=Q/6带电颗粒在电场作用下所受的力：电场力 F=XQ阻力 F=影响电泳速度的因素：n n样品本身：带电量，分子大小，形状样品本身：带电量，分子大小，形状样品本身：带电量，分子大小，形状样品本身：带电量，分子大小，形状n n电场强度：电压电场强度：电压电场强度：电压电场强度：电压n n缓冲液：成分，缓冲液：成分，缓冲液：成分，缓冲液：成分，pH pH，离子强度，离子强度，离子强度，离子强度n n支持介质：电渗作用，吸附作用支持介质：电渗作用，吸附作用支持介质：电渗作用，吸附作用支持介质：电渗作用，吸附作用n n温度温度温度温度影响电泳速度的因素：样品本身：带电量，分子大小，形状分类n n连续电泳连续电泳n n不连续电泳不连续电泳n n非变性电泳非变性电泳n n变性电泳变性电泳分类连续电泳1.1.连续系统：连续系统：缓冲液的离子成分、缓冲液的离子成分、PHPH、凝胶浓、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应电荷效应、分子筛效应。2.2.不连续系统：不连续系统：缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pHpH、凝胶浓、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓浓缩效应缩效应、电荷效应、分子筛效应电荷效应、分子筛效应。分类分类1.连续系统：缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相分子筛效应：分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。电荷量不同，迁移率不同。分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分（1 1）缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、PHPH的不连续性：的不连续性：电极缓冲液的电极缓冲液的pH=8.3pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。（2 2）凝胶孔径的不连续性：凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。交界处，因迁移受阻而被压缩。浓缩效应浓缩效应（1）缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳课件成分成分成分成分pHpH值值值值孔径孔径孔径孔径电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液电泳缓冲液甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸(慢离子慢离子慢离子慢离子)8.38.3样品样品样品样品蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质6.76.7浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶ClCl-(快离子快离子快离子快离子)6.76.7大大大大分离胶分离胶分离胶分离胶ClCl-(快离子快离子快离子快离子)8.98.9小小小小成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应不连续电泳三大效应：不连续电泳三大效应：浓缩效应不连续电泳三大效应：n n非变性电泳非变性电泳n n变性电泳变性电泳测定亚基分子量测定亚基分子量非变性电泳n nSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）n n1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的SDS，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDn nSDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 n n因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质蛋白质分子大小SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含 当当蛋蛋白白质质的的分分子子量量在在15,00015,000200,000200,000之之间间时时，样样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：符合如下方程式：Lg MW =Lg MW =b b m m R R +K +K 其其中中，MW MW 为为蛋蛋白白质质的的分分子子量量，m m R R 为为相相对对迁迁移移率率，b b为为斜斜率率，K K为为截截距距。当当条条件件一一定定时时，b b与与K K均均为常数为常数 因因此此通通过过已已知知分分子子量量的的蛋蛋白白与与未未知知蛋蛋白白的的比比较较，就可以得出未知蛋白的分子量就可以得出未知蛋白的分子量 当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）使使用用含含有有十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（SDS）和和还还原原剂剂（通通常常为为巯巯基基乙乙醇醇）的的样样品品处处理理液液对对蛋蛋白白质质样样品品进进行行处处理理（一一般般煮煮沸沸35分分钟钟），通通过过加加热热和和SDS可可以以使使蛋蛋白白质质变变性性，多多亚亚基基的的蛋蛋白白质质也也将将解解离离为为单单亚亚基基。同同时时还还原原剂剂可可以以切切断断蛋蛋白白质中的二硫键（使二硫键还原）。质中的二硫键（使二硫键还原）。经经过过这这样样处处理理的的样样品品中中的的肽肽链链都都是是处处于于无无二二硫硫键键连连接接的的，分分离离的的状状态态。由由于于SDS是是带带有有负负电电荷荷的的分分子子，同同时时它它有有一一个个长长的的疏疏水水尾尾巴巴，SDS通通过过疏疏水水尾尾巴巴与与肽肽链链中中的的氨氨基基酸酸的的疏疏水水侧侧链链结结合合，结结合合SDS的的比比率率大大约约是是一一个个蛋蛋白白质质分分子中每两个氨基酸残基结合一分子的子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）垂直板垂直板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向 垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。