基因工程技术生产重组蛋白

利用基因工程技利用基因工程技术生生产重重组蛋白蛋白从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程从基因到蛋白的复制、转录和翻译过程功能蛋白功能蛋白组装组装什么是基因工程什么是基因工程 基基因因工工程程(Genetic Engineering)原原称称遗遗传传工工程程。是是指指在在分分子子水水平平上上将将一一种种或或多多种种生生物物体体(供供体体)的的DNA片片断断目目的的基基因因与与载载体体DNA分分子子如如质质粒粒、病病毒毒等等在在体体外外进进行行拼拼接接重重组组,产产生生新新的的自自然然界界从从未未有有过过的的重重组组DNA分分子子，然然后后转转入入另另一一种种生生物物体体(受受体体)内内，使使之之按按照照人人们们的的意意愿愿遗遗传传并并表表达达出出新新的的性性状状的的技技术术。基基因因工工程程有有时时也也称称为为重重组组DNA技技术术(DNA Recombination)或或分分子子克克隆隆技技术术(Molecular Cloning)。什么是重组蛋白什么是重组蛋白 重组蛋白是指将一种或多种生物体供体的重组蛋白是指将一种或多种生物体供体的基因导入另一种生物体受体内，使之按照人们基因导入另一种生物体受体内，使之按照人们的意愿遗传并表达出的蛋白质产物。的意愿遗传并表达出的蛋白质产物。n应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培应用基因工程技术构建重组细胞并通过重组细胞培养，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有养，令其超量合成其它生物体内含量极微但却具有极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活泼的极高经济价值重组蛋白是现代生物技术中最活泼的研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢研究方向之一，广泛应用于生产药用蛋白质及代谢工程等领域。工程等领域。n已经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎已经投放市场并正在研制开发的重组蛋白药物几乎触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌触及到医药的各个领域，包括各种抗病毒剂、抗癌因子、抗因子、抗AIDS药物、新型抗生素、重组疫苗、重组药物、新型抗生素、重组疫苗、重组生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、生长激素、重组干扰素、重组抗体、免疫辅助剂、抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以抗衰老保健品、心脑血管防护急救药、生长因子以及诊断试剂等。及诊断试剂等。重组蛋白的生产包括重组蛋白的生产包括 上游技术和下游技上游技术和下游技术两大组成局部。上游技术指的是外源基因术两大组成局部。上游技术指的是外源基因重组、克隆和表达载体以及基因工程菌细重组、克隆和表达载体以及基因工程菌细胞的设计与构建；而下游技术那么涉及到胞的设计与构建；而下游技术那么涉及到含有重组外源基因的生物细胞基因工程菌含有重组外源基因的生物细胞基因工程菌或细胞的大规模培养以及外源基因表达的或细胞的大规模培养以及外源基因表达的重组蛋白的别离纯化过程。重组蛋白的别离纯化过程。重组蛋白生产重组蛋白生产重组蛋白生产重组蛋白生产根本流程图根本流程图根本流程图根本流程图 重组蛋白的整个过程由工程菌重组蛋白的整个过程由工程菌(细胞细胞)的设计构建上游的设计构建上游技术和基因产物重组蛋白的生产下游技术两大局部技术和基因产物重组蛋白的生产下游技术两大局部组成，前者的单元操作过程如下组成，前者的单元操作过程如下:(1)从供体细胞中别离出基因组从供体细胞中别离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分，用限制性核酸内切酶分别将外源别将外源DNA(包括外源基因或目的基因包括外源基因或目的基因)和载体分子切开和载体分子切开(简简称切称切);(2)用用DNA连接酶将含有外源基因的连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上片段接到载体分子上，形成，形成DNA重组分子重组分子(简称接简称接);(3)借助于细胞转化手段将借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中重组分子导入受体细胞中(简简称转称转);(4)短时间培养转化细胞，以扩增短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中受体细胞的基因组中(简称增简称增);(5)筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞因工程菌或细胞(简称检简称检)。