第7章-重组DNA药物课件

基因工程基因工程是指重组是指重组DNADNA技术的产业化设计与应用，技术的产业化设计与应用，包括包括上游技术上游技术和和下游技术下游技术两大组成部分。两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组构建（即重组DNADNA技术）；而下游则涉及到基因技术）；而下游则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。纯化过程。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和1优点：优点：1 1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质的不足之处和多肽；去除内源性物质的不足之处2 2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生、提供足够数量的生理活性物质，以进行生理生化、结构的研究理生化、结构的研究3 3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源性生理活性物质性生理活性物质4 4、获得新型化合物、获得新型化合物优点：2主要基因工程产品的研制、开发、上市时间主要基因工程产品的研制、开发、上市时间主要基因工程产品的研制、开发、上市时间主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品产品人生长激素释放抑制素（人生长激素释放抑制素（SRM)人胰岛素人胰岛素首次克隆首次克隆表达时间表达时间国家国家用途用途首次进入首次进入市场时间市场时间国家国家/地区地区1977日本日本治疗巨人症治疗巨人症1978美国美国治疗糖尿病治疗糖尿病1982欧洲欧洲人生长激素（人生长激素（HGH)1979美国美国治疗侏儒症治疗侏儒症1985美国美国人人干扰素（干扰素（IFN)1980美国美国治疗病毒感染症治疗病毒感染症1985美国美国乙肝疫苗乙肝疫苗1983美国美国预防乙型肝炎预防乙型肝炎1986欧洲欧洲人白细胞介素人白细胞介素21984日本日本治疗肿瘤治疗肿瘤1989欧洲欧洲人促红细胞生成素人促红细胞生成素治疗贫血治疗贫血1988欧洲欧洲人粒细胞集落刺激因子人粒细胞集落刺激因子治疗中性白细胞治疗中性白细胞减少症减少症1991美国美国人组织纤溶酶原激活剂人组织纤溶酶原激活剂（t-PA)治疗血栓症治疗血栓症1987美国美国主要基因工程产品的研制、开发、上市时间产品人生长激素释放抑制3DNADNA重组药物制造的主要步骤重组药物制造的主要步骤重组药物制造的主要步骤重组药物制造的主要步骤获得目的基因获得目的基因DNA的体外重组的体外重组（切与连）（切与连）载体的选择受体细胞的选择重组重组DNA分子转化分子转化（转）（转）转化子的筛选与鉴定转化子的筛选与鉴定（选）（选）外源基因的大规模表达和分离纯化外源基因的大规模表达和分离纯化产品的检验和制剂制备产品的检验和制剂制备DNA重组药物制造的主要步骤获得目的基因DNA的体外重组（切4第7章-重组DNA药物课件5二、基本过程二、基本过程上游阶段：实验室 获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选合适表达系统等下游阶段：将实验室成果产业化 发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制v注意：上游注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保证，这是基因工程产业化的基本原则。证，这是基因工程产业化的基本原则。二、基本过程上游阶段：实验室注意：上游DNA重组的设计必须61 1、目的基因的获得、目的基因的获得1 1）、鸟枪法（基因文库）、鸟枪法（基因文库）基因组基因组DNADNA提取提取 限制性内切酶部分水解限制性内切酶部分水解与载体连接与载体连接转化、扩增与筛选转化、扩增与筛选2 2）、逆转录法（）、逆转录法（cDNAcDNA文库）文库）mRNAmRNA纯化纯化cDNAcDNA第一合成第一合成第二链合成第二链合成 cDNAcDNA克隆克隆将重组体导入宿主细胞将重组体导入宿主细胞 cDNA cDNA文库鉴定文库鉴定目的目的cDNAcDNA克隆的分离和鉴定克隆的分离和鉴定3 3）、）、合成法合成法4 4）、）、PCRPCR法法1、目的基因的获得1）、鸟枪法（基因文库）74、PCR法或逆转录法或逆转录PCR（RT-PCR）典型PCR反应包括 模板变性 94以上（12）退火 5055（12）延伸 72（12）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从53 延伸。