干细胞与iPS技术培训课件

第八讲第八讲 干细胞与干细胞与iPSiPS技术技术生命科学与生物制药学院生命科学与生物制药学院 沈晗沈晗Lucas Cranach,1472-1553自然界中生物的再生现象自然界中生物的再生现象将涡虫切断后，断面能够识别头部或者尾部的位置，如果切掉的是头，头部将在该位置再生；如果切掉的是尾，尾巴将在该位置再生蝾螈的四肢、壁虎的尾巴都具有自然再生的能力青蛙与蝾螈同属两栖动物，却不具备再生的能力，但青蛙的前身蝌蚪却又显示出四肢再生的能力。20世纪初，遗传学家ThomasMorgan利用涡虫flatworm,Planaria为材料研究过再生问题。研究说明切割下来的组织块小到涡虫虫体的1/279时仍然能够再生出一条小涡虫。因此,涡虫又被誉为“切不死的动物。他将这个过程称为变形再生morphallaxis。再生组织是由伤口处已分化细胞的去分化衍生而来,还是来源于称为全能干细胞的neoblasts(未分化细胞),这是一个长期争论不休的问题。后来研究发现，在涡虫体内有一种散布在全身，好似没什么功能的非常小的细胞，它们就是干细胞。涡虫的干细胞能够转变成“其他任何种类的细胞，具有这种性质的细胞在生物学上被称为“全能干细胞。第一节第一节 干细胞干细胞 一、一、干细胞的定义干细胞的定义 干干细细胞胞是是一一类类具具有有自自我我更更新和分化潜能的细胞。新和分化潜能的细胞。二.干细胞特性及分类及分类 干细胞的特性：干细胞的特性：1，形态和生化特征形态和生化特征:圆形、体积小、核质比例大，圆形、体积小、核质比例大，端粒酶活性高端粒酶活性高2，干细胞的增殖特点 缓慢性：干细胞的增殖速度一般比较慢。而一旦机体需要时，干细胞就可以进入分化。自稳性：会自我更新维持自身数目的恒定。self-maintenance 干细胞维持自稳性的机制干细胞维持自稳性的机制干细胞维持自稳性的机制干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂对称分裂和不对称分裂对称分裂和不对称分裂对称分裂和不对称分裂 干细胞的对称分裂和不对称分裂干细胞的对称分裂和不对称分裂对对对对称分裂称分裂称分裂称分裂 symmetrydivisionsymmetrydivision不不不不对对对对称分裂称分裂称分裂称分裂 asymmetrydivisionasymmetrydivision干细胞干细胞 分分 化化 细细 胞胞 干细胞干细胞 分化细胞分化细胞缓慢性 干干细细胞胞若干次分裂若干次分裂过渡放大细胞过渡放大细胞 是介于干细胞和分化细胞之是介于干细胞和分化细胞之间的中间态细胞。它可以起到通过较少的干间的中间态细胞。它可以起到通过较少的干细胞产生较多的分化细胞的作用。细胞产生较多的分化细胞的作用。分化分化细细胞胞过过渡放大渡放大细细胞胞3，干细胞的分化特点，干细胞的分化特点 1.多潜能性多潜能性 2 2.去分化和转分化的能力去分化和转分化的能力在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能在不同生长因子刺激下干细胞可表现出不同分化潜能（内胚层内胚层内胚层内胚层）胃胃上皮上皮中胚层中胚层 骨、软骨、平滑肌、横纹肌骨、软骨、平滑肌、横纹肌（外胚层外胚层外胚层外胚层）神经表皮、神经节、复层鳞状上皮神经表皮、神经节、复层鳞状上皮人胚胎干细胞具分化的多潜能性人胚胎干细胞具分化的多潜能性 小鼠皮下小鼠皮下注射注射 混合组织瘤混合组织瘤人胚胎人胚胎 干细胞干细胞1 1 1 1去分化去分化去分化去分化 一种干细胞向其前体细胞的逆向一种干细胞向其前体细胞的逆向一种干细胞向其前体细胞的逆向一种干细胞向其前体细胞的逆向转化的过程。转化的过程。转化的过程。转化的过程。2 2 2 2转分化转分化转分化转分化transdifferentiationtransdifferentiationtransdifferentiationtransdifferentiation 一种组一种组一种组一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型细胞的过程。