血红蛋白的提取与分离

1精选课件 本本课题课题学学习习目目标标 体体验验从复从复杂杂体系中提取生物大分子的基体系中提取生物大分子的基本本过过程和方法，并了解色程和方法，并了解色谱谱法、法、电电泳法等分泳法等分离生物大分子的基本原理。离生物大分子的基本原理。1 1 1 1、主要概念：、主要概念：、主要概念：、主要概念：凝胶色凝胶色谱谱法法 电电泳法泳法 缓缓冲溶液冲溶液 它它们们在血在血红红蛋白的提取中分蛋白的提取中分别别起到什么作用。起到什么作用。2.2.2.2.主要原理：主要原理：主要原理：主要原理：凝胶色凝胶色谱谱法分离蛋白法分离蛋白质质的原理的原理 电电泳泳法分离法分离样样品的原理品的原理 缓缓冲溶液的冲溶液的组组成和作用机理成和作用机理3 3 3 3、课题课题课题课题重点：重点：重点：重点：凝胶色凝胶色谱谱法的原理和方法法的原理和方法 4 4 4 4、课题难课题难课题难课题难点：点：点：点：样样品的品的预处预处理理 色色谱谱柱填料的柱填料的处处理理和色和色谱谱柱的装填。柱的装填。2精选课件 2003200320032003年年年年4 4 4 4月月月月14141414日宣布人日宣布人日宣布人日宣布人类类类类基因基因基因基因组组组组序列序列序列序列图图图图完成，完成，完成，完成，这标这标这标这标志着志着志着志着进进进进入了后基因入了后基因入了后基因入了后基因组组组组和蛋白和蛋白和蛋白和蛋白质组时质组时质组时质组时代代代代人人人人类类类类基因基因基因基因组组组组：指指指指DNADNADNADNA分子所携分子所携分子所携分子所携带带带带的全部的全部的全部的全部遗传遗传遗传遗传信息信息信息信息 蛋白蛋白蛋白蛋白质组质组质组质组：生物个体表达的蛋白生物个体表达的蛋白生物个体表达的蛋白生物个体表达的蛋白质质质质分子的分子的分子的分子的总总总总和。主和。主和。主和。主要是要是要是要是对对对对蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质功能的研究功能的研究功能的研究功能的研究3精选课件血血血血液液液液血血血血浆浆浆浆水水水水 分分分分固体物固体物固体物固体物质质质质：血血血血浆浆浆浆蛋白、蛋白、蛋白、蛋白、无机无机无机无机盐盐盐盐、磷脂、葡萄糖等、磷脂、葡萄糖等、磷脂、葡萄糖等、磷脂、葡萄糖等血血血血细细细细 胞胞胞胞白白白白细细细细胞胞胞胞血小板血小板血小板血小板红细红细红细红细胞胞胞胞（最多）（最多）（最多）（最多）血血血血红红红红蛋白蛋白蛋白蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一一一一肽链肽链肽链肽链四个四个四个四个亚铁红亚铁红亚铁红亚铁红素基素基素基素基团团团团2.2.提提提提问问问问：血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.1.1.提提提提问问问问：用用用用鸡鸡鸡鸡的的的的红细红细红细红细胞提取胞提取胞提取胞提取DNADNADNADNA，用人的，用人的，用人的，用人的红细红细红细红细胞胞胞胞提取血提取血提取血提取血红红红红蛋白的原因是什么？蛋白的原因是什么？蛋白的原因是什么？蛋白的原因是什么？鸡鸡鸡鸡的的的的红细红细红细红细胞具有胞具有胞具有胞具有细细细细胞核，含有胞核，含有胞核，含有胞核，含有DNADNADNADNA，便于，便于，便于，便于进进进进行行行行DNADNADNADNA的提取；人的的提取；人的的提取；人的的提取；人的红细红细红细红细胞无胞无胞无胞无细细细细胞核，胞核，胞核，胞核，结结结结构构构构简单简单简单简单，血，血，血，血红红红红蛋白含量丰富，便于提取血蛋白含量丰富，便于提取血蛋白含量丰富，便于提取血蛋白含量丰富，便于提取血红红红红蛋白。蛋白。蛋白。蛋白。血血血血红红红红蛋白蛋白蛋白蛋白4精选课件血血血血红红红红蛋白蛋白蛋白蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一一一一肽链肽链肽链肽链四个四个四个四个亚铁红亚铁红亚铁红亚铁红素基素基素基素基团团团团每个每个肽链环绕肽链环绕一个一个亚铁亚铁血血红红素基素基团团，此基此基团团可携可携带带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血血红红蛋白因含有蛋白因含有血血红红素素而而呈呈红红色。色。血血血血红红红红蛋白的特点：蛋白的特点：蛋白的特点：蛋白的特点：5精选课件1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选选用一定的用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物的方法分离具有不同物理或化学性理或化学性质质的的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白蛋白质质分离和提取的原理：分离和提取的原理：根据蛋白根据蛋白质质各种特性各种特性的差异，如的差异，如分子的形状和分子的形状和大小、所大小、所带电带电荷的性荷的性质质和多少、溶解度、吸附性和多少、溶解度、吸附性质质和和对对其他分子的其他分子的亲亲和力和力等等，可以用来分离等等，可以用来分离不同种不同种类类的蛋白的蛋白质质。一、血一、血红红蛋白的提取和分离蛋白的提取和分离3.3.高温高温灭灭菌和酒精菌和酒精灭灭菌的菌的结结果：果：使微生物的使微生物的蛋白蛋白质发质发生生变变性性、蛋白蛋白质质的的空空间结间结构构被破坏。