反应速度为最大值的一半时的底物浓度课件

第八章第八章 酶通论酶通论第八章 酶通论1酶酶enzyme生命体内催化化学反应的物质：新陈代谢是生命的基础，构成生命代谢的物质和能量的变化，都是在酶的催化下进行生命的活动伴随着酶的存在而进行。希腊语原意希腊语原意:in yeast*细胞中大部分球蛋白为酶细胞中大部分球蛋白为酶酶 enzyme生命体内催化化学反应的物质：2八千年以前八千年以前 我国人民在开始利用酶我国人民在开始利用酶 公元前公元前2121世纪夏禹时代世纪夏禹时代 人们会酿酒人们会酿酒18141814公元前公元前1212世纪周代世纪周代 已能制作饴糖和酱已能制作饴糖和酱20002000多年前春秋战国时期多年前春秋战国时期 用曲治疗消化不良疾病用曲治疗消化不良疾病18101810年年 Jaseph Gaylussac Jaseph Gaylussac 发现酵母可将糖转化为发现酵母可将糖转化为 酒精酒精18331833年年 Payen&Persoz Payen&Persoz 从麦芽抽提液得到了从麦芽抽提液得到了 ferment ferment（酵素）（酵素）,可使淀粉水解成可溶可使淀粉水解成可溶 性糖，称之为性糖，称之为diastase diastase【即现在的【即现在的amylaseamylase】1835-18371835-1837年年 BerzeliusBerzelius提出催化作用的概念提出催化作用的概念 fermentferment起的是催化作用起的是催化作用酶学研究史酶学研究史(1)(1)八千年以前 我国人民在开始利用酶 酶学研究史(1)31857185718571857年年 Pasteur Pasteur认为发酵酒精发酵是酵母细胞活动的结果认为发酵酒精发酵是酵母细胞活动的结果只有活的酵母细胞才能进行发酵（而只有活的酵母细胞才能进行发酵（而LiebigLiebig认为发酵是认为发酵是由溶解于酵母细胞中的酶引起）由溶解于酵母细胞中的酶引起）18571857年年 Kuhne Kuhne给酶一个统一名字：给酶一个统一名字：EnzymeEnzyme1897189718971897年年 BuchnerBuchner兄弟制备了不含酵母细胞的抽提液，并证兄弟制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明其亦能使糖发酵，说明发酵与细胞活动无关明其亦能使糖发酵，说明发酵与细胞活动无关-发酵是发酵是酶作用的化学本质。酶作用的化学本质。(获获19101910年诺贝尔化学奖）年诺贝尔化学奖）1926192619261926年年 Sumner Sumner得到了得到了UreaseUrease的结晶，证实其蛋白质性质的结晶，证实其蛋白质性质1930-19361930-19361930-19361930-1936年年 Northrop Northrop和和KunitzKunitz证实酶是一种蛋白质证实酶是一种蛋白质 (Sumner,Northrop (Sumner,Northrop和和KunitzKunitz获获19491949年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖)80808080年代初年代初 Cech Cech和和AltamnAltamn发现了具有催化功能的发现了具有催化功能的RNARNA核酶核酶,打破了酶是蛋白质的传统概念打破了酶是蛋白质的传统概念(Cech(Cech和和AltamnAltamn获获19891989年诺年诺贝尔化学奖贝尔化学奖)1986198619861986年年 Schultz Schultz和和LernerLerner研制成抗体酶研制成抗体酶酶学研究史酶学研究史(2)(2)1857年 Pasteur认为发酵酒精发酵是酵母细胞活动的4（一）酶和一般催化剂的比较（一）酶和一般催化剂的比较具有共同性：能加快化学反应具有共同性：能加快化学反应酶本身在反应前后不发生变化酶本身在反应前后不发生变化（一）酶和一般催化剂的比较具有共同性：能加快化学反应酶5（二）酶作为生物催化剂的特点（二）酶作为生物催化剂的特点1、酶易失活、酶易失活使蛋白质等生物大分子变性因素可引使蛋白质等生物大分子变性因素可引起酶的失活起酶的失活2、酶具有高催化效率、酶具有高催化效率（以消化食物为例）（以消化食物为例）酶的转换数（酶的转换数（kcat)：表示酶的催化效率，指一定条：表示酶的催化效率，指一定条件下每秒每个酶分子转换底物的分子数，或每秒每微件下每秒每个酶分子转换底物的分子数，或每秒每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。（大多数：摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。（大多数：1104）3、酶催化反应具有高度专一性、酶催化反应具有高度专一性4、酶的活性易受调节和控制、酶的活性易受调节和控制（二）酶作为生物催化剂的特点1、酶易失活6二、酶的化学本质及组成二、酶的化学本质及组成（二）酶的化学组成（仅就蛋白酶）（二）酶的化学组成（仅就蛋白酶）（1）单纯蛋白）单纯蛋白（2）缀合蛋白：）缀合蛋白：全酶全酶=脱辅酶（酶蛋白）脱辅酶（酶蛋白）+辅因子辅因子 （一）酶的化学本质（一）酶的化学本质除具有催化活性的除具有催化活性的RNA酶，其它都是蛋白酶，其它都是蛋白质；近来有报道有质；近来有报道有DNA亦具有催化作用。