试验原理微核micronucleus微核试验课件

小鼠骨髓细胞微核实验环境毒理学实验环境毒理学实验小鼠骨髓细胞微核实验环境毒理学实验1.1 环境毒理学环境毒理学1.引言 研究研究环境污染物环境污染物，特别是化学污染，特别是化学污染物对物对生物有机体生物有机体，尤其是对人体的，尤其是对人体的损损害作用及其机理害作用及其机理的科学。的科学。1.1 环境毒理学1.引言 研究环境污染物，特别是化学藻类生长抑制实验藻类生长抑制实验鱼类急性毒性实验鱼类急性毒性实验经口急性毒性实验经口急性毒性实验小鼠骨髓细胞微核实验小鼠骨髓细胞微核实验一般毒性一般毒性特殊毒性特殊毒性1.2 环境毒理学实验环境毒理学实验环境毒理学的研究方法水生脊椎动物水生脊椎动物浮游植物浮游植物哺乳类哺乳类啮齿动物啮齿动物藻类生长抑制实验鱼类急性毒性实验经口急性毒性实验小鼠骨髓细胞1.3 遗传毒性研究遗传毒性研究突突变(mutation)：遗传物质发生的可改变生殖细胞或体细胞中的遗传信息并产生新的表型效应的变化。环境致突变作用化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变，可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关自发突变诱发突变化学因素化学因素物理因素物理因素生物因素生物因素 环境化学诱变物环境化学诱变物药品：药品：抗癌药物环磷酰胺、氨苯喋啶等抗癌药物环磷酰胺、氨苯喋啶等农药：农药：DDT,DDT,敌敌畏，谷硫磷等敌敌畏，谷硫磷等工业生产中应用和产生的污染物工业生产中应用和产生的污染物 亚硝胺类，多环芳烃类，甲醛，苯，亚硝胺类，多环芳烃类，甲醛，苯，砷，铅砷，铅1.3 遗传毒性研究突变(mutation)：遗传物质发生的1.4 致突变试验致突变试验评定外源化合物对生殖细胞及体细胞的致突变性对遗传危害性做出初步评价用于环境诱变剂污染的监测及评价有价值的工具用来评价诱发癌症的可能性1.4 致突变试验遗传毒性研究新技术遗传毒性研究新技术聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术单细胞凝胶电泳试验单细胞凝胶电泳试验 荧光原位杂交荧光原位杂交 转基因小鼠突变试验转基因小鼠突变试验 基因芯片技术基因芯片技术 常用经典方法常用经典方法AmesAmes试验试验微核试验微核试验染色体畸变分析染色体畸变分析SCE SCE 试验试验显性致死试验显性致死试验试验原理微核micronucleus微核试验课件根据检测的遗传学终点，可将致突变实验分为根据检测的遗传学终点，可将致突变实验分为基因突变试基因突变试验验、染色体损伤试验染色体损伤试验、非整备体试验非整备体试验和和DNADNA损伤试验损伤试验。根据检测的遗传学终点，可将致突变实验分为基因突变试验、染色体2.1 实验目的实验目的n学习和掌握小鼠骨髓细胞学习和掌握小鼠骨髓细胞微核实验方法微核实验方法 和嗜多染红细胞和嗜多染红细胞(PCE)(PCE)微核测定方法微核测定方法n了解了解微核测试的原理微核测试的原理和和遗传毒理学遗传毒理学在实际生活与在实际生活与工作中的应用范围及意义工作中的应用范围及意义2.小鼠骨髓细胞微核试验2.1 实验目的学习和掌握小鼠骨髓细胞微核实验方法 和嗜多微核形成原理微核形成原理微核：微核：染色体断裂或纺锤丝受损,在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。2.2 实验原理实验原理微核微核micronucleus微核形成原理微核：染色体断裂或纺锤丝受损,在细胞有丝分裂后微核试验：微核试验：通过观察微核的形成情况来检测断裂剂及非整备体诱发剂。可以根据可以根据嗜多染红细胞嗜多染红细胞(PCE)细胞中微核出现率，细胞中微核出现率，观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的观察环境污染物对染色体完整性和染色体分离改变的影响，判定其有无遗传毒性影响，判定其有无遗传毒性 。微核试验：通过观察微核的形成情况来检测断裂剂及非整备体诱发剂2.3 实验器材实验器材 1.手术刀手术刀2.手术剪手术剪3.无齿镊无齿镊4.小型弯止血钳小型弯止血钳5.干净纱布干净纱布6.带橡皮头吸管带橡皮头吸管7.台式离心机台式离心机8.刻度离心管刻度离心管 9.电吹风机电吹风机10.玻璃蜡笔玻璃蜡笔11.2ml注射器及针头注射器及针头12.载玻片及推片载玻片及推片13.定时钟定时钟14.带油镜头显微镜带油镜头显微镜15.细胞计数器细胞计数器16.玻璃染色缸玻璃染色缸17.晾片架晾片架2.3 实验器材 手术刀 9.