被破坏。6精选课件（一）（一）凝胶色凝胶色谱谱法（法（分配色分配色谱谱法法）2.凝胶：大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖多糖类类化合物化合物（如（如葡聚糖或葡聚糖或琼琼脂糖脂糖）构成的）构成的多孔多孔小球体，小球体，内部有内部有许许多多贯贯穿的穿的通道通道。根据被分离物根据被分离物质质的蛋白的蛋白质质相相对对分子分子质质量量的大的大 小，利用具有小，利用具有网状网状结结构构的凝胶的的凝胶的分子分子筛筛作用，来作用，来进进行行分离。分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理分子筛效应：当相当相对对分子量不同的蛋白分子量不同的蛋白质质通通过过凝胶凝胶时时，相，相对对分分子量子量较较小的蛋白小的蛋白质质容易容易进进入凝胶内部的通道，路程入凝胶内部的通道，路程较长较长，移移动动速度速度较较慢慢;而相而相对对分子量分子量较较大的蛋白大的蛋白质质无法无法进进入凝入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移胶内部的通道，只能在凝胶外部移动动，路程，路程较较短，移短，移动动速度速度较较快。快。相相对对分子分子质质量不同的蛋白量不同的蛋白质质分子因此得以分分子因此得以分离。离。依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质分子量的大小。分子量的大小。分子量的大小。分子量的大小。7精选课件4.4.凝胶色谱法分离蛋白分离蛋白质质的原理和具体具体过过程程8精选课件 （二）（二）缓缓冲溶液冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范在一定的范围围内，凡是能内，凡是能够够抵制抵制外加少量外加少量强强酸或酸或强强碱碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值值基本保持基本保持不不变变的混的混合溶液。合溶液。能能够够抵制抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对对溶液溶液PHPH值值的影响，的影响，维维持持PHPH基本不基本不变变。2.2.作用作用:3.3.缓缓冲溶液的配制冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种种缓缓冲冲剂剂溶解于水溶解于水中配制而成。中配制而成。调节缓调节缓冲冲剂剂的的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不同同PHPH范范围围内内使用的使用的缓缓冲液。冲液。4.4.4.4.提提提提问问问问：在本：在本：在本：在本课题课题课题课题中使用的中使用的中使用的中使用的缓缓缓缓冲液是冲液是冲液是冲液是:_:_:_:_,其目的是其目的是其目的是其目的是:利用利用缓缓冲液模冲液模拟细拟细胞内的胞内的PHPH环环境，保境，保证证 血血红红蛋白的正常蛋白的正常结结构和功能，便于构和功能，便于观观察察(红红红红色色色色)和科和科 学研究学研究(活性活性活性活性)磷酸磷酸缓缓冲液冲液9精选课件 缓缓冲溶液的冲溶液的组组成及分成及分类类弱酸及其弱酸及其对应对应的的盐盐：弱碱及其弱碱及其对应对应的的盐盐：多元弱酸的酸式多元弱酸的酸式盐盐及其及其对应对应的次的次级盐级盐:H H H H2 2 2 2COCOCOCO3 3 3 3NaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3；CHCHCHCH3 3 3 3COOHCHCOOHCHCOOHCHCOOHCH3 3 3 3COONaCOONaCOONaCOONaNHNHNHNH3 3 3 3HHHH2 2 2 2ONHONHONHONH4 4 4 4CL;NHCL;NHCL;NHCL;NH4 4 4 4OHNHOHNHOHNHOHNH4 4 4 4CLCLCLCLNaHCONaHCONaHCONaHCO3 3 3 3NaNaNaNa2 2 2 2COCOCOCO3 3 3 3 ；NaHNaHNaHNaH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4NaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 4 缓缓冲溶液由足冲溶液由足够浓够浓度的共度的共轭轭酸碱酸碱对组对组成。其中，成。其中，能能对对抗外来抗外来强强碱的称碱的称为为共共轭轭酸酸；能；能对对抗外来抗外来强强酸的称酸的称为为共共轭轭碱碱。这这一共一共轭轭酸碱通常称酸碱通常称为为缓缓冲冲对对、缓缓冲冲剂剂或或缓缓冲系冲系。常常见见的的缓缓冲冲对对主要有如下主要有如下三种三种类类型：型：10精选课件 （三）（三）电电泳：泳：1.1.概念：概念：带电带电粒子在粒子在电场电场作用下作用下发发生迁移的生迁移的过过程。程。2.2.原理：原理：许许多重要的生物大分子，如多多重要的生物大分子，如多肽肽、核酸等都具有可解离的基核酸等都具有可解离的基团团，在一定的，在一定的PHPH下，下，这这些基些基团团会会带带上正上正电电或或负电负电。在在电场电场的作用下，的作用下，这这些些带电带电分子会向着与其所分子会向着与其所带电带电荷相反的荷相反的电电极移极移动动。