组织类型细胞的过程。组织类型细胞的过程。组织类型细胞的过程。例一：将成年雄性小鼠的造血干细胞移植到雌例一：将成年雄性小鼠的造血干细胞移植到雌例一：将成年雄性小鼠的造血干细胞移植到雌例一：将成年雄性小鼠的造血干细胞移植到雌鼠体内，鼠体内，鼠体内，鼠体内，3 3 3 3天后在雌鼠的神经胶质细胞中检天后在雌鼠的神经胶质细胞中检天后在雌鼠的神经胶质细胞中检天后在雌鼠的神经胶质细胞中检测到测到测到测到 Y Y Y Y 染色体的存在，证明成体动物的造染色体的存在，证明成体动物的造染色体的存在，证明成体动物的造染色体的存在，证明成体动物的造血干细胞可转分化成为神经胶质细胞。血干细胞可转分化成为神经胶质细胞。血干细胞可转分化成为神经胶质细胞。血干细胞可转分化成为神经胶质细胞。2 2.去分化和转分化的能力去分化和转分化的能力例二：造血干细胞向骨骼肌细胞的转分化例二：造血干细胞向骨骼肌细胞的转分化二干细胞的别离与纯化二干细胞的别离与纯化 1.通过干细胞外表的标记分子进行通过干细胞外表的标记分子进行 造血干细胞标记物为造血干细胞标记物为CD34等；神经等；神经干细胞的巢素蛋白。干细胞的巢素蛋白。2.通过干细胞不同于一般分化细胞的通过干细胞不同于一般分化细胞的物理特性进行物理特性进行 干细胞不被干细胞不被Hoechst33342和和Rhodamine123染色。染色。三，干细胞的分类三，干细胞的分类1全能干细胞：具有全能性，能够分化成全身全能干细胞：具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，多种细胞类型，并能进一步形成机体的任何组织和并能进一步形成机体的任何组织和器官。以生殖干细胞器官。以生殖干细胞embryonic germ cells,EG细胞为代表。细胞为代表。2多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。以胚胎干细胞但却失去了发育成完整个体的能力。以胚胎干细胞embryonic stem cells,ES细胞为代表。细胞为代表。3专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。的细胞分化。一胚胎干细胞一胚胎干细胞 人体发生过程：人体发生过程：人体发生过程：人体发生过程：受精受精卵裂卵裂受精后受精后72h受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子合子合子卵裂球卵裂球桑椹胚桑椹胚囊胚囊胚滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结构胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚内胚层内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群内细胞群中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统胚胎干细胞的概念 胚胎干细胞胚胎干细胞embryonic stem cell,ES细胞细胞指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克胞、同时可保持不分化状态而持续生长的克隆细胞系。隆细胞系。胚胎干细胞的生物学特性胚胎干细胞的生物学特性 (1)ES细胞形态结构与核型细胞形态结构与核型：各种动物的各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小、细胞相似的形态结构，细胞体积小、核大、有核大、有1个或多个核仁。个或多个核仁。(2)ES细胞的生长特性：细胞的生长特性：对于高等脊椎动物而言，干细胞在机对于高等脊椎动物而言，干细胞在机体组织中的居所被称为体组织中的居所被称为干细胞巢干细胞巢 (3)ES细胞高度分化潜能细胞高度分化潜能：ES细胞的全能性是区别于成纤维细细胞的全能性是区别于成纤维细胞等体细胞的特点。