4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）8(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)(d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)(c)(b)引物2533355(d)新引物53955333355靶靶靶靶DNADNA片段片段片段片段引物引物引物引物A A5 55 5引物引物引物引物AA3333PCRPCRPCRPCRPCRPCR3 33 35555PCRPCR引物引物引物引物B B引物引物引物引物C C5 55 53333混合混合混合混合,变性变性变性变性,退火退火退火退火5533553333553355+DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5533335555333355用引物用引物用引物用引物B B和和和和C C作作作作PCRPCRPCRPCRPCRPCR定点诱变定点诱变定点诱变定点诱变PCRPCR用于基因突变用于基因突变5335靶DNA片段引物A5 5引物A3310第7章-重组DNA药物课件11第7章-重组DNA药物课件12化学合成法化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp100bp可用化学合成法直接合成DNA。化学合成法13第7章-重组DNA药物课件142 2、基因表达、基因表达1 1）、选择宿主细胞）、选择宿主细胞 原核原核 大肠杆菌大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多：生长快；遗传研究深入；产品多为胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。为胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。需注意内毒素污染。需注意内毒素污染。枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌：分泌力强，不形成包含体；分泌力强，不形成包含体；不修饰；胞外酶可能会降解产物不修饰；胞外酶可能会降解产物 链霉菌链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖：分泌能力强；不致病，安全；有糖基化能力。基化能力。2、基因表达1）、选择宿主细胞15优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性优点：易大量生产，成本低，周期短16真核真核酵母酵母：研究基因表达调控最有效的单细胞真核微：研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌生物；基因组小，仅为大肠杆菌4 4倍；传代时倍；传代时间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用于间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组干扰素、乙肝表面抗原等重组DNADNA药物的生产。药物的生产。丝状真菌丝状真菌：有很强的蛋白质分泌能力，能正确加：有很强的蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发酵工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发酵和后处理工艺和后处理工艺哺乳动物细胞哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻：类似天然产物，但培养条件苛刻真核17大肠杆菌与真核细胞表达系统比较大肠杆菌与真核细胞表达系统比较大肠杆菌大肠杆菌:发酵发酵 包含体包含体 复性复性 纯化纯化 目的蛋白目的蛋白真核细胞真核细胞:发酵发酵 上清液上清液 纯化纯化 目的蛋白目的蛋白大肠杆菌与真核细胞表达系统比较大肠杆菌:18大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体 高效表达的目的蛋白高效表达的目的蛋白 在大肠杆菌内形成在大肠杆菌内形成大大 量无活性包含体。量无活性包含体。因无法有效的解决复因无法有效的解决复 性问题，在美国每性问题，在美国每年年 造成的经济损失就造成的经济损失就达达 几十亿美元几十亿美元 包含体电镜图包含体电镜图大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体 高效表达的目的蛋白包含体19蛋白质复性概念蛋白质复性概念将蛋白质从结构不规则、无将蛋白质从结构不规则、无 活性的状态，恢复到有唯一活性的状态，恢复到有唯一 立体结构、有生物活性的立体结构、有生物活性的 状态的过程称为状态的过程称为蛋白质复性蛋白质复性。蛋白质复性概念将蛋白质从结构不规则、无 202 2）、表达载体）、表达载体 要求：要求：a a、能独立复制、能独立复制b b、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记c c、具有有效运载外源基因的能力，能携带大、具有有效运载外源基因的能力，能携带大小不同的外源基因小不同的外源基因d d、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。