亦具有催化作用。二、酶的化学本质及组成（二）酶的化学组成（仅就蛋白酶）（一）7酶的化学本质及组成酶的化学本质及组成辅基，辅基，prostheticgroup辅酶，辅酶，co-enzyme共价结合共价结合非共价结合非共价结合Cofactor辅因子辅因子酶蛋白与底物结合，决定酶催化的专一性酶蛋白与底物结合，决定酶催化的专一性辅酶在酶催化中起传递电子、原子和某些辅酶在酶催化中起传递电子、原子和某些化学基团作用化学基团作用酶的化学本质及组成辅基，prosthetic group辅8（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体根据肽链或亚基构成：根据肽链或亚基构成：1、单体酶：一条多肽链构成、单体酶：一条多肽链构成2、寡聚酶：两个或两个以上亚基组成、寡聚酶：两个或两个以上亚基组成3、多酶复合体：几种酶靠非共价键彼此、多酶复合体：几种酶靠非共价键彼此嵌合形成嵌合形成所有相关反应依次连接，有所有相关反应依次连接，有得于一系列反应的连续进行得于一系列反应的连续进行（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体根据肽链或亚基构成：9三、酶的命名及分类三、酶的命名及分类(一）习惯命名法（一）习惯命名法（19611961年以前）年以前）:1 1、根据其催化底物来命名：、根据其催化底物来命名：如淀粉酶如淀粉酶2 2、根据所催化反应的性质来命名：、根据所催化反应的性质来命名：如脱氢酶如脱氢酶3 3、结合上述两个原则来命名：、结合上述两个原则来命名：如琥珀酸脱氢酶如琥珀酸脱氢酶4 4、有时在这些命名基础上加上酶的来源或其、有时在这些命名基础上加上酶的来源或其 它特点。它特点。三、酶的命名及分类(一）习惯命名法（1961年以前）:10（二）（二）国际系统命名法国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字质，最后加一个酶字。例如：例如：习惯名称习惯名称:谷丙转氨酶谷丙转氨酶系统名称系统名称:丙氨酸：丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应酶催化的反应:谷氨酸谷氨酸+丙酮酸丙酮酸 -酮戊二酸酮戊二酸+丙氨酸丙氨酸 （二）国际系统命名法系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最11编号例如：编号例如：EC 1.2.3 EC 1.2.3 1 1：表示氧化还原酶：表示氧化还原酶ECEC（Enzyme Commision)Enzyme Commision)号的第一个数字号的第一个数字1.oxidoreductase 1.oxidoreductase 氧氧化还原酶类化还原酶类2.transferase 2.transferase 转转移酶类移酶类3.hydrolase 3.hydrolase 水水解酶类解酶类4.lyase 4.lyase 裂裂合酶类合酶类5.isomerase 5.isomerase 异异构酶类构酶类6.ligase/synthetase 6.ligase/synthetase 连连接酶（接酶（合合成酶）类成酶）类（三）国际系统分类法及酶的编号（三）国际系统分类法及酶的编号编号例如：EC 1.2.3 1：表示氧化还原酶（三）国际系12（四）六大酶的特征和举例（四）六大酶的特征和举例氧化氧化-还原酶催化氧化还原酶催化氧化-还原反应。还原反应。主要包括主要包括（1 1）脱氢酶类脱氢酶类 （2 2）氧化酶类（加氧反应）氧化酶类（加氧反应）如：乳酸如：乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1)(1)氧化还原酶氧化还原酶 Oxidoreductase Oxidoreductase（四）六大酶的特征和举例氧化-还原酶催化氧化-还原反应。(113转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2)(2)转移酶转移酶 Transferase Transferase转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另14水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应：催化的脂的水解反应：(3)(3)水解酶水解酶 hydrolase hydrolase水解酶催化底物的加水分解反应。(3)水解酶 hydrol15裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，例如，延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。