相对迁移率相对迁移率标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数水平式电泳装置水平式电泳装置电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶 等电聚焦电等电聚焦电泳（泳（IFE）利用聚丙烯酰利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电在电场作用下沿电场方向在凝胶内制场方向在凝胶内制造一个造一个pH梯度。梯度。每种蛋白质都每种蛋白质都将迁移至与它的将迁移至与它的pI 相一致的相一致的pH处。处。凝胶中加凝胶中加有两性电有两性电解质溶液解质溶液（pH9-3）加电场后加电场后在凝胶内形在凝胶内形成一个稳定成一个稳定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布 等电聚焦电泳（IFE）凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-双向电泳双向电泳第一向第一向第一向第一向：等电聚焦电泳等电聚焦电泳第二向第二向第二向第二向：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维经染色后蛋白呈现二维分布图：分布图：水平方向反映出蛋白水平方向反映出蛋白在在pI上的差异，上的差异，垂直方向反映出它们在垂直方向反映出它们在分子量上的差别分子量上的差别。第一向电第一向电泳：等电泳：等电聚焦电泳聚焦电泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶凝胶上，进行上，进行第二向电第二向电泳泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3 双向电泳第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片单体：丙烯酰胺（单体：丙烯酰胺（AcrAcr）；）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（交联剂：甲叉双丙烯酰胺（BisBis）；）；催化剂：过硫酸胺或核黄素；催化剂：过硫酸胺或核黄素；加速剂：四甲基乙二胺（加速剂：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）；产物：三维网状结构凝胶。产物：三维网状结构凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAG）的聚合反应：）的聚合反应：单体：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰胺凝胶（polyacryl操作过程操作过程 1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备准备2 2个干个干净的小烧杯净的小烧杯2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好操作过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干,准备2个干净的小分离胶分离胶(10%10ml10%10ml)浓缩胶浓缩胶(5%10ml)(5%10ml)ddHddH2 2O O4.05ml4.05ml6.8ml6.8ml30%Acr30%Acr3.3ml3.3ml1.7ml1.7mlBufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5mlTris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25mlTris-HCl 1.25ml10%SDS10%SDS100100l l100100l l10%Ap10%Ap5050l l100100l lTEMEDTEMED1010l l1010l l 配配 胶胶 分离胶(10%10ml)浓缩胶(5%10ml)dd 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置至胶凝 *凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒 *水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面 4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好按比例配好浓缩胶浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处处,迅速迅速插入梳子插入梳子,静置到胶凝静置到胶凝 *梳子需一次平稳插入梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡,梳底梳底需水平需水平 5.5.拔出样梳后拔出样梳后,在槽中加入缓冲液在槽中加入缓冲液 *水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝6.6.上样：上样：（1 1）marker 5marker 5 l l （2 2）样品）样品10 10 l+2l+2上样上样buffer 10buffer 10 l l 共共2020 l l 100100沸水浴，沸水浴，3-5min 3-5min？（蛋白变性）？（蛋白变性）7.7.微量注射器（加样器）上样微量注射器（加样器）上样,上样量上样量 1515 l l *微量注射器不可过低微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可以防刺破胶体；也不可过高过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔6.上样：8.8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在流恒定在10mA10mA（120V120V），当进入分离胶后改为），当进入分离胶后改为20mA20mA（180V180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数），溴酚蓝距凝胶边缘约数cmcm时，停止电泳时，停止电泳 9.9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色色液，染色1 1小时左右小时左右 10.10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰色液脱色，直到蛋白质区带清晰*剥胶时要小心剥胶时要小心,保持胶完好无损保持胶完好无损,染色要充分染色要充分 11.11.实验结果分析实验结果分析 8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流按下式计算相对迁移率：每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性=蛋白样品距加样端迁移距离cm溴酚蓝区带中心距加样端距离cm 相对迁移率按下式计算相对迁移率：=蛋白样品距加样端迁移距离cm溴酚蓝