电电泳利用了待分离泳利用了待分离样样品中各种分子品中各种分子带电带电性性质质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电带电分子分子产产生不同的迁移速度，从而生不同的迁移速度，从而实现样实现样品中品中各种分子的分离各种分子的分离。3.3.类类型型:琼琼脂糖脂糖凝胶凝胶电电泳、泳、聚丙稀聚丙稀酰酰胺胺凝胶凝胶电电泳。泳。11精选课件 在在在在电场电场电场电场的作用下，的作用下，的作用下，的作用下，这这这这些些些些带电带电带电带电分子会向分子会向分子会向分子会向着与其所着与其所着与其所着与其所带电带电带电带电荷相反的荷相反的荷相反的荷相反的电电电电极移极移极移极移动动动动琼琼琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶电电电电泳示意泳示意泳示意泳示意图图图图12精选课件 聚丙稀聚丙稀酰酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳 1 1、在、在测测定蛋白定蛋白质质分子量分子量时时常用常用十二十二烷烷基硫酸基硫酸钠钠（SDSSDS）聚丙稀聚丙稀酰酰胺凝胶胺凝胶电电泳。泳。聚丙稀聚丙稀酰酰胺凝胺凝胶是由胶是由单单体丙体丙烯酰烯酰胺和交胺和交联剂联剂N,N-N,N-甲叉双丙甲叉双丙烯酰烯酰胺在胺在引引发剂发剂和和催化催化剂剂的作用下聚合交的作用下聚合交联联成的具有成的具有三三维维网状网状结结构的凝胶。构的凝胶。13精选课件 蛋白蛋白质质在聚丙在聚丙烯酰烯酰胺凝胶中的胺凝胶中的迁移率迁移率取决取决于它所于它所带带净电净电荷荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。（SDSSDSSDSSDS的作用）的作用）的作用）的作用）为为了消除了消除净电净电荷荷对对迁移率的影响，迁移率的影响，可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。2.2.原理：原理：聚丙稀聚丙稀酰酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳 SDSSDSSDSSDS能使蛋白能使蛋白能使蛋白能使蛋白质发质发质发质发生完全生完全生完全生完全变变变变性性性性。由几条。由几条肽链组肽链组成成的的蛋白蛋白质质复合体复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成解聚成解聚成解聚成单单单单条条条条肽链肽链肽链肽链，因此因此测测定的定的结结果只是果只是单单单单条条条条肽链肽链肽链肽链的分子量的分子量的分子量的分子量。SDSSDS能与各能与各种蛋白种蛋白质质形成形成蛋白蛋白蛋白蛋白质质质质SDSSDSSDSSDS复合物复合物复合物复合物，SDSSDS所所带负电带负电荷荷的量大大超的量大大超过过了蛋白了蛋白质质分子分子原有原有原有原有电电电电荷量荷量荷量荷量。因而掩盖。因而掩盖了了不同种蛋白不同种蛋白不同种蛋白不同种蛋白质间质间质间质间的的的的电电电电荷差荷差荷差荷差别别别别，使，使电电泳迁移率完全泳迁移率完全取决于分子的大小。取决于分子的大小。3.SDS3.SDS作用机理作用机理:14精选课件用用SDSSDS测测定蛋白定蛋白质质分子量的方法分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳测测定定蛋白蛋白质质的分子量的分子量时时，可，可选选用一用一组组已知分子已知分子量的量的标标准蛋白准蛋白同同时进时进行行电电泳，根据已知分泳，根据已知分子量的子量的标标准蛋白的准蛋白的电电泳区泳区带带位置位置，用，用电电泳泳迁移率和分子量的迁移率和分子量的对对数作数作标标准曲准曲线线，可以，可以测测定定未知蛋白未知蛋白质质的分子量。的分子量。市市场场上有高分上有高分子量、次高分子量及低分子量的子量、次高分子量及低分子量的标标准蛋白准蛋白试剂试剂出售。出售。15精选课件 二、二、实验实验操作操作样样品品处处理理粗分离粗分离纯纯化化纯纯度度鉴鉴定定1.1.1.1.样样样样品品品品处处处处理：理：理：理：（一）蛋白（一）蛋白质质提取和分离步提取和分离步骤骤（二）操作（二）操作过过程程 本本课题课题可可选选用猪、牛、羊或其他脊椎用猪、牛、羊或其他脊椎 动动物的血液来分离血物的血液来分离血红红蛋白。蛋白。(1)(1)(1)(1)红细红细红细红细胞的洗胞的洗胞的洗胞的洗涤涤涤涤:洗洗洗洗涤涤涤涤目的目的目的目的:去除去除杂杂蛋白，以利于后蛋白，以利于后续续血血红红蛋白的蛋白的分离分离纯纯化，洗化，洗涤涤次数不可次数不可过过少。少。洗洗洗洗涤涤涤涤操作：操作：操作：操作：1 1、采集血、采集血样样。2 2、低速短、低速短时间时间离心离心（速度越高和（速度越高和时间时间越越长长，会使白，会使白细细胞和淋巴胞和淋巴细细胞等一胞等一同沉淀，达不到分离的效果）同沉淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血、吸取血浆浆：上：上层层透透明的黄色血明的黄色血浆浆。4 4、盐盐水洗水洗涤涤：用五倍体：用五倍体积积的的质质量分量分数数为为0.90.9的的氯氯化化钠钠溶液洗溶液洗涤涤。5 5、低速离心、低速离心（低速短（低速短时间时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步步骤骤三次，直至上清液中已没有三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗黄色，表明洗涤涤干干净净。