胞等体细胞的特点。ES细胞体外生长细胞体外生长时应该培养在时应该培养在饲养层细胞饲养层细胞上才能维持上才能维持其未分化状态，脱离饲养层就会自发其未分化状态，脱离饲养层就会自发地进行分化。地进行分化。增殖速度：增殖速度：1824h分裂增殖一次分裂增殖一次ES必须在含有白血病抑制因子必须在含有白血病抑制因子LIF的培养基的培养基及成纤维细胞饲养层及成纤维细胞饲养层(提供干细胞生长不可提供干细胞生长不可缺少的成纤维细胞生长因子缺少的成纤维细胞生长因子FGF)条件下才条件下才能保持繁殖而不分化。能保持繁殖而不分化。ES体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖而抑止其分化。裂增殖而抑止其分化。具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能。具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能。三人胚胎干细胞的来源与鉴定三人胚胎干细胞的来源与鉴定Human Embryonic Stem Cell 胚胎干细胞的来源为早期胚胎内细胞胚胎干细胞的来源为早期胚胎内细胞群或原始生殖细胞。群或原始生殖细胞。哺乳动物早期胚哺乳动物早期胚胎的发育属于调整型，每个胚胎细胞胎的发育属于调整型，每个胚胎细胞都具有全能性。都具有全能性。a.a.取自体外受精胚胎囊胚期内细胞群。取自体外受精胚胎囊胚期内细胞群。b.取自终止妊娠的胎儿的性器官组织。取自终止妊娠的胎儿的性器官组织。c.c.通过体细胞核转移技术克隆技术获得通过体细胞核转移技术克隆技术获得2.克隆技术克隆技术克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。先前一直认为，高等动物的细胞分化是一个不可逆的过程，先前一直认为，高等动物的细胞分化是一个不可逆的过程，因此无法利用已分化的动物细胞进行克隆的。因此无法利用已分化的动物细胞进行克隆的。英国剑桥大学的约翰英国剑桥大学的约翰戈登教授首先通过实验研究从理论上戈登教授首先通过实验研究从理论上证明了动物细胞重新编程是完全有可能的，证明了动物细胞重新编程是完全有可能的，1962年，他通过实年，他通过实验把青蛙肠上皮的细胞的细胞核移植进入去掉核的卵母细胞质验把青蛙肠上皮的细胞的细胞核移植进入去掉核的卵母细胞质中，并培育出成体青蛙。这一实验首次证实分化了的细胞基因中，并培育出成体青蛙。这一实验首次证实分化了的细胞基因组是可以逆转变化的，具有划时代的意义，并且为动物克隆实组是可以逆转变化的，具有划时代的意义，并且为动物克隆实验奠定了根底，大名鼎鼎的克隆羊多利就是依照戈登所创造的验奠定了根底，大名鼎鼎的克隆羊多利就是依照戈登所创造的方法被克隆出来的。方法被克隆出来的。克隆羊克隆羊Dolly的诞生的诞生 1996年年7月月5日，位于苏格兰爱丁堡市郊的日，位于苏格兰爱丁堡市郊的罗斯林研究所里诞生了一头大个头儿羊羔，罗斯林研究所里诞生了一头大个头儿羊羔，实验室编号为实验室编号为6LL3，克隆羊工程小组主管，克隆羊工程小组主管伊恩伊恩威尔默特以著名乡村歌手多利威尔默特以著名乡村歌手多利帕帕顿的名字命名这头羊。顿的名字命名这头羊。多利于多利于1997年首次公开亮相，震动整个世年首次公开亮相，震动整个世界，美国界，美国?科学科学?杂志把多利的诞生评为当杂志把多利的诞生评为当年世界十大科技进步的第一项。年世界十大科技进步的第一项。哺乳动物克隆技术的开展哺乳动物克隆技术的开展克隆羊：克隆羊：1996年年7月，苏格兰月，苏格兰克隆鼠：克隆鼠：1997年年10月，日、美、英月，日、美、英克隆牛：克隆牛：1998年年7月，日本月，日本克隆猫：克隆猫：2002年年2月，美国月，美国克隆狗：克隆狗：2005年年4月，月，韩国，黄禹锡韩国，黄禹锡克隆恒河猴：克隆恒河猴：2007年年11月，美国月，美国 轰动世界的黄禹锡造假事件轰动世界的黄禹锡造假事件 2004年年2月黄禹锡在月黄禹锡在?