2）、表达载体21 如大肠杆菌的如大肠杆菌的pBV220pBV220系统，为温度诱导表达系统，为温度诱导表达载体，已成功用于载体，已成功用于IL-2IL-2，IL-3IL-3，IFNIFN等等 pET pET系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替IPTGIPTG（异丙基硫代（异丙基硫代-D-D-半乳糖），产物可半乳糖），产物可达细胞总蛋白达细胞总蛋白2030%2030%，表达量可达总蛋白，表达量可达总蛋白50%50%。第7章-重组DNA药物课件22pETpETpETpET载体载体载体载体pET载体23 3 3）、构建工程菌）、构建工程菌 目的基因与载体目的基因与载体DNADNA的连接的连接v重组重组DNADNA向宿主细胞内转移向宿主细胞内转移v筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆v影响目的基因表达的因素影响目的基因表达的因素 3）、构建工程菌24三、重组药物的分离纯化三、重组药物的分离纯化 A A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不用的产物表达形式采取不同的策略针对不用的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化三、重组药物的分离纯化A 重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则25针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略 采用采用分泌型分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；行浓缩处理；采用采用包涵体包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；包涵体；采用采用融合型融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化性的，拟首先选用亲和层析进行纯化 表达在表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释应用低浓度的溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放重组蛋白。放重组蛋白。针对不同的产物表达形式采取不同的策略26针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 等电点等电点处于极端区域（处于极端区域（大于大于8 8或小于或小于5 5）的重组蛋白应首）的重组蛋白应首选选离子交换法离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的重组蛋白特异性的配体配体、底物底物、抗体抗体、糖链糖链等都是首选等都是首选亲和层析亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（解离常数应在合适的范围内（10108 810104 4mol/Lmol/L）;疏水层析疏水层析和和反相层析反相层析是根据蛋白质的是根据蛋白质的疏水性疏水性差异进行分差异进行分离的；离的；凝胶过滤层析凝胶过滤层析是根据蛋白的是根据蛋白的分子量和体积差异分子量和体积差异进行分离进行分离的；的；径向层析径向层析是近年来发展起来的集是近年来发展起来的集层析分离层析分离和和膜分离膜分离于一于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。优越性。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型27多种分离纯化技术的联合运用多种分离纯化技术的联合运用 在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段在最后阶段多种分离纯化技术的联合运用28合适分离纯化介质的选择合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有常用的蛋白质分离纯化介质有SephadexSephadex和和SepharoseSepharose。理想的分离纯化介质应具有下列。理想的分离纯化介质应具有下列性质：性质：对目标蛋白具有较高的分辨对目标蛋白具有较高的分辨效率效率 对目标蛋白不会造成变性对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，化学性能和机械性能稳定，重复性好重复性好 价格低廉价格低廉合适分离纯化介质的选择29分离纯化过程的规模化分离纯化过程的规模化 蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。于生产工艺。