16精选课件(2)(2)(2)(2)血血血血红红红红蛋白的蛋白的蛋白的蛋白的释释释释放：放：放：放：加蒸加蒸馏馏水到水到原血液体原血液体积积，再加，再加4040体体积积的的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力磁力搅搅拌器拌器上充分上充分搅搅拌拌1010分分钟钟（加速加速细细胞破裂胞破裂）,细细胞破裂胞破裂释释放出血放出血红红蛋白。蛋白。(3)(3)(3)(3)分离血分离血分离血分离血红红红红蛋白溶液：蛋白溶液：蛋白溶液：蛋白溶液：过过过过程：程：程：程：将将搅搅拌好混合液拌好混合液转转移到离移到离心管内，以心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 10 minmin。试试试试管中溶液管中溶液管中溶液管中溶液层层层层次：次：次：次：第第1 1层层（最上（最上层层）：甲苯）：甲苯层层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层层（中上（中上层层）：脂溶性物）：脂溶性物质质沉淀沉淀层层（白色白色薄薄层层固体固体）；第）；第3 3层层（中下（中下层层）：血）：血红红蛋白的水溶液蛋白的水溶液层层（红红色透明液体色透明液体）；第）；第4 4层层（最下（最下层层）：）：杂质杂质沉淀沉淀层层（暗暗红红色色）。）。分离：分离：分离：分离：用用滤纸过滤滤纸过滤，除去脂溶性沉淀，除去脂溶性沉淀层层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层层的的红红色透明液体色透明液体。二、二、实验实验操作操作17精选课件甲苯甲苯甲苯甲苯层层层层（无色透明无色透明无色透明无色透明）白色薄白色薄白色薄白色薄层层层层固体固体固体固体红红红红色透明液体色透明液体色透明液体色透明液体杂质杂质杂质杂质沉淀沉淀沉淀沉淀层层层层（暗暗暗暗红红红红色色色色）试试管中溶液管中溶液层层次次18精选课件(4)(4)(4)(4)透析：透析：透析：透析：过过过过程：程：程：程：取取1ml1ml的血的血红红蛋白溶液装蛋白溶液装入透析袋中，将透入透析袋中，将透析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物的物质质的量的量浓浓度度为为20mmol/l20mmol/l的的磷酸磷酸缓缓冲液冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小小时时。透析目的：透析目的：透析目的：透析目的：除去除去样样品中分子量品中分子量较较小的小的杂质杂质。二、二、实验实验操作操作19精选课件2.2.凝胶色凝胶色谱谱操作操作:（1 1 1 1）凝胶色）凝胶色）凝胶色）凝胶色谱谱谱谱柱的制作：柱的制作：柱的制作：柱的制作：取取长长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂两端需用砂纸纸磨磨平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管安装移液管头头部部覆盖覆盖尼尼龙龙网，再用网，再用100100目尼目尼龙纱龙纱包好，插到玻璃管的包好，插到玻璃管的一一端端。注意事注意事注意事注意事项项项项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否否则难则难以以铺实铺实尼尼龙龙网，网，还还会会导导致液体残留，蛋白致液体残留，蛋白质质分离不分离不彻彻底。底。顶顶塞的制作：塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组组装：装：将上述三者按相将上述三者按相应应位置位置组组装成一个整体装成一个整体。安装其他附属安装其他附属结结构。构。20精选课件 （2 2）凝胶色）凝胶色谱谱柱的装填柱的装填 凝胶的凝胶的凝胶的凝胶的选择选择选择选择：A A、材料：、材料：交交联联葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G-G-7575）。）。B B、代表意、代表意义义：“G”“G”表示凝胶的交表示凝胶的交联联程度，膨程度，膨胀胀程度及分离范程度及分离范围围。7575表示凝胶的得水表示凝胶的得水值值，即每克凝，即每克凝胶膨胶膨胀时胀时吸水吸水7.57.5克。克。凝胶的前凝胶的前凝胶的前凝胶的前处处处处理：理：理：理：配置凝胶配置凝胶悬悬浮液：浮液：计计算并称算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸取一定量的凝胶浸泡于蒸馏馏水或洗脱液中充分溶水或洗脱液中充分溶胀胀后，后，配成凝胶配成凝胶悬悬浮液。浮液。凝胶色凝胶色凝胶色凝胶色谱谱谱谱柱的装填方法：柱的装填方法：柱的装填方法：柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色将色谱谱柱柱装置固定在支架上。装置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶将凝胶悬悬浮液一次性浮液一次性的装填入色的装填入色谱谱柱内，装填柱内，装填时轻轻时轻轻敲敲动动色色谱谱柱，使凝胶柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填、凝胶装填时时尽量尽量紧紧密，以降低密，以降低凝胶凝胶颗颗粒之粒之间间的空隙。