科学科学?杂志上发表论文，宣布杂志上发表论文，宣布在世界上率先用卵子成功培育出人类胚胎干细胞；在世界上率先用卵子成功培育出人类胚胎干细胞；2005年年5月，他又在月，他又在?科学科学?杂志上发表论文，宣布杂志上发表论文，宣布攻克了利用患者体细胞克隆胚胎干细胞的科学难题，攻克了利用患者体细胞克隆胚胎干细胞的科学难题，其研究成果一时轰动全球。其研究成果一时轰动全球。2005年年4月黄禹锡在月黄禹锡在?自然自然?杂志上发表论文，成功杂志上发表论文，成功实现了狗的克隆。实现了狗的克隆。“斯纳皮正是世界上第一条克斯纳皮正是世界上第一条克隆狗。隆狗。2006年年1月首尔大学调查委员会公布了造假事件调查结月首尔大学调查委员会公布了造假事件调查结果，称发表在果，称发表在science上的两篇论文都属于造假。克隆狗上的两篇论文都属于造假。克隆狗的那篇论文被证明是可信的。的那篇论文被证明是可信的。首尔大学随后宣布解除黄禹锡的教授职务，韩国政府也首尔大学随后宣布解除黄禹锡的教授职务，韩国政府也取消了授予黄禹锡的取消了授予黄禹锡的“最高科学家称号。最高科学家称号。黄禹锡东山再起黄禹锡东山再起2021年年10月月17日，黄禹锡及其团队宣布利用狗的卵子，成功异种克隆日，黄禹锡及其团队宣布利用狗的卵子，成功异种克隆了只郊狼。了只郊狼。2021年年3月月13日，黄禹锡与俄罗斯研究人员日，黄禹锡与俄罗斯研究人员13日签署合作协议，打算日签署合作协议，打算利用克隆技术复活大约利用克隆技术复活大约1万年前灭绝的史前生物猛犸象。万年前灭绝的史前生物猛犸象。克隆人？克隆人？a a 胚胎干细胞具有正常稳定的二倍体核胚胎干细胞具有正常稳定的二倍体核型和带型。型和带型。b b 胚胎干细胞具有较高的胚胎干细胞具有较高的端粒酶活性端粒酶活性及及碱碱性磷酸酶性磷酸酶的表达。的表达。人胚胎干细胞系端粒酶活性都人胚胎干细胞系端粒酶活性都很高，说明其可在体外未分化状很高，说明其可在体外未分化状态进行长期培养。态进行长期培养。3.胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定c.人胚胎干细胞特异外表抗原的表达人胚胎干细胞特异外表抗原的表达 胚胎阶段特异性抗原胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson别离的别离的hES 阴性阴性 弱阳性弱阳性 强阳性强阳性Gearhart别离的别离的hES 阳性阳性 弱阳性弱阳性 阳性阳性小鼠小鼠ES 阳性阳性 阴阴性性 阴性阴性鼠和人胚胎干细胞表达的外表抗原有种属鼠和人胚胎干细胞表达的外表抗原有种属差异。差异。Gearhart等认为等认为SSEA-1阳性可能是源于阳性可能是源于原始生殖细胞的多能干细胞分化的标原始生殖细胞的多能干细胞分化的标志志.细胞膜外表有特殊的标记：细胞膜外表有特殊的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81d.具有转录因子具有转录因子Oct-4的表达的表达 Oct-4只限定在多潜能细胞中表达。只限定在多潜能细胞中表达。人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因人和小鼠的胚胎干细胞都表达转录因子子Oct-4，当胚胎干细胞分化时，其，当胚胎干细胞分化时，其表达能力大大降低。表达能力大大降低。Oct-4可能是哺乳动物不同发育可能是哺乳动物不同发育阶段多潜能细胞所特有的少数特异的阶段多潜能细胞所特有的少数特异的调控分子之一。调控分子之一。e.不被不被Hoechst33342和和Rhodamine123染色染色f.能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤g.