中药色谱指纹图谱方法学薄层色谱课件

二、中药色谱指纹图谱方法学二、中药色谱指纹图谱方法学 高效液相色谱高效液相色谱()薄层色谱薄层色谱()气相色谱气相色谱()毛细管电泳毛细管电泳()（二）薄层色谱（二）薄层色谱 .概概 述述 快快速速、简简单单、灵灵敏敏鉴鉴别别、含含量量分分析析 器器械械、仪仪器器、计计算算机机化化、自自动动化化快速发展快速发展 指纹谱特点：指纹谱特点：结果直观结果直观 离线操作的灵活性离线操作的灵活性 .薄薄层色色谱操作操作规程程可选择可选择可选择可选择系统适用性试验系统适用性试验 检测限检测限 比移值比移值(Rf)(Rf)分离度分离度 自动多次展开自动多次展开全自动定量点样全自动定量点样薄薄层层指指纹纹图图谱谱报报告告简单操操 作作组合合供试品溶液制备供试品溶液制备手工半定量点样手工半定量点样玻璃双槽展开箱展开玻璃双槽展开箱展开显色显色直观观测直观观测(可见光及紫外光可见光及紫外光)判断样品指纹谱相似度判断样品指纹谱相似度拍摄色谱图像照片记录拍摄色谱图像照片记录复复杂操操作作组合合供试品溶液制备供试品溶液制备计算机控制半自算机控制半自动或全自或全自动定量点定量点样玻璃双槽展开箱展开或自动展开箱展开玻璃双槽展开箱展开或自动展开箱展开 显色显色直观观测直观观测(可见光及紫外光可见光及紫外光)拍摄色谱图像照片记录拍摄色谱图像照片记录数数码成像及成像及数据数据处理理薄薄 层层 扫扫 描描积分数据积分数据计算机相算机相似度似度评价价 .薄薄层色色谱的的规范化范化 ()()器材的器材的规范化范化 固固液液萃萃取取小小柱柱；定定量量微微升升毛毛细管管；标准准展展开开箱箱或或双双槽槽展展开开箱箱；预制制薄薄层板板；展展开开条条件件控控制制槽槽；紫紫外外光光灯灯；显色色喷雾器器或或浸浸渍显色色用用玻玻璃缸；薄璃缸；薄层色色谱扫描描仪。半半自自动薄薄层点点样器器；计算算机机控控制制、参参数数可可与与薄薄层扫描描仪共共享享的的全全自自动薄薄层点点样器器；自自动展开箱；薄展开箱；薄层色色谱成像及成像及图像像处理系理系统。()()操作操作规程的程的规范化范化 点点样展开展开显色色 ()()供供试品溶液的品溶液的预处理理 “杂质”对待待测的的活活性性成成分分或或指指标成成分分形形成成干干扰。不不经预处理理，很很难得得到到清清晰晰明明确确的的结果。例果。例 方方法法：.加加热回回流流 .超超声声提提取取 .液液液液萃萃取取 .固固液液萃萃取取样品品的的提提取取液液通通过固固相相小小柱柱处理理。吸吸附附、键合合相相分分配配、正正相相、反反相相、离离子子对、离离子子交交换原原理理富富集集待待测组分分，去去除除部部分分杂质。如雪如雪莲花花,甲醇提甲醇提取液，不取液，不经净化化处理，理，色色谱的可的可见光或光或荧光光图像与像与经预处理理(小柱小柱洗脱洗脱)的的图像比像比较，很，很显然然经过预处理将理将杂质去除后色去除后色谱图像像质量明量明显提高。提高。()()展开溶展开溶剂的的选择 展开展开剂薄薄层色色谱的关的关键 展开展开剂优化化依靠依靠经验 展开展开剂要求要求分离度高，斑点多。分离度高，斑点多。展开展开剂最最优化模式化模式难以以计算：算：（）（）样品中多品中多类别成分共存，成分共存，优化模式化模式难以外延。