由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为由此可见，基因工程的上游操作过程可简化为:切、接、切、接、转、增、检。转、增、检。nThe DNA containing the gene must be isolated away from its genomic contextnThat should be simple but there are big problemsGene of interestCloning can supply large quantities of recombinant DNASingle bacterium transformed with single copy of plasmid which is subsequently replicatedGrowth to a colonyProvides several m mg of recombinant DNAProvides several mg of recombinant DNAInoculate into liquid broth重组蛋白表达的典型穿梭载体。重组蛋白表达的典型穿梭载体。MCS=多克隆位点；多克隆位点；Op=细菌复制起始位点；细菌复制起始位点；Mp=细菌中的选择性基因；细菌中的选择性基因；ME=真核生物中的选择性基因；真核生物中的选择性基因；OE=真核复制起始位点；真核复制起始位点；PE=真核启动子；真核启动子；TE=真核中止子；真核中止子；hG=表达的外源基因。表达的外源基因。重组蛋白的表达系统重组蛋白的表达系统 所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白所谓重组蛋白的表达系统，是指生产重组蛋白的基因工程宿主菌或宿主细胞。的基因工程宿主菌或宿主细胞。目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌主目前常用的表达系统宿主要有原核的细菌主要是大肠杆菌，要是大肠杆菌，E.Coli.和真核的酵母菌、昆虫细和真核的酵母菌、昆虫细胞、动物细胞系以及近年开展起来的盘基网柄菌系胞、动物细胞系以及近年开展起来的盘基网柄菌系统。统。1、原核生物表达系统细菌(E.coli.)2、真核生物表达系统酵母菌(Yeast)3、动物细胞4、昆虫细胞4、新型真核表达系统盘基网柄菌 盘基网柄菌盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)属于真属于真菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲(Acrasiomzcetes)。1869年真菌学家年真菌学家Oskar Brefeld首次描述了盘基网柄首次描述了盘基网柄菌。盘基网柄菌属菌。盘基网柄菌属D.discoideum由由Raper 1935年年发现。在自然界中发现。在自然界中D.discoideum 通过吞噬土壤外通过吞噬土壤外表的细菌摄取营养和繁殖。表的细菌摄取营养和繁殖。盘基网柄菌的生命周期生长阶段生长阶段发育阶段发育阶段 细胞聚集细胞聚集 细胞分化细胞分化 移动移动 到达顶点到达顶点 植物体植物体生长阶段生长阶段(growth phase)吞噬细胞吞噬细胞胞饮无菌培养基胞饮无菌培养基 (AX (AX2 2,AX,AX3 3 和和 AXAX4 4)丝足丝足伪足伪足吞噬细胞(Phagocytosis细胞聚集(Aggregation)细胞分化(Cell differentiation)移动阶段(Migration phase)假原质团假原质团(Pseudoplasmodium)(Pseudoplasmodium)Prestalk cells(15 Prestalk cells(15%)%)Prespores cells