可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞胚胎干细胞的诱导分化胚胎干细胞的诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞胚胎干细胞造血细胞造血细胞RA胚胎干细胞胚胎干细胞神经细胞神经细胞DMSO胚胎干细胞胚胎干细胞肌肉细胞肌肉细胞TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞胚胎干细胞血管和内皮细胞血管和内皮细胞RA+胰岛素胰岛素+T3胚胎干细胞胚胎干细胞脂肪细胞脂肪细胞BMP-2,BMP-4胚胎干细胞胚胎干细胞软骨细胞软骨细胞地塞米松，磷酸甘油地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞胚胎干细胞骨细胞骨细胞基因转染基因转染胚胎干细胞胚胎干细胞胰岛素分泌细胞胰岛素分泌细胞二成体干细胞二成体干细胞 成体干细胞成体干细胞是成体组织内具有自我更是成体组织内具有自我更新及分化新及分化一种或一种以上子细胞的未一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。成熟细胞。在成体组织或器官中，许多细胞自我在成体组织或器官中，许多细胞自我更新及分化产生不同组织细胞的能力，更新及分化产生不同组织细胞的能力，如血液和皮肤细胞。如血液和皮肤细胞。科学家鉴定或别离出多种成体组织的干细胞，科学家鉴定或别离出多种成体组织的干细胞，造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等等。造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等等。由于别离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难由于别离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，取材，加之胚胎细胞研究的争议尚未平息，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。随着干神经干细胞的研究仍处于初级阶段。随着干细胞研究领域向深度和广度不断扩展，人们细胞研究领域向深度和广度不断扩展，人们对干细胞的了解也将更加全面。对干细胞的了解也将更加全面。实际上，克隆羊实际上，克隆羊Dolly的诞生就已经证明，通过体细的诞生就已经证明，通过体细胞核移植实验实现哺乳动物体细胞的重编程是可能的，胞核移植实验实现哺乳动物体细胞的重编程是可能的，将已分化细胞的细胞核植入卵细胞内可以使已分化细将已分化细胞的细胞核植入卵细胞内可以使已分化细胞基因组中处于沉默状态的基因再次被激活，形成多胞基因组中处于沉默状态的基因再次被激活，形成多能干细胞，最终发育形成一个新的完整的生命体。重能干细胞，最终发育形成一个新的完整的生命体。重编程的体细胞几乎能够实现对胚胎干细胞的替代。编程的体细胞几乎能够实现对胚胎干细胞的替代。但是，体细胞核移植试验具有很大的局限性：但是，体细胞核移植试验具有很大的局限性：1.克隆的效率极低克隆的效率极低 2.产生的许多后代在各个阶段都表达出严重的发育异产生的许多后代在各个阶段都表达出严重的发育异常常 3.由于需要卵母细胞，核移植实验在人类中的应用受由于需要卵母细胞，核移植实验在人类中的应用受到强烈的伦理学质疑。到强烈的伦理学质疑。有没有相有没有相对简单，又可，又可摆脱材料脱材料来源和来源和伦理学理学诸多限制，重多限制，重编程程的效率和程度都十分可的效率和程度都十分可观的新方的新方法呢？法呢？51第二节第二节 iPS技术技术概念：概念：iPS，诱导性多能干细胞，诱导性多能干细胞 induced pluripotent stem cells,iPS cells iPS技术，即诱导多能干细胞技术，也技术，即诱导多能干细胞技术，也称细胞称细胞重新编程技术，是在特定的条件下将重新编程技术，是在特定的条件下将成体成熟、分成体成熟、分化的体细胞逆转恢复到全能分化的状化的体细胞逆转恢复到全能分化的状态，成为一类态，成为一类类似胚胎干细胞多能干细胞的新类似胚胎干细胞多能干细胞的新兴技术。