的空隙。2 2、装填凝胶柱、装填凝胶柱时时不得有气泡不得有气泡存在：存在：因因为为气泡会气泡会搅搅乱洗脱液中蛋白乱洗脱液中蛋白质质的洗脱次序，的洗脱次序，降低分离效果降低分离效果。21精选课件 洗洗洗洗涤涤涤涤平衡：平衡：平衡：平衡：装填完装填完毕毕后，后，立即用立即用缓缓冲液洗脱瓶，在冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作高的操作压压下，用下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸磷酸缓缓冲液（冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗充分洗涤涤平衡平衡1212小小时时。注意：注意：注意：注意：1 1、液面不要低于凝胶、液面不要低于凝胶表面，否表面，否则则可能有气泡混入，可能有气泡混入，影响液体在柱内的流影响液体在柱内的流动动与最与最终终生物大分子物生物大分子物质质的分离效果。的分离效果。2 2、不能、不能发发生洗脱液流干，露生洗脱液流干，露出凝胶出凝胶颗颗粒的粒的现现象象。（2 2）凝胶色）凝胶色谱谱柱的装填柱的装填50cm50cm50cm50cm高高高高22精选课件（3 3）样样品加入与洗脱品加入与洗脱 调节缓调节缓调节缓调节缓冲液面：冲液面：冲液面：冲液面：打开下端出口，使柱内打开下端出口，使柱内缓缓冲液冲液缓缓慢下降慢下降到与凝胶面平到与凝胶面平齐齐，关，关闭闭出口。出口。滴加透析滴加透析滴加透析滴加透析样样样样品：品：品：品：吸管吸吸管吸1ml1ml样样品加到色品加到色谱谱柱的柱的顶顶端，滴加端，滴加样样品品时时，吸管管口，吸管管口贴贴着管壁着管壁环绕环绕移移动动加加样样，同，同时时注意不要破坏注意不要破坏凝胶面。凝胶面。样样样样品渗入凝胶床：品渗入凝胶床：品渗入凝胶床：品渗入凝胶床：加加样样后打开下端出口，使后打开下端出口，使样样品渗入凝品渗入凝胶床内，等胶床内，等样样品完全品完全进进入凝胶入凝胶层层后，关后，关闭闭下端出口。下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸的磷酸缓缓冲液到适当冲液到适当高度，高度，连连接接缓缓冲液洗脱瓶，打开下端出口冲液洗脱瓶，打开下端出口进进行洗脱。行洗脱。收集：收集：收集：收集：待待红红色的蛋白色的蛋白质质接近色接近色谱谱柱底端柱底端时时，用，用试试管收集管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一收集一试试管，管，连续连续收集。收集。（在分离（在分离过过程中，如程中，如果果红红色区色区带带均匀一致的移均匀一致的移动动，说说明色明色谱谱柱制作成功）柱制作成功）注意：注意：注意：注意：正确的加正确的加样样操作：操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴贴壁加壁加样样。3 3、使吸管管口沿管壁、使吸管管口沿管壁环绕环绕移移动动。23精选课件（3 3）样样品加入与洗脱品加入与洗脱注意：注意：注意：注意：正确的加正确的加样样操作是：操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴贴壁加壁加样样。3 3、使吸管管口沿管壁、使吸管管口沿管壁环绕环绕移移动动。24精选课件思考下面的思考下面的问题问题：让让血血红红蛋白蛋白处处在在稳稳定的定的pHpH范范围围内，内，维维持持结结构和功能。构和功能。1 1 1 1、在血、在血、在血、在血红红红红蛋白的整个蛋白的整个蛋白的整个蛋白的整个过过过过程中不断用磷酸程中不断用磷酸程中不断用磷酸程中不断用磷酸缓缓缓缓冲液冲液冲液冲液处处处处理的理的理的理的目的是什么？目的是什么？目的是什么？目的是什么？2 2 2 2、与其他真核、与其他真核、与其他真核、与其他真核细细细细胞相比，胞相比，胞相比，胞相比，红细红细红细红细胞有什么特点？胞有什么特点？胞有什么特点？胞有什么特点？这这这这一特一特一特一特点点点点对对对对你你你你进进进进行蛋白行蛋白行蛋白行蛋白质质质质得分离有什么意得分离有什么意得分离有什么意得分离有什么意义义义义？血血红红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱谱分离分离时时可以通可以通过观过观察察颜颜色来判断什么色来判断什么时时候候应该应该收集洗脱液。收集洗脱液。这这使血使血红红蛋白的分离蛋白的分离过过程程非常直非常直观观，大大，大大简简化了化了实验实验操作。操作。3 3 3 3、你能描述血、你能描述血、你能描述血、你能描述血红红红红蛋白分离的完整蛋白分离的完整蛋白分离的完整蛋白分离的完整过过过过程程程程吗吗吗吗？血血红红蛋白提取和分离的程序可分蛋白提取和分离的程序可分为为四大步，包括：四大步，包括：样样样样品品品品处处处处理、粗分离、理、粗分离、理、粗分离、理、粗分离、纯纯纯纯化和化和化和化和纯纯纯纯度度度度鉴鉴鉴鉴定定定定。首先通。