Prespores cells(75%)(75%)固体外表固体外表顶点 Culmination植物体形成不同表达系统的比较不同表达系统的比较重组基因工程菌的高密度培养重组基因工程菌的高密度培养n培养基组成的优化培养基组成的优化n 流加流加n固定化固定化n罐流床罐流床n微过滤微过滤 下下 游游培养基组成的优化培养基组成的优化碳源种类的选择碳源种类的选择下游：培养基组成的优化下游：培养基组成的优化基因工程菌培养技术基因工程菌培养技术基因工程菌培养技术基因工程菌培养技术流加培养流加培养2L发酵罐中流加培养盘基网柄菌生产发酵罐中流加培养盘基网柄菌生产hFasL基因工程菌的固定化培养基因工程菌的固定化培养n将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体将基因工程菌固定在多孔载体上，可提高菌体密度，实现连续发酵，为利用其生产异源蛋白密度，实现连续发酵，为利用其生产异源蛋白提供了有效途径。提供了有效途径。n多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和多孔载体：多孔陶瓷、浮石、片状硅胶泡沫和柱状硅胶泡沫等。柱状硅胶泡沫等。CeramTec(1.5-2.5 mmCeramTec(1.5-2.5 mm）PumicePumice（(1.5-2.5 mm(1.5-2.5 mm）Immobasil FS(0.8D,0.2 H)Immobasil FS(0.8D,0.2 H)Immobasil R(4O.D/2I.D Immobasil R(4O.D/2I.D,4L),4L)固定化培养基因工程菌细胞固定化培养基因工程菌细胞载体外表和内部的细胞固定化电镜扫描照片载体外表和内部的细胞固定化电镜扫描照片多孔陶瓷多孔陶瓷浮石浮石生物微胶囊固定化生物微胶囊固定化罐流床反响器连续培养固定化细胞罐流床反响器连续培养固定化细胞利用微过滤实现工程菌高密度培养利用微过滤实现工程菌高密度培养重组蛋白的别离纯化下游技术重组蛋白的别离纯化下游技术 生化别离工作的一般过程生化别离工作的一般过程 动、植物组织、体液等动、植物组织、体液等动、植物组织、体液等动、植物组织、体液等 胞外产物胞外产物胞外产物胞外产物 提取提取提取提取发酵液发酵液发酵液发酵液 预处理预处理预处理预处理 c c别离别离别离别离 c c破碎破碎破碎破碎 碎片别离碎片别离碎片别离碎片别离 初步纯化初步纯化初步纯化初步纯化 精制精制精制精制 制成品制成品制成品制成品培养液培养液培养液培养液 加加加加 热热热热 沉沉沉沉 淀淀淀淀 匀匀匀匀 化化化化 离离离离 心心心心 沉沉沉沉 淀淀淀淀 分子筛分子筛分子筛分子筛 无菌过滤无菌过滤无菌过滤无菌过滤酶反响酶反响酶反响酶反响 调调调调 pH pH 离离离离 心心心心 超超超超 声声声声 萃萃萃萃 取取取取 吸吸吸吸 附附附附 离离离离 子子子子 超超超超 滤滤滤滤 絮絮絮絮 凝凝凝凝 过过过过 滤滤滤滤 胞胞胞胞 溶溶溶溶 过过过过 滤滤滤滤 萃萃萃萃 取取取取 亲亲亲亲 和和和和 冻冻冻冻 干干干干 错流过滤错流过滤错流过滤错流过滤 研研研研 磨磨磨磨 错流过滤错流过滤错流过滤错流过滤 超超超超 滤滤滤滤 吸吸吸吸 附附附附 喷喷喷喷 干干干干 憎憎憎憎 水水水水 结结结结 晶晶晶晶 电电电电 泳泳泳泳重组蛋白的别离纯化下游技术n预处理及固液别离技术n 细胞破碎n 重组蛋白的包涵体处理技术n 离心n 膜别离技术n 双水相萃取n 反胶束提取纯化技术n 超临界萃取技术n吸附色谱别离技术吸附色谱别离技术n 活性炭活性炭n 氧化铝氧化铝n 硅胶硅胶n 滑石粉滑石粉n 硅藻土硅藻土n 大网格聚合物吸附大网格聚合物吸附n固相析出别离法固相析出别离法n 盐析法盐析法n 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法n 等电点沉淀等电点沉淀n 其它沉淀法其它沉淀法n 水溶性非离子型聚合物沉淀剂水溶性非离子型聚合物沉淀剂n 金属离子和络合物沉淀金属离子和络合物沉淀n 离子型多聚物沉淀剂离子型多聚物沉淀剂n 亲和沉淀亲和沉淀 n 结晶法结晶法n重组蛋白的色谱别离法重组蛋白的色谱别离法n 凝胶色谱凝胶色谱/分子筛色谱分子筛色谱n 离子交换离子交换n 亲和层析亲和层析n 电色谱电色谱n电泳别离技术电泳别离技术n 平板电泳平板电泳n 连续凝胶电泳连续凝胶电泳n 等电聚焦点用等电聚焦点用n 毛细管电泳毛细管电泳n 连续流动电用连续流动电用n 无载体连续流动电泳无载体连续流动电泳