兴技术。2021年，年，iPS技术荣膺技术荣膺?自然自然-方法方法?年年度生命科学度生命科学技术。技术。iPS技术的诞生技术的诞生 2006年年8月，日本京都大月，日本京都大学的山中伸弥学的山中伸弥Shinya Yamanaka)教授领导的研教授领导的研究团队发现，只需要将四究团队发现，只需要将四个基因个基因(Oct3/4,Sox2,c-myc和和Klf4)送入已分化完送入已分化完全的小鼠纤维母细胞，即全的小鼠纤维母细胞，即可以把纤维母细胞重新编可以把纤维母细胞重新编排变成全能性的类胚胎干排变成全能性的类胚胎干细胞。他们将这种细胞。他们将这种 返老返老还童的重新编排细胞称还童的重新编排细胞称之为诱导式多能性干细之为诱导式多能性干细胞，即胞，即iPS细胞。细胞。山中伸弥教授 Shinya Yamanakahttp:/qnet.nishinippon.co.jp/InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdultFibroblastCulturesbyDefinedFactors.Yamanaka,S.,Takahashi,K.Cell126,663676,August25,2006 2007年年11月月20日，美国的日，美国的Thomson实验室在实验室在science上上发表文章，第一次成功地由人发表文章，第一次成功地由人类的体细胞诱导为类的体细胞诱导为IPS细胞。他细胞。他们从们从14个保持人类个保持人类ES细胞多能细胞多能性状态的基因筛选出四个基因性状态的基因筛选出四个基因OCT3/4,SOX2,NANOG,and LIN28，将之用慢病毒载体转入，将之用慢病毒载体转入人类体细胞中，得到了在增殖人类体细胞中，得到了在增殖能力、，形态学，核型，端粒能力、，形态学，核型，端粒酶活性，细胞外表标志，酶活性，细胞外表标志，ES特特征基因表达，畸胎瘤拟胚体形征基因表达，畸胎瘤拟胚体形成能力上与人类成能力上与人类ES相似的相似的IPS细胞。细胞。InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticCells.JUNYINGYU,MaximA.Vodyanik,JamesA.Thomson,SCIENCE21December2007:Vol.318.no.5858,pp.1917-1920 2007年年11月月20日，日本日，日本Yamanaka实验室在实验室在CELL上发表了用人类的成纤维细胞皮肤成纤维细胞，成上发表了用人类的成纤维细胞皮肤成纤维细胞，成纤维细胞样滑膜细胞，纤维细胞样滑膜细胞，BJ细胞，通过逆转录病毒载细胞，通过逆转录病毒载体导入体导入Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc四个基因，也成功四个基因，也成功得到了人类的得到了人类的IPS细胞，并证明它们在形态学，核型，细胞，并证明它们在形态学，核型，端粒酶活性，细胞外表标志，端粒酶活性，细胞外表标志，ES特征基因表达，畸胎特征基因表达，畸胎瘤拟胚体形成方面与瘤拟胚体形成方面与ES细胞相似。同时，他们还成功细胞相似。同时，他们还成功的将这些的将这些IPS细胞诱导成神经细胞，心肌细胞。在这细胞诱导成神经细胞，心肌细胞。在这次实验中，他们通过对次实验中，他们通过对MEF引入了小鼠的你转录位点，引入了小鼠的你转录位点，提高了转到率。提高了转到率。InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactorsYamanaka,S.,Takahashi,K.Cell131,861872,November30,2007iPS被被?自然自然?和和?科学科学?杂志评为杂志评为2007年第一和第二大科学进展。年第一和第二大科学进展。