分离纯化过程的规模化30四、质量控制四、质量控制v1 1、原材料质量控制原材料质量控制：2 2、培养过程质量控制培养过程质量控制 3 3、纯化工艺质量控制纯化工艺质量控制 4 4、目标产品质量控制目标产品质量控制 四、质量控制1、原材料质量控制：31保证编码保证编码DNADNA序列正确序列正确 要了解以下特性：要了解以下特性：A A、目的基因来源、克隆过程、序列、目的基因来源、克隆过程、序列 B B、表达载体名称、结构、遗传特性及酶切、表达载体名称、结构、遗传特性及酶切图谱、抗生素标记等图谱、抗生素标记等 C C、宿主名称、来源、传代历史、检定结果、宿主名称、来源、传代历史、检定结果及生物学特征及生物学特征 D D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态态 E E、插入基因于表达载体两侧控制区核酸序、插入基因于表达载体两侧控制区核酸序列列 F F、启动和控制克隆基因表达的方法及水平、启动和控制克隆基因表达的方法及水平保证编码DNA序列正确32v种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢失的现象程菌不应出现无突变或质粒丢失的现象v种子批系统种子批系统v工作细胞库工作细胞库种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢33v尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白等杂质，并避免在纯化过程带入有害物质等杂质，并避免在纯化过程带入有害物质 纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收纯化每一步应测定纯度、计算提纯倍数、收率等等率等等尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白等杂质，并避免在纯化过341 1）、产品的鉴别）、产品的鉴别氨基酸组成分析：氨基酸组成分析：肽图分析：肽图分析：N N末端和末端和C C末端氨基酸测序：末端氨基酸测序：蛋白质二硫键的分析：蛋白质二硫键的分析：重组蛋白相对分子量：重组蛋白相对分子量：等电点的测定：等电点的测定：2 2）、纯度分析：）、纯度分析：SDS-PAGE,CE,IEF,HPLCSDS-PAGE,CE,IEF,HPLC3 3）、生物活性测定）、生物活性测定4 4）、残余杂质检测）、残余杂质检测 宿主细胞蛋白含量、宿主细胞宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNADNA、残余抗生素等、残余抗生素等5 5）、安全性检测）、安全性检测 无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查1）、产品的鉴别35A A 体内生物学活性测定方法体内生物学活性测定方法 生物学模型生物学模型 生长激素生长激素 大鼠大鼠 脑垂体脑垂体B B 体外生物学活性测定方法体外生物学活性测定方法 如：如：MTT MTT法法:MTT formazan:MTT formazan(蓝紫色蓝紫色)干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干干扰素类蛋白：可用细胞毒抑制试验来测定干扰素的体外活性。扰素的体外活性。琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶A 体内生物学活性测定方法琥珀酸脱氢酶36五、重要的重组五、重要的重组DNADNA药物药物（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽 代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、代表产品：重组人胰岛素、重组人生长激素、重组人干扰素、重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片重组人白细胞介素、重组人集落刺激因子、重组抗体及其片断等。断等。效率高、产量大效率高、产量大 周期短、成本低周期短、成本低 工艺稳定、质量可控工艺稳定、质量可控 缺点是易形成包含体缺点是易形成包含体五、重要的重组DNA药物（一）利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或371 1）、干扰素（）、干扰素（IFN-IFN-、）1957 1957年年IsaccsIsaccs等发现病毒干扰现象，即病毒等发现病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒复制，因而命名为干扰素。干扰病毒复制，因而命名为干扰素。根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生根据产生干扰素细胞的来源、理化性质和生物活性等差异，可分为物活性等差异，可分为、等等3 3种，其种，其中中IFN-IFN-为多基因产物，有为多基因产物，有2323种以上的亚型。种以上的亚型。1）、干扰素（IFN-、）38 19861986年，年，FDAFDA批准批准RochRoch公司的重组公司的重组IFN-IFN-2a2a和和ScheringSchering公司的重组公司的重组IFN-2bIFN-2b，重，重组组IFN-IFN-、分别在分别在19901990年和年和19931993年上市。年上市。