(4)(4)裂合酶裂合酶 Lyase Lyase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆16异构酶催化各种同分异构体的相互转化，异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)(5)异构酶异构酶 Isomerase Isomerase异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的17连接酶，又称为合成酶，能够催化连接酶，又称为合成酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类键的形成反应。这类反应必须与反应必须与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H=A A+B+ATP+H-O-H=A B+ADP B+ADP+Pi+Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸丙酮酸 +COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸(6)(6)连接酶连接酶 Ligase or Synthetase Ligase or Synthetase连接酶，又称为合成酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C18四、酶的专一性四、酶的专一性1、结构专一性、结构专一性（1）绝对专一性：只作用于一种底物）绝对专一性：只作用于一种底物（2）相对专一性：）相对专一性：基团专一性；键专一性基团专一性；键专一性2、立体异构专一性、立体异构专一性（1）旋光异构专一性：）旋光异构专一性：L-型，型，D-型型（2）几何异构专一性：顺反式）几何异构专一性：顺反式四、酶的专一性1、结构专一性19*几种常见蛋白酶的专一性几种常见蛋白酶的专一性1、羧肽酶、羧肽酶2、氨肽酶、氨肽酶3、胃蛋白酶：、胃蛋白酶：芳香族或疏水芳香族或疏水AA的羧基或氨基形的羧基或氨基形成的肽键成的肽键4、胰凝乳蛋白酶：、胰凝乳蛋白酶：芳香芳香AA（或较大非极性侧（或较大非极性侧链链AA）-CO-5、弹性蛋白酶：、弹性蛋白酶：Ala(Gly及短链脂肪族及短链脂肪族AA）-CO-6、胰蛋白酶：、胰蛋白酶：Lys(Arg)-CO-7、糜蛋白酶：、糜蛋白酶：Phe(Trp或或Tyr)-CO-*几种常见蛋白酶的专一性1、羧肽酶20（1 1）锁钥学说：）锁钥学说：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样(二二)酶作用专一性的机制酶作用专一性的机制（1）锁钥学说：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶21（2 2）诱导契合学说）诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状才形成了互补形状.（2）诱导契合学说该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定22五、酶的活力测定和分离纯化五、酶的活力测定和分离纯化（一）酶活力测定（一）酶活力测定1、酶活力：是指催化某一化学反应的能、酶活力：是指催化某一化学反应的能力，可用在一定条件下所催化的某一化学力，可用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率表示。反应的反应速率表示。通常用单位时间内产物生成量表示。通常用单位时间内产物生成量表示。一般用一般用初速率初速率测定酶的活力，因为此时反测定酶的活力，因为此时反应速度与酶量呈线性关系。应速度与酶量呈线性关系。五、酶的活力测定和分离纯化（一）酶活力测定232、酶活力单位规定：（、酶活力单位规定：（U)酶活力大小即酶含量多少，用酶活力单位表示，酶活力大小即酶含量多少，用酶活力单位表示，即酶单位（即酶单位（U）。）。酶单位定义：一定条件下，一定时间内将一定酶单位定义：一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需酶量。量的底物转化为产物所需酶量。酶含量用酶含量用U/g或或U/ml酶制剂表示。酶制剂表示。（1）国际单位（）国际单位（IU）：）：25下，每分钟催化下，每分钟催化1 mol底物转化为产物所需酶量为一个活力单底物转化为产物所需酶量为一个活力单位。位。1IU=1 mol/min（2）Kat单位（单位（1972年国际酶学委员会规定）：年国际酶学委员会规定）：每秒催化每秒催化1mol底物转化为产物所需酶量。底物转化为产物所需酶量。1Kat=60106IU不同的酶在实际催化中其活力有不同的规定。不同的酶在实际催化中其活力有不同的规定。