诱导诱导iPS细胞四个基因细胞四个基因的选择的选择l体细胞可藉由将核送入卵中或是和胚胎干细胞核融体细胞可藉由将核送入卵中或是和胚胎干细胞核融合而被重建合而被重建(Cowan et al.,2005;Tada et al.,2001)l必定有某些基因将细胞维持在多能性的状态必定有某些基因将细胞维持在多能性的状态l胚胎细胞中胚胎细胞中：Oct3/4、Sox2、Nanog(Nichols et al.,1998;Niwa et al.,2000;Avilion et al.,2003;Chambers et al.,2003;Mitsui et al.,2003)l癌细胞中癌细胞中：Stat3、E-Ras、c-myc、Klf4、b-catenin(Matsuda et al.,1999;Niwa et al.,1998;Takahashi et al.,2003;Cartwright et al.,2005;Li et al.,2005;Kielman et al.,2002;Sato et al.,2004)4/24：Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4iPS cell：induced pluripotent stem celll材料：HDF-Slc7a1 l高加索36岁女性脸部皮肤l0天：转入基因Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4l6天：放置于mytomycin C-treated SNL feeder cell中(51045105)l7天：置換成干细胞专用培养液实验材料及诱导方案实验材料及诱导方案0天转染10%FBSES medium+bFGF6天30天 培养于feeder 上收取colonyB、HDF形态形态D、25天后形成颗粒状群落天后形成颗粒状群落(与与hES形态形态相似相似)C、14天后形成之颗粒状群落天后形成之颗粒状群落重建人类体细胞重建人类体细胞-产产生生iPS 从从顆粒狀群落中挑出类似顆粒狀群落中挑出类似hES细细胞胞的群落：的群落：7/122，8/84，8/171，5/73，6/122，11/213发发育成紧密堆叠且扁平状的群落育成紧密堆叠且扁平状的群落类类似似hES：细胞核大、細胞质少：细胞核大、細胞质少会自发性分化会自发性分化需要需要feeder cell才可生存才可生存圖E、培養出的iPS 細胞型態图F、放大后的iPS細胞图G、iPS細胞群落中間自发性分化的細胞重建人类体细胞重建人类体细胞-产产生生iPSiPS细细胞检测胞检测-hES marker表现表现lstage-specific embryonic antigen-1(SSEA-1)lSell-specific surface antigens(Adewumi et al.,2007)iPS细细胞检测胞检测-hES marker表现表现RT-PCR：iPS表现表现hES markerES：胚胎干细胞NTRA-2：人类胚胎瘤细胞HDF：人类真皮纤维母细胞图一、RT-PCR分析hES marker基因表现结果iPS细细胞检测胞检测-hES marker表现表现lWestern blotting：OCT3/4、SOX2、NANOG、SALL4、E-CADHERIN、hTERT(Adewumi et al.,2007)蛋白蛋白质表达质表达量和量和hES细细胞相似胞相似ES：胚胎干细胞NTRA-2：人类胚胎瘤细胞HDF：人类真皮纤维母细胞图二、hES marker 的western blot分析端粒酶活性测试端粒酶活性测试胚胎干细胞会高胚胎干细胞会高度表达度表达hTERT基因基因-：实验组+：加热抑制端粒酶活性(阴性对照)IC：internal control图三、用TRAP法测试trlomerase活性iPS细细胞培养为类胚胎体胞培养为类胚胎体将将iPS细胞细胞放入悬浮的培养液中生长放入悬浮的培养液中生长8天后形成球状的类胚胎体天后形成球状的类胚胎体(embryoid bodies,EBs)将类胚胎体置于将类胚胎体置于覆蓋覆蓋gelatin的培养基中生的培养基中生长长8天天iPS