我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰素主要为素主要为IFN-1bIFN-1b型，型，19921992年我国第一个年我国第一个基因工程药物基因工程药物IFN-1bIFN-1b获得国家一类新药获得国家一类新药证书。证书。1986年，FDA批准Roch公司的重组IFN-2a392 2）胰岛素）胰岛素(Insulin,Ins)(Insulin,Ins)19211921年，年，Banting FGBanting FG等从胰脏中分离等从胰脏中分离19551955年，年，Sanger FSanger F测序测序19651965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成年，我国完成结晶牛胰岛素全合成19791979年，年，Rutter WRutter W等克隆了胰岛素基因等克隆了胰岛素基因19821982年，第一个重组人胰岛素批准上市年，第一个重组人胰岛素批准上市2）胰岛素(Insulin,Ins)40v胰岛素的结构及生物合成胰岛素的结构及生物合成v胰岛素原与胰岛素胰岛素原与胰岛素v人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法 v产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略 胰岛素的结构及生物合成41第7章-重组DNA药物课件42v(a)AB链分别表达法链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有1020v(b)人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。v(c)AB链同时表达法链同时表达法(a)AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有1043第7章-重组DNA药物课件44第7章-重组DNA药物课件453 3）生长激素）生长激素19441944年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素年，李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素19561956年，从人垂体中分离出年，从人垂体中分离出hGHhGH19691969年，年，hGHhGH序列报道序列报道 临床上用于垂体性侏儒症。临床上用于垂体性侏儒症。1956198519561985年，只年，只能从人尸体垂体中分离纯化。但至能从人尸体垂体中分离纯化。但至19851985年，共年，共发现发现5050多例克多例克-雅氏症，雅氏症，5 5人病亡，研究结果证人病亡，研究结果证实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒。实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒。19851985年，垂体来源的被禁用，同年，年，垂体来源的被禁用，同年，rhGHrhGH上市。上市。3）生长激素46v1985年，美国年，美国FDA批准由大肠杆菌发酵生产批准由大肠杆菌发酵生产的重组人生长激素上市，随后各种途径生产的重组人生长激素上市，随后各种途径生产的重组人生长激素迅速充斥市场。的重组人生长激素迅速充斥市场。1997年，年，仅美国仅美国Genentech和和Ely Lily两家公司的重组两家公司的重组人生长激素年产量已达人生长激素年产量已达20kg，年销售额超过，年销售额超过3.5亿美元。亿美元。v人生长激素的结构与性质人生长激素的结构与性质v重组人生长激素工程菌的构建重组人生长激素工程菌的构建1985年，美国FDA批准由大肠杆菌发酵生产的重组人生长激素47第7章-重组DNA药物课件48（二）利用重组酵母生产医用蛋白（二）利用重组酵母生产医用蛋白优势：优势：v1.1.最简单的真核生物，基因表达调控机理较清楚，最简单的真核生物，基因表达调控机理较清楚，并且遗传操作相对较为简单；并且遗传操作相对较为简单；v2.2.具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统加工系统v3.3.不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌在食品工业当中有着几百年的应用历史，属于菌在食品工业当中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统；安全型基因工程受体系统；v4.4.大规模发酵工艺简单，成本低廉大规模发酵工艺简单，成本低廉v5.5.能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中劣势：虽然拥有完整的蛋白质糖基化修饰系统，但其劣势：虽然拥有完整的蛋白质糖基化修饰系统，但其修饰方式不用于高等真核生物。修饰方式不用于高等真核生物。v举例：重组乙肝疫苗举例：重组乙肝疫苗 重组人血清白蛋白重组人血清白蛋白（二）利用重组酵母生产医用蛋白优势：49重组HAS的制备v人血清白蛋白人血清白蛋白HASHAS是血浆中的主要成分是血浆中的主要成分 载体蛋白。