首先通过过洗洗涤红细涤红细胞、血胞、血红红蛋蛋白的白的释释放、离心等操作收集到放、离心等操作收集到血血红红蛋白溶液蛋白溶液，即，即:样样品的品的处处理；理；再再经过经过透析去除分子量透析去除分子量较较小的小的杂质杂质，即，即样样品的粗分离；然后品的粗分离；然后通通通通过过过过凝胶色凝胶色凝胶色凝胶色谱谱谱谱法法法法将相将相对对分子分子质质量量较较大的大的杂质杂质蛋白除去蛋白除去，即，即:样样品品的的纯纯化；最后化；最后经经聚丙聚丙聚丙聚丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶电电电电泳泳泳泳进进行行纯纯度度鉴鉴定。定。25精选课件（三）（三）SDSSDS聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳2.2.2.2.试剂试剂试剂试剂的配制：的配制：的配制：的配制：鉴鉴定血定血红红蛋白蛋白纯纯度。度。1.1.1.1.目的：目的：目的：目的：丙丙丙丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺和胺和胺和胺和N,N-N,N-N,N-N,N-甲叉双丙甲叉双丙甲叉双丙甲叉双丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺胺胺胺:用去离子水配制用去离子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙，下同）的丙烯酰烯酰胺和胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙甲叉双丙烯酰烯酰胺的胺的贮贮存液。存液。十二十二十二十二烷烷烷烷基硫酸基硫酸基硫酸基硫酸钠钠钠钠（SDSSDSSDSSDS）:用去离子水配用去离子水配成成10%10%的的贮贮存液，于室温保存。存液，于室温保存。用于制用于制用于制用于制备备备备分离胶和分离胶和分离胶和分离胶和浓缩浓缩浓缩浓缩胶的胶的胶的胶的TrisTrisTrisTris缓缓缓缓冲液。冲液。冲液。冲液。TEMED TEMED TEMED TEMED：作用通作用通过过催化催化过过硫酸硫酸铵铵形成自由基形成自由基而加速丙而加速丙烯酰烯酰胺与双丙胺与双丙烯酰烯酰胺的聚合。胺的聚合。用去离子水配制用去离子水配制用去离子水配制用去离子水配制10%10%10%10%过过过过硫酸硫酸硫酸硫酸铵铵铵铵：作用是提供作用是提供驱动驱动丙丙烯酰烯酰胺和双丙胺和双丙烯酰烯酰胺聚合所必胺聚合所必需的自由基。此溶液需的自由基。此溶液须须配制新配制新鲜鲜液。液。TrisTrisTrisTris甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸电电电电泳泳泳泳缓缓缓缓冲液：冲液：冲液：冲液：25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸(pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样样样样品品品品处处处处理液：理液：理液：理液：50 mmol/L TrisHCl(pH 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯巯基基苏苏糖醇糖醇)或用或用5%5%的的巯巯基乙醇，基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚的溴酚蓝蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液：染色液：染色液：染色液：0.1%0.1%的考的考马马斯亮斯亮蓝蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。脱色液：脱色液：脱色液：脱色液：10%10%的的甲醇和甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。26精选课件 1 1、由于制、由于制备备凝胶的丙凝胶的丙烯酰烯酰胺和双丙胺和双丙烯酰烯酰胺胺具有很具有很强强的神的神经经毒性，并且容易被皮肤吸收，毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必因此操作必须须在通在通风风橱内或通橱内或通风处进风处进行。行。2 2、TEMEDTEMED和和过过硫酸胺硫酸胺对对黏膜和上呼吸道黏膜和上呼吸道组组织织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。致命。3 3、在、在进进行行电电泳操作泳操作时时一定按照一定按照实验实验要求和要求和步步骤骤完成。操作完成。操作时时要戴好一次性手套。要戴好一次性手套。注意事注意事项项：（三）（三）SDSSDS聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳27精选课件 SDS-SDS-SDS-SDS-聚丙聚丙聚丙聚丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺分离胶制胺分离胶制胺分离胶制胺分离胶制备备备备：用去离子水用去离子水用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL4.6 mL4.6 mL，30%30%30%30%的的的的丙丙丙丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺胺胺胺2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8pH 8.8pH 