2、酶活力单位规定：（U)24（二）酶的分离和纯化（二）酶的分离和纯化*分离纯化遵守的重要原则：分离纯化遵守的重要原则：1、低温、低温2、防巯基氧化、防巯基氧化3、防金属离子、防金属离子衡量分离纯化效果用如下一些指标：衡量分离纯化效果用如下一些指标：酶的分离纯化指标：酶的分离纯化指标：（1）总活力）总活力=活力单位数活力单位数/（mL酶液）酶液）总体积（总体积（mL)（2）比活力）比活力=总活力（总活力（U）/总蛋白（总蛋白（mg）（3）纯化倍数）纯化倍数=每次比活力每次比活力/第一次比活力第一次比活力（4）回收率）回收率=每次总活力每次总活力/第一次总活力第一次总活力（二）酶的分离和纯化*分离纯化遵守的重要原则：25酶的活力单位酶的活力单位:1Kat定义为定义为mol/sec的酶的酶酶的分离纯化酶的分离纯化过程中一定要过程中一定要随时追踪酶的随时追踪酶的活性活性比活比活:specificactivity酶单位数酶单位数(U)/mg蛋白蛋白质质酶的活力单位:酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性比活:26六、核酶（六、核酶（ribozyme)1、发现：、发现：1980s,Cech和和Altman各自独各自独立发现立发现RNA具有生物催化功能。共获具有生物催化功能。共获1989年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。2、定义：具有催化功能的、定义：具有催化功能的RNA分子。分子。*近来发现某些近来发现某些DNA分子也具有催化分子也具有催化活性，酶的概念进一扩展。活性，酶的概念进一扩展。六、核酶（ribozyme)1、发现：1980s,Cech27七、抗体酶七、抗体酶1、发现：、发现：1986年年Schultz和和Lerner两个实两个实验室同时在美国验室同时在美国Science上发表论文，报上发表论文，报道成功得到具有酶催化活性的抗体。道成功得到具有酶催化活性的抗体。2、定义：具有催化功能的抗体。、定义：具有催化功能的抗体。七、抗体酶1、发现：1986年Schultz和Lerner两28八、酶工程简介八、酶工程简介1、定义：指酶的生产、纯化、固定化技术、定义：指酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰及在工农医和理论研究方酶分子结构的修饰及在工农医和理论研究方面的应用。面的应用。2、化学酶工程（初级酶工程）、化学酶工程（初级酶工程）（1）天然酶）天然酶（2）化学修饰酶：通过对酶分子的化学修饰）化学修饰酶：通过对酶分子的化学修饰改善酶的性能。改善酶的性能。（3）固定化酶：用物化方法处理酶，使之不）固定化酶：用物化方法处理酶，使之不溶于水，但仍具酶活性。溶于水，但仍具酶活性。（4）人工模拟酶：用化学方法合成人工酶催）人工模拟酶：用化学方法合成人工酶催化剂。化剂。八、酶工程简介1、定义：指酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子29酶工程简介酶工程简介3、生物工程酶（高级酶工程）：是酶学、生物工程酶（高级酶工程）：是酶学和和DNA重组技术结合的产物。重组技术结合的产物。（1）克隆酶：用基因工程技术大量生产）克隆酶：用基因工程技术大量生产的酶。的酶。（2）突变酶：进行遗传修饰。）突变酶：进行遗传修饰。（3）设计新酶基因，合成自然界不曾有）设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶。的酶。酶工程简介3、生物工程酶（高级酶工程）：是酶学30第九章第九章酶促反应动力学酶促反应动力学1、概念：酶促反应动力学是研究、概念：酶促反应动力学是研究酶促反应的酶促反应的速率速率及及影响此速率的各因素影响此速率的各因素的科学。的科学。2、影响因素：、影响因素：（1）底物浓度）底物浓度（2）抑制剂：构成对酶的抑制作用）抑制剂：构成对酶的抑制作用（3）温度）温度（4）pH值值（5）激活剂）激活剂第九章 酶促反应动力学1、概念：酶促反应动力学是研究酶促反31在低底物浓度时在低底物浓度时,反应反应速度与底物浓度成正比，速度与底物浓度成正比，表现为表现为一级反应一级反应特征。特征。随着底物浓度，反应速随着底物浓度，反应速率不再按正比升高，反率不再按正比升高，反应表现为应表现为混合级反应混合级反应。当底物浓度达到一定值，当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到结合后，反应速度达到最大值（最大值（V Vmaxmax），此时），此时再增加底物浓度，反应再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为速度不再增加，表现为零零级反应级反应。一、底物浓度对酶促反应速度的影响一、底物浓度对酶促反应速度的影响酶催化的反应速率变化现象酶催化的反应速率变化现象在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特32（一）中间络合物学说（一）中间络合物学说根据上述反应现象，根据上述反应现象，Henri和和Wurtz提出酶提出酶-底底物中中间复合物学说：物中中间复合物学说：在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。