电吹风机2.4 主要试剂主要试剂 p甲醇（分析纯）甲醇（分析纯）p生理盐水生理盐水p小牛血清小牛血清ppH6.8的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液分别取分别取1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液的磷酸二氢钾溶液50.40ml和和1/15mol/L的磷酸氢二钠溶液的磷酸氢二钠溶液49.60ml，两者混合均匀。，两者混合均匀。p吉姆萨吉姆萨(Giemsa)染液染液p阳性对照物阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素环磷酰胺或丝裂霉素C2.4 主要试剂 甲醇（分析纯）2.5 实验步骤实验步骤（1）实验动物及处理实验动物及处理 实验动物实验动物 品系：品系：昆明种小鼠昆明种小鼠 性别：性别：雌性雄性各半雌性雄性各半 周龄：周龄：8 8周周 体重：体重：18-20 g18-20 g 2.5 实验步骤（1）实验动物及处理 染毒途径染毒途径u 经口经口u 经皮经皮u 经呼吸道经呼吸道u 注射注射小白鼠的灌胃方法小白鼠的灌胃方法小白鼠的腹腔注射小白鼠的腹腔注射方法方法 测试气态污染物的毒性，应优先选择测试气态污染物的毒性，应优先选择 哪种染毒方式？哪种染毒方式？a.a.经口经口 b.b.经皮经皮 c.c.经呼吸道经呼吸道 d.d.注射注射 测试主要存在于水体、食物中的化合测试主要存在于水体、食物中的化合物的毒性，应优先选择哪种染毒方式物的毒性，应优先选择哪种染毒方式？测试化妆品主要成分的毒性，应优先测试化妆品主要成分的毒性，应优先选择哪种染毒方式？选择哪种染毒方式？染毒途径 经口小白鼠的灌胃方法小白鼠的腹腔注射方法 测试 染毒次数及取样时间染毒次数及取样时间染毒时间微核率环境毒物诱发微核出现环境毒物诱发微核出现的高峰时间：的高峰时间：24-72 h染毒次数：染毒次数：4次连续染毒次连续染毒 每每24 h染毒染毒1次次 染毒次数及取样时间染毒时间微核率环境毒物诱发微核出现染毒 剂量选择剂量选择n 染毒组染毒组n 阴性对照组阴性对照组n 阳性对照组阳性对照组最高剂量组采用该毒物的最大耐受量(或1/2 LD50)在此以下再设3-5个浓度组等体积溶剂环磷酰胺 50-100 mg/kg丝裂霉素C 100 mg/kg在动物实验中不引起实验动物死亡的最大剂量或浓度 剂量选择 染毒组 阴性对照组 阳性对照组最高剂量组采用该(2)骨髓液的制备和涂片骨髓液的制备和涂片取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉小牛血清混匀、推片推片的操作方法推片的操作方法(2)骨髓液的制备和涂片取胸骨剪去骨骺端擦净血污，剔去肌肉(3)固定固定 涂片自然干燥后放人甲醇中固定15 min。(4)染色染色 用新鲜配置的吉姆萨使用液染色 10-15 min，取出后迅速用磷酸盐 缓冲液(pH 6.8)冲洗染色残液，晾干(3)固定(4)染色（5）观察计数观察计数低倍镜观察低倍镜观察(100-400(100-400倍放大倍放大)选择细胞分布均匀、疏密适度、染色较好、选择细胞分布均匀、疏密适度、染色较好、形态完整的区域形态完整的区域油镜油镜(1000(1000倍放大倍放大)细胞计数细胞计数嗜多染红细胞和微核嗜多染红细胞和微核注意区分注意区分微核和杂质微核和杂质（5）观察计数低倍镜观察(100-400倍放大)油镜(100（6）数据处理和结果评价数据处理和结果评价微核率计算方法微核率计算方法结果评价结果评价阳性判断标准：阳性判断标准：实验组微核率显著高于对照组，具有重现性 具有剂量-效应关系阴性判断标准：阴性判断标准：实验剂量足够大，染毒次数足够（6）数据处理和结果评价微核率计算方法结果评价阳性判断标准：（7）质量保证质量保证/质量控制质量控制 (QA/QC)阴性对照阴性对照：应得到阴性结果，微核自发率约为3阴性对照异常的可能原因阴性对照异常的可能原因试剂被污染实验动物异常，实验前已接触遗传毒物操作错误阳性对照阳性对照：应得到阳性结果，各次实验结果具有重现性阳性对照异常的可能原因阳性对照异常的可能原因无效染毒，染毒试剂已分解实验动物异常，周龄不合适，敏感度下降操作错误（7）质量保证/质量控制(QA/QC)阴性对照：应得到阴性注 意 事 项 1.1.实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污染。染。2.2.骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠。之间互不重叠。3.3.正确区分微核和涂片上的异物。正确区分微核和涂片上的异物。4.4.实验动物年龄不宜过大。实验动物年龄不宜过大。注 意 事 项 1.实验所用的器具必须洁净，小牛血清无污