以外延。（）溶（）溶剂蒸气在展开中起着蒸气在展开中起着举足足轻重作用，但又重作用，但又难以以获得可得可测量的参数量的参数鉴别判断信息多判断信息多 ()()溶溶剂蒸气蒸气对色色谱行行为的影响的影响 薄薄层色色谱“开放开放”环境下展开，展开境下展开，展开剂蒸气蒸气也参与展开全也参与展开全过程。程。展开前蒸气展开前蒸气预平衡平衡 调整蒸气整蒸气浓度度 保持展开溶保持展开溶剂新新鲜度度 改善色谱质量改善色谱质量黄黄 连溶溶剂系系统：苯醋酸乙苯醋酸乙酯甲醇异丙醇甲醇异丙醇氨水氨水(：，：，)。检测：置紫：置紫外光灯外光灯()()下下检视 图 黄黄连的的荧光薄光薄层色色谱图.巴巴马汀；汀；.小檗碱；小檗碱；.表小檗碱；表小檗碱；.黄黄连碱；、碱；、.味味连；、；、.雅雅连；、；、.云云连；、；、.商品黄商品黄连；.药根碱；根碱；.非洲防己碱非洲防己碱 中中浓氨液的蒸气相在色氨液的蒸气相在色谱中起了关中起了关键作用：作用：仅用用预平衡，氨蒸气量不足，平衡，氨蒸气量不足，药根碱、非洲防己碱、巴根碱、非洲防己碱、巴马汀、汀、小檗碱均不能分开；小檗碱均不能分开；改用改用浓氨水在一氨水在一侧槽中槽中预平衡后展开，平衡后展开，则药根碱非洲防己碱、根碱非洲防己碱、巴巴马汀、小檗碱均得到分离；汀、小檗碱均得到分离；中除去中除去浓氨水，氨水，仅用用浓氨水氨水预平衡，色平衡，色谱分离度仍很差；分离度仍很差；中中浓氨水改氨水改为水，一水，一侧槽中用槽中用浓氨水平衡，分离效果同。氨水平衡，分离效果同。巴马汀小檗碱表小檗碱黄连碱 大大 黄黄 游离蒽游离蒽醌薄薄层色色谱分析分析,展开展开剂为石油石油醚()甲酸乙甲酸乙酯甲酸甲酸()()，用新，用新鲜开瓶的甲酸乙开瓶的甲酸乙酯时，种游离蒽种游离蒽醌分离度很好。若用反复多次开瓶使用的甲分离度很好。若用反复多次开瓶使用的甲酸乙酸乙酯时，由于甲酸乙，由于甲酸乙酯吸收了空气中水分而或多或吸收了空气中水分而或多或少分解而少分解而导致色致色谱的分离度大大降低。的分离度大大降低。或配好的展开或配好的展开剂反复多次使用，反复多次使用，各溶各溶剂比例改比例改变，色色谱重重现性差。性差。.芦芦荟大黄素大黄素 .大大黄酸黄酸 .大黄素大黄素 .大黄素甲大黄素甲醚 .大大黄酚黄酚 ()()环境因素的影响环境因素的影响 相对湿度相对湿度分离度分离度 （牛胆汁：（牛胆汁：，四种分不开），四种分不开）温温 度度分离度和值分离度和值 三七药材中的三七皂苷与人参皂苷只有在低温三七药材中的三七皂苷与人参皂苷只有在低温()()才能分开。才能分开。R R +R+Re eR RR Re eR Re e R R 实例例人参人参类药材薄材薄层色色谱指指纹图谱 .试验材料及材料及仪器器 ()()对照品照品 人参皂苷、人参皂苷、伪人参皂苷、三七皂苷。人参皂苷、三七皂苷。()()薄薄层板板 自制硅胶板；自制硅胶板；预制硅胶板制硅胶板()()；高效板；高效板()()。()()仪器器 、点点样器及全自器及全自动点点样器、器、双槽展开缸、展开槽、双槽展开缸、展开槽、展开槽、薄展开槽、薄层色色谱条条件控制槽、薄件控制槽、薄层扫描描仪(均均为瑞士瑞士产品品)、薄、薄层色色谱扫描描软件、薄件、薄层色色谱扫描及描及评价价软件件()()、薄薄层色色谱摄像像仪(，)。