cells附著于培养基上并分化成各种细附著于培养基上并分化成各种细胞胞形态形态类类胚胎体的分化胚胎体的分化l可在in vitro的状态下将iPS细胞分化成三种胚层似神经元细胞表皮细胞似鹅卵石细胞内胚层内胚层marker蛋白蛋白中胚层中胚层marker蛋白蛋白外胚层外胚层marker蛋白蛋白心肌细胞的marker gene图图四、四、RT-PCR分析结果分析结果U：未分化的细胞D：已分化的细胞NTERA-2：胚胎瘤细胞HDF：人类內皮纤维母细胞iPS细细胞分化为心肌细胞胞分化为心肌细胞利用利用activin A 及及morphogenetic protein(BMP)将将iPS细细胞分化成心肌细胞。胞分化成心肌细胞。(Laflamme et al.,2007)诱导诱导分化分化12天后天后iPS技术路线图技术路线图英国剑桥大学发育生物学家约翰英国剑桥大学发育生物学家约翰格登格登日本京都大学物质日本京都大学物质细胞统合系统据细胞统合系统据点点iPS细胞研究中心主任长山中伸弥细胞研究中心主任长山中伸弥北京时间北京时间8 8日日1717时时3030分，诺贝尔奖官方网站报道二人获得了分，诺贝尔奖官方网站报道二人获得了20212021年度诺贝尔生理学或医学奖年度诺贝尔生理学或医学奖 ，二人还于，二人还于20212021年获得美国年获得美国拉斯克根底医学研究奖拉斯克根底医学研究奖 近年来，近年来，iPS技术研究进展技术研究进展中国科学家在中国科学家在iPS技术研究中的奉献技术研究中的奉献2021年年7月，英国月，英国?自然自然?杂志网站报道，中国科学家周琪和高绍荣等人利用杂志网站报道，中国科学家周琪和高绍荣等人利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了该成果让人们看到了iPS细胞具有实用性。细胞具有实用性。2021年年7月月18日，国际学术权威杂志日，国际学术权威杂志Science杂志刊登了北京大学生命科学学杂志刊登了北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带着的研究团队在生命科学领域的一项革命性的研院邓宏魁教授和赵扬博士带着的研究团队在生命科学领域的一项革命性的研究成果究成果用小分子化合物诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。该成果开辟用小分子化合物诱导体细胞重编程为多潜能干细胞。该成果开辟了一条全新的实现体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病了一条全新的实现体细胞重编程的途径，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。带来了新的可能。iPS技术的风险性技术的风险性iPS技术之父技术之父Yamanaka曾指出，经典方法获得的曾指出，经典方法获得的iPS细胞具有细胞具有很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。很强的致瘤性，甚至高于胚胎干细胞。同时，同时，Yamanaka还还表示，导致肿瘤不是表示，导致肿瘤不是iPS细胞唯一的缺陷，由细胞唯一的缺陷，由iPS细胞发育出细胞发育出的嵌合体小鼠的嵌合体小鼠chimericmice会表现出显著的健康问题。会表现出显著的健康问题。这意味着在这意味着在iPS细胞用于临床之前，还有更多更远的挑战需要细胞用于临床之前，还有更多更远的挑战需要克服。各国科学家正为此而努力！克服。各国科学家正为此而努力！山中伸弥教授语录山中伸弥教授语录“不要做大阪的狗怎么叫那样的实验！不要做大阪的狗怎么叫那样的实验！“希望年轻研究者留意有没有模仿别人，希望年轻研究者留意有没有模仿别人，有没有重复走别人的老路。因为真正的创有没有重复走别人的老路。因为真正的创新只出现在未知的领域。新只出现在未知的领域。“我信守着努力工作的座右铭，竭尽全我信守着努力工作的座右铭，竭尽全力的钻研、研究。力的钻研、研究。73