8.8的的的的TrisTrisTrisTris缓缓缓缓冲液冲液冲液冲液2.5 mL2.5 mL2.5 mL2.5 mL，10%10%10%10%的的的的SDS 0.1 mLSDS 0.1 mLSDS 0.1 mLSDS 0.1 mL，10%10%10%10%的的的的过过过过硫酸胺硫酸胺硫酸胺硫酸胺0.1 mL0.1 mL0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，混合均匀，混合均匀，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的迅速灌注在两玻璃板的迅速灌注在两玻璃板的迅速灌注在两玻璃板的间间间间隙中隙中隙中隙中间间间间，要留出灌注，要留出灌注，要留出灌注，要留出灌注浓缩浓缩浓缩浓缩胶所需空胶所需空胶所需空胶所需空间间间间(梳子的梳子的梳子的梳子的齿长齿长齿长齿长再加再加再加再加0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一，再在胶液面上小心注入一，再在胶液面上小心注入一，再在胶液面上小心注入一层层层层水（水（水（水（约约约约高高高高23 mm23 mm23 mm23 mm），以阻止氧气），以阻止氧气），以阻止氧气），以阻止氧气进进进进入凝胶溶液。入凝胶溶液。入凝胶溶液。入凝胶溶液。分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后分离胶聚合完全后（约约约约30 min30 min30 min30 min），），），），倾倾倾倾出覆盖水出覆盖水出覆盖水出覆盖水层层层层，再用，再用，再用，再用滤纸滤纸滤纸滤纸吸吸吸吸净净净净残留水。残留水。残留水。残留水。配制配制配制配制SDSSDSSDSSDS聚丙聚丙聚丙聚丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶胺凝胶胺凝胶电电电电泳泳泳泳浓缩浓缩浓缩浓缩胶溶液用去离子水胶溶液用去离子水胶溶液用去离子水胶溶液用去离子水2.7 mL2.7 mL2.7 mL2.7 mL，30%30%30%30%的的的的丙丙丙丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺胺胺胺0.67 mL0.67 mL0.67 mL0.67 mL，1.0 mol1.0 mol1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8pH 6.8pH 6.8的的的的TrisTrisTrisTris缓缓缓缓冲液冲液冲液冲液0.5 mL0.5 mL0.5 mL0.5 mL，10%10%10%10%的的的的SDS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%10%10%的的的的过过过过硫酸胺硫酸胺硫酸胺硫酸胺0.04 mL0.04 mL0.04 mL0.04 mL，TEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mL，混，混，混，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩浓缩浓缩浓缩胶溶液中插胶溶液中插胶溶液中插胶溶液中插入干入干入干入干净净净净的梳子。的梳子。的梳子。的梳子。整个操作整个操作整个操作整个操作过过过过程程程程应应应应注意避免气泡的注意避免气泡的注意避免气泡的注意避免气泡的产产产产生。然后再生。然后再生。然后再生。然后再补补补补加加加加浓缩浓缩浓缩浓缩胶溶液，使其充胶溶液，使其充胶溶液，使其充胶溶液，使其充满满满满梳子之梳子之梳子之梳子之间间间间的空隙，将凝胶垂直放置于室的空隙，将凝胶垂直放置于室的空隙，将凝胶垂直放置于室的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。温下聚合。温下聚合。温下聚合。（1 1 1 1）根据厂家）根据厂家）根据厂家）根据厂家说说说说明明明明书书书书安装安装安装安装电电电电泳用的玻璃板泳用的玻璃板泳用的玻璃板泳用的玻璃板（2 2 2 2）SDSSDSSDSSDS聚丙聚丙聚丙聚丙烯酰烯酰烯酰烯酰胺凝胶制胺凝胶制胺凝胶制胺凝胶制备备备备：3 3、电电泳方法步泳方法步骤骤28精选课件（3 3 3 3）样样样样品品品品处处处处理：理：理：理：在在电电泳泳样样品中按品中按1111体体积积比加入比加入样样品品处处理液，在理液，在100 100 温度下加温度下加热热3 min3 min，以使蛋白，以使蛋白质变质变性。性。（4 4 4 4）浓缩浓缩浓缩浓缩胶聚合完全胶聚合完全胶聚合完全胶聚合完全后（后（后（后（30 min30 min30 min30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于），小心移出梳子。把凝胶固定于），小心移出梳子。把凝胶固定于），小心移出梳子。把凝胶固定于电电电电泳装置上，上下槽泳装置上，上下槽泳装置上，上下槽泳装置上，上下槽各加入各加入各加入各加入TrisTrisTrisTris甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸电电电电泳泳泳泳缓缓缓缓冲液。必冲液。必冲液。必冲液。必须设须设须设须设法排出凝胶底部两玻璃板法排出凝胶底部两玻璃板法排出凝胶底部两玻璃板法排出凝胶底部两玻璃板之之之之间间间间的气泡。