E +S =E-S E +S =E-S P +E P +E许多实验事实（许多实验事实（P355-356)P355-356)证明了证明了E ES S复合物复合物的存在。的存在。E ES S复合物形成的速率与酶和底物的复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。性质有关。（一）中间络合物学说33根据根据中间复合物学中间复合物学说说假设假设E+SES的平衡的平衡迅速迅速建立建立（平衡态）（平衡态）反应初速由最高速度与底物浓度决定反应初速由最高速度与底物浓度决定v=Vmaxf(S)y=f(x)v=Vmax/(1+Ks/S)KsKs为为ESES解离常数解离常数或或v=（米氏方程）（米氏方程）1、Michaelis-Menten方程方程(19131913年年)VmaxSKs+S根据实验数据推导根据实验数据推导S+EESE+P（二）酶促反应的动力学方程（二）酶促反应的动力学方程根据 34稳态理论稳态理论Briggs&Haldane提出提出稳态理论稳态理论，对米氏方程修正：对米氏方程修正：E+SESP+E反应分上述两步进行，均可逆；反应分上述两步进行，均可逆；反应进行一段进间后，复合物反应进行一段进间后，复合物ES生成速率生成速率与分解速率相等，浓度保持不变，这种反与分解速率相等，浓度保持不变，这种反应状态称为应状态称为稳态稳态。k1k2k3k4稳态理论Briggs&Haldane提出稳态理论，对米氏35酶催化的反应中各成份的变化酶催化的反应中各成份的变化S+EESE+PS:substanceP:productE:enzyme发最初发最初发最初发最初的一段的一段的一段的一段时间时间时间时间虚线之间为稳态酶催化的反应中各成份的变化S+E ES 36Briggs&Haldane提出提出稳态理论稳态理论，对米氏方程修正：对米氏方程修正：E+SESP+Ek1(E-ES)S=k2ES+k3ESk2+k3(E-ES)Sk1ESES=ES/(Km+S),Km=(k2+k3)/k1因为因为v=k3ES,而而Vmax=k3E所以所以v=VmaxS/(Km+S)Michaelis-Menten方程方程(19251925年年)k1k2k3k4=*反应初速度阶段，产物浓度很低，反应初速度阶段，产物浓度很低，K4这一步忽略不计。这一步忽略不计。Briggs&Haldane提出稳态理论，对米氏方程修正37米氏方程曲线米氏方程曲线米氏方程曲线38米氏方程米氏方程nK Km m 即为米氏常数，即为米氏常数，nV Vmaxmax为最大反应速为最大反应速度度n当反应速度等于最大速度当反应速度等于最大速度一半时一半时,即即V V=1/2=1/2 V Vmax,max,K Km=S m=S n米氏常数物理意义：反应米氏常数物理意义：反应速度为最大值的一半时的底速度为最大值的一半时的底物浓度。物浓度。n因此因此,米氏常数的单位为米氏常数的单位为mol/Lmol/L。米氏方程Km 即为米氏常数，当反应速度等于最大速度一半时,即392 2、动力学参数的意义、动力学参数的意义（1 1）米氏常数）米氏常数的意义的意义A A、K Km m是酶的一个重要的特征物理常数：是酶的一个重要的特征物理常数：K Km m大小只与酶性质有关，与酶浓度无关。大小只与酶性质有关，与酶浓度无关。KmKm随测定底物、反应温度、随测定底物、反应温度、pHpH及离子强及离子强度而变化。度而变化。B B、Km Km 可判断酶的专一性和天然底物可判断酶的专一性和天然底物1/K1/Km m值近似表示酶与底物之间的亲和程值近似表示酶与底物之间的亲和程度：度：1/1/K Km m值大表示亲和程度大值大表示亲和程度大;1/;1/K Km m值值小表示亲和程度低。小表示亲和程度低。（条件：（条件：k k3 3kk2 2）2、动力学参数的意义（1）米氏常数的意义40（2 2）VmaxVmax和和k k3 3(k(kcatcat)的意义的意义一定酶浓度下，酶对特定底物的一定酶浓度下，酶对特定底物的VmaxVmax是是一个常数，不同底物及其它条件也影响一个常数，不同底物及其它条件也影响其数值。其数值。K K3 3表示当酶被底物饱和时每秒每个酶分子表示当酶被底物饱和时每秒每个酶分子转换底物的分子数，又称转换数，通常转换底物的分子数，又称转换数，通常称催化常数（称催化常数（kcat),kcat),其值越大，表明催其值越大，表明催化效率越高化效率越高。Kcat/KmKcat/Km值：可以比较不同酶或同一种酶值：可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。催化不同底物的催化效率。（2）Vmax和k3(kcat)的意义41Lineweaver-Burkplot(双倒数作图双倒数作图)1/v=Km/Vmax1/S+1/Vmax3、利用作图法测定、利用作图法测定Km和和VmaxLineweaver-Burk plot(双倒数作图)1/42反应速度为最大值的一半时的底物浓度课件43反应速度为最大值的一半时的底物浓度课件44（三）（多）双底物的酶促反应动力学（三）（多）双底物的酶促反应动力学1、序列反应：底物的结合和产物的释放有、序列反应：底物的结合和产物的释放有一定的顺序，产物不能在底物完全结合前释一定的顺序，产物不能在底物完全结合前释放。