成载体蛋白。成熟的人血清白蛋白为一非糖基化的单一多肽链，由熟的人血清白蛋白为一非糖基化的单一多肽链，由585585个氨基酸组成，含有个氨基酸组成，含有1717对二硫键，由此维系的空对二硫键，由此维系的空间构象是血清白蛋白的生物功能所必需的。间构象是血清白蛋白的生物功能所必需的。v巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清白巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清白蛋白的表达分泌系统。产率可高达蛋白的表达分泌系统。产率可高达15g/L15g/L 重组HAS的制备人血清白蛋白HAS是血浆中的主要成分 载体蛋50（三）利用转基因动物或细胞生产生物大分子（三）利用转基因动物或细胞生产生物大分子v1.利用动物乳腺组织生产蛋白药物利用动物乳腺组织生产蛋白药物v 酪蛋白酪蛋白、tPA、IL2v2.利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复杂的人体蛋白杂的人体蛋白v例如例如 EPO（三）利用转基因动物或细胞生产生物大分子1.利用动物乳腺组织51促红细胞生成素（促红细胞生成素（EPOEPO）由肾脏分泌的一种唾液酸蛋白，它能促进红由肾脏分泌的一种唾液酸蛋白，它能促进红细胞系的增值、分化和成熟细胞系的增值、分化和成熟.由由166166个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白，个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白，其糖基对其生物活性至关重要其糖基对其生物活性至关重要 目前用哺乳动物细胞表达系统如目前用哺乳动物细胞表达系统如CHOCHO细胞生产。细胞生产。临床为治疗肾衰导致贫血的首选药物，全世界临床为治疗肾衰导致贫血的首选药物，全世界销售额超过销售额超过1010亿美元。亿美元。促红细胞生成素（EPO）52v19571957年年JacobsonJacobson等证实，肾脏是血清等证实，肾脏是血清EPOEPO的主的主要来源，含量极微小，无法分离纯化获得纯要来源，含量极微小，无法分离纯化获得纯品。直到品。直到19851985年，年，JacobsJacobs等才先后成功克隆等才先后成功克隆出人、猴、小鼠的出人、猴、小鼠的EPOEPO基因，随后重组人基因，随后重组人EPOEPO在在CHOCHO细胞中获得表达，并通过层析纯化技术细胞中获得表达，并通过层析纯化技术制备出制备出rHuEPOrHuEPO纯品，于纯品，于19891989年获得美国年获得美国FDAFDA批批准后首次投放市场。准后首次投放市场。1957年Jacobson等证实，肾脏是血清EPO的主要来源53EPO制备工艺 v根据已知天然根据已知天然EPO的氨基酸序列，合成相应的寡聚核苷酸探的氨基酸序列，合成相应的寡聚核苷酸探针，筛选出人针，筛选出人EPO基因，引入真核生物质粒表达载体基因，引入真核生物质粒表达载体PD11,用磷酸钙微量沉淀法转染用磷酸钙微量沉淀法转染CHO细胞，克隆培养后，检测培细胞，克隆培养后，检测培养上清中养上清中EPO的生物学活性，筛选出高效表达的生物学活性，筛选出高效表达EPO的细胞的细胞株，按照中国生物制品规程要求建立种子库，检定合格株，按照中国生物制品规程要求建立种子库，检定合格后用于生产。后用于生产。v CHO工程细胞在条件培养基中培养时，表达的工程细胞在条件培养基中培养时，表达的EPO分泌分泌到培养上清中，上清液中除了到培养上清中，上清液中除了EPO外，还含有培养基成分和外，还含有培养基成分和其他杂蛋白，利用其他杂蛋白，利用EPO 本身的物理化学性质，将培养上清本身的物理化学性质，将培养上清液加热至液加热至80，或用，或用6mol/L盐酸胍、盐酸胍、8mol/L尿素沉淀，可尿素沉淀，可以除去大多数杂蛋白。上清液超滤浓缩后，经过一系列的凝以除去大多数杂蛋白。上清液超滤浓缩后，经过一系列的凝胶过滤层析，如胶过滤层析，如Sephadex G25，Sephacryl S200及及Biogel P 等多步凝胶过滤，其等多步凝胶过滤，其EPO的纯度可达到的纯度可达到90以以上。进一步纯化可用上。进一步纯化可用Sepharose 4B偶联偶联EPO单克隆抗体或单克隆抗体或多克隆抗体亲和层析或经高压液相层析，其多克隆抗体亲和层析或经高压液相层析，其EPO纯度可达纯度可达99以上以上。EPO制备工艺 根据已知天然EPO的氨基酸序列，合成相应的寡54精品课件精品课件！精品课件！55精品课件精品课件！精品课件！56根据氨基酸序列根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸合成寡聚核苷酸筛选出筛选出EPO基因基因与真核载体连接转化与真核载体连接转化重组质粒重组质粒转染转染CHO筛选筛选高表达高表达CHO工程细胞工程细胞建立种子库建立种子库CHO工程细胞工程细胞培养培养培养液培养液去杂蛋白去杂蛋白初提取液初提取液80 盐酸胍盐酸胍凝胶层析凝胶层析EPO 纯度纯度达达90HPLC 或亲合层析或亲合层析EPO纯度达纯度达99根据氨基酸序列合成寡聚核苷酸筛选出EPO基因与真核载体连接转57