的气泡。的气泡。的气泡。（5 5 5 5）加）加）加）加样样样样：按按顺顺序加序加样样，加，加样样量通常量通常为为1025 L1025 L。样样品可以多加几个，例如，血品可以多加几个，例如，血浆样浆样品品红细红细胞破碎后胞破碎后(即即进进行凝胶色行凝胶色谱谱分离之前分离之前)的的样样品和凝胶色品和凝胶色谱谱分离之后的分离之后的样样品品（6 6 6 6）电电电电泳：泳：泳：泳：将将电电泳泳装置与装置与电电源相接，凝胶上所加源相接，凝胶上所加电压为电压为8 V/cm8 V/cm。当染料前沿。当染料前沿进进入分离入分离胶后，把胶后，把电压电压提高到提高到15 V/cm15 V/cm，继续电继续电泳直至溴酚泳直至溴酚蓝蓝到达分离胶底到达分离胶底部上方部上方约约1 cm1 cm处处，关，关闭电闭电源。源。（7 7 7 7）剥胶：）剥胶：）剥胶：）剥胶：从从电电泳装置上卸下玻璃泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将板，用刮刀撬开玻璃板。将紧紧靠最左靠最左边边一孔（第一槽）凝胶下部切一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以去一角，以标标注凝胶的方位。注凝胶的方位。（8 8 8 8）染色：）染色：）染色：）染色：将将电电泳凝胶片放在考泳凝胶片放在考马马斯亮斯亮蓝蓝染色液中染色染色液中染色1-2 h1-2 h。（9 9 9 9）脱色：）脱色：）脱色：）脱色：染色完染色完毕毕，倾倾出染色液出染色液,换换脱色液脱色脱色液脱色3-10 h3-10 h，其，其间间需多次更需多次更换换脱色液至背景清楚。脱色液至背景清楚。（10101010）观观观观察察察察结结结结果：果：果：果：SDSSDS电电泳的成功关泳的成功关键键之一是之一是电电泳泳过过程中，待程中，待别别是是样样品制品制备过备过程中蛋白程中蛋白质质与与SDSSDS的的结结合程度。合程度。3 3、电电泳方法步泳方法步骤骤29精选课件 观观察你察你处处理的血液理的血液样样品离心后品离心后是否分是否分层层（见见教科教科书图书图5-5-1818），），如果分如果分层层不明不明显显，可能是洗，可能是洗涤涤次数少、未能除去血次数少、未能除去血浆浆蛋蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度此外，离心速度过过高和高和时间过长时间过长，会使白，会使白细细胞和淋胞和淋巴巴细细胞一同沉淀，也得不到胞一同沉淀，也得不到纯净纯净的的红细红细胞，影响后胞，影响后续续血血红红蛋白蛋白的提取的提取纯纯度。度。三、三、实验结实验结果分析与果分析与评评价价 1 1、你是否完成了、你是否完成了对对血液血液样样品的品的处处理？你能描述理？你能描述处处理后的理后的样样品品发发生了哪些生了哪些变变化化吗吗？2 2、你装填的凝胶色、你装填的凝胶色谱谱柱是否有气泡柱是否有气泡产产生？你的色生？你的色谱谱柱装填得成功柱装填得成功吗吗？你是如何判断的？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介由于凝胶是一种半透明的介质质，因此可以在凝胶柱旁放一支，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，与凝胶柱垂直的日光灯，检查检查凝胶是否装填得均匀。此外，凝胶是否装填得均匀。此外，还还可可以加入大分子的有色物以加入大分子的有色物质质，例如例如蓝蓝色葡聚糖色葡聚糖20002000或或红红色葡聚糖，色葡聚糖，观观察色察色带带移移动动的情况。如果色的情况。如果色带带均匀、狭窄、平整，均匀、狭窄、平整，说说明凝胶色明凝胶色谱谱柱的性能良好。柱的性能良好。如果色如果色谱谱柱出柱出现纹现纹路或是气泡，路或是气泡，轻轻轻轻敲打柱体敲打柱体以消除气泡，消除不了以消除气泡，消除不了时时要重新装柱。要重新装柱。30精选课件 如果凝胶色如果凝胶色谱谱柱装填得很成功、分离操作也正确的柱装填得很成功、分离操作也正确的话话，能清楚地看到血，能清楚地看到血红红蛋白的蛋白的红红色区色区带带均匀、狭窄、平整，随均匀、狭窄、平整，随着洗脱液着洗脱液缓缓慢流出；慢流出；如果如果红红色区色区带带歪曲、散乱、歪曲、散乱、变宽变宽，说说明分明分离的效果不好，离的效果不好，这这与凝胶色与凝胶色谱谱柱的装填有关。柱的装填有关。3 3 3 3、你能、你能、你能、你能观观观观察到蛋白察到蛋白察到蛋白察到蛋白质质质质的分离的分离的分离的分离过过过过程中，程中，程中，程中，红红红红色区色区色区色区带带带带的的的的移移移移动吗动吗动吗动吗？请请请请描述描述描述描述红红红红色区色区色区色区带带带带的移的移的移的移动动动动情况，并据此判断分离情况，并据此判断分离情况，并据此判断分离情况，并据此判断分离效果？效果？效果？效果？三、三、实验结实验结果分析与果分析与评评价价本本本本课题课题课题课题作作作作业业业业;1.1.凝胶色凝胶色谱谱法分离蛋白法分离蛋白质质的的原理是怎的的原理是怎样样的的?2.2.什么是什么是缓缓冲溶液冲溶液?它的作用是什么它的作用是什么?3.3.电电泳的作用及其原理是什么泳的作用及其原理是什么?4.4.你能描述血你能描述血红红蛋白分离的完整蛋白分离的完整过过程程吗吗?5.5.与其他真核与其他真核细细胞相比胞相比,红细红细胞有什么特点胞有什么特点?这这一特点一特点对对你你进进行行蛋白蛋白质质的分离有什么意的分离有什么意义义?31精选课件32精选课件