放。（1）有序反应：参与反应的两底物有序与）有序反应：参与反应的两底物有序与酶结合进行反应。酶结合进行反应。（2）随机反应：参与反应的两底物随机与）随机反应：参与反应的两底物随机与酶结合进行反应。酶结合进行反应。2、乒乓反应、乒乓反应上述反应机制见上述反应机制见364-365页图示。页图示。（三）（多）双底物的酶促反应动力学1、序列反应：底物的结合和45二、酶的抑制作用二、酶的抑制作用几个概念（几个概念（P368）：）：1、失活作用；酶已变性、失活作用；酶已变性2、抑制作用：酶未变性、抑制作用：酶未变性3、抑制剂、抑制剂4、变性剂、变性剂（一）抑制程度表示方法：（一）抑制程度表示方法：P368二、酶的抑制作用几个概念（P368）：46（二）抑制作用的类型（二）抑制作用的类型1 1、不可逆抑制不可逆抑制抑制剂与酶反应中心的活抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。引起酶的永久性失活。如如有机磷毒剂二异丙基氟磷有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。酸酯。不能通过透析、超滤等物不能通过透析、超滤等物理方法去除抑制剂而恢复理方法去除抑制剂而恢复酶的活性。酶的活性。（二）抑制作用的类型1、不可逆抑制472 2、可逆抑制可逆抑制抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过以通过透析等方法透析等方法被除去，并且能被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与底物的关系，又可以分为三制剂与底物的关系，又可以分为三类。类。2、可逆抑制48(1)(1)竞争性抑制竞争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当而能与底物竞争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。抑制了。竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。即提高底物的竞争能力来消除。(1)竞争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底49竞竞争争性性抑抑制制竞争性抑制50(2)(2)非竞争性抑制非竞争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。非竞争性抑制剂。如某些金属离子（如某些金属离子（CuCu2+2+、AgAg+、HgHg2+2+），通常能），通常能与酶分子的调控部位中的与酶分子的调控部位中的-SH-SH基团作用，改变基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。酶的空间构象，引起非竞争性抑制。(2)非竞争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构51非非竞竞争争性性抑抑制制非竞争性抑制52(3)(3)反竞争性抑制反竞争性抑制酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合。酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合。反竞争性抑制作用常见于多底物反应中，而在反竞争性抑制作用常见于多底物反应中，而在单底物反应中少见。单底物反应中少见。(3)反竞争性抑制酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合。53竞争性抑制竞争性抑制(Competitiveinhibition):E+SESE+P+IKiEI反竞争性抑制反竞争性抑制(Uncompetitiveinhibition):E+SESE+P+IKiESI酶反应的三种不同抑制酶反应的三种不同抑制Ki=E*I/EI,Eo=E+EI+ESEo=E+ESI+ES竞争性抑制(Competitive inhibition):54非竞争抑制非竞争抑制(Noncompetitiveinhibition):E+SESE+P+IKi +IKiEIESI非竞争抑制(Noncompetitive inhibitio55不同类型抑制作用的米氏方程不同类型抑制作用的米氏方程不同类型抑制作用的米氏方程56I竞争性抑制竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制非竞争性抑制I竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制57（五）一些重要的酶的抑制剂（五）一些重要的酶的抑制剂1、不可逆抑制剂、不可逆抑制剂（1）非专一性不可逆抑制剂：）非专一性不可逆抑制剂：作用于酶的一类或几类基团，作用后作用于酶的一类或几类基团，作用后引起酶失活。引起酶失活。（2）专一性不可逆抑制剂）专一性不可逆抑制剂作用于某一种酶活必部位的