（)试药 氯仿仿(精制、重蒸精制、重蒸)、乙酸乙、乙酸乙酯、正丁醇、正丁醇、甲醇甲醇(分析分析纯)。()()供供试品品 吉林生晒参、吉林吉林生晒参、吉林红参、新开河参、新开河红参、参、三七、高三七、高丽红参、高参、高丽白参、高白参、高丽曲参、美国西洋参、曲参、美国西洋参、加拿大西洋参、国加拿大西洋参、国产引种西洋参。引种西洋参。.样品品预处理理 ()()供供试液液 样品甲醇品甲醇回流提取回流提取提取液提取液 浓缩至至近干近干水溶解水溶解 正丁醇萃取正丁醇萃取正丁醇液正丁醇液 减减压蒸干蒸干五氧化二磷真空干燥器中干燥五氧化二磷真空干燥器中干燥 总皂苷皂苷 加甲醇溶解，加甲醇溶解，使成每含使成每含总皂苷皂苷(西洋参、三七西洋参、三七为)，作，作为供供试液。液。()()供供试液液 甲醇回流液甲醇回流液适当适当浓缩碱性氧化碱性氧化铝小小柱柱甲醇洗脱甲醇洗脱洗脱液洗脱液减减压蒸干蒸干残渣残渣加水溶解加水溶解水溶液水溶液 小柱小柱甲醇洗脱甲醇洗脱甲醇液甲醇液蒸干蒸干 残渣残渣甲醇溶解，使每含甲醇溶解，使每含(人参人参总皂苷皂苷)或或(西洋参或三七西洋参或三七总皂苷皂苷)，作，作为供供试液。（除去人参皂苷，特液。（除去人参皂苷，特别因用因用预制板制板时，人参皂苷与人参皂苷或重叠。）人参皂苷与人参皂苷或重叠。）.点点样 用微升毛用微升毛细管分管分别吸取人参皂苷混合吸取人参皂苷混合对照品甲醇液照品甲醇液()，人参、西洋参、三七供，人参、西洋参、三七供试液各液各，点，点样于硅胶板于硅胶板上，原点直径上，原点直径 或各吸取或各吸取点点样于高效板上，于高效板上，原点直径原点直径)()、斑点相、斑点相对位置重位置重现性好性好(区区 区；区；红参区参区 区区 区，区的峰比生晒参更明区，区的峰比生晒参更明显。生晒参生晒参 红参参 高高丽参参 西洋参西洋参 微微观分析，西洋参色分析，西洋参色谱均呈一高均呈一高()()一低一低()()的二重峰，的二重峰，区区 皮部皮部 木质部木质部 主根主根 主皂苷：须根主皂苷：须根 主根主根 位位：为为两两分分子子葡葡萄萄糖糖，为为一一分分子子葡葡萄萄糖糖。推推测测须须根根含含量量较较高高而而含含量量较较低低的的原原因因，可可能能是是在在人人参参根根内内生生物物合合成成周周期期较较长长，在在主主根根中中积积累累的的多多，而而须须根根生生命命周周期期短短，来来不及积累。不及积累。指指纹纹谱谱的的区区别别也也可可解解释释须须根根虽虽总总皂皂苷苷含含量量高高，但但其其临床疗效并不高于主根。临床疗效并不高于主根。生晒参与红参的不同生晒参与红参的不同D D区微量皂苷的多少区微量皂苷的多少 红红参参由由于于蒸蒸煮煮致致使使某某些些主主要要皂皂苷苷RblRbl、ReRe、RglRgl部部分分水水解解成成Rg3Rg3、RhRh等等微微量量皂皂苷苷，从从而而D D区区的的微微量量皂皂苷苷含含量量增增高高，指指纹纹图图谱谱的的该该区区峰峰形形明明显显，构构成特征。成特征。指指纹纹谱谱的的区区别别也也说说明明中中医医认认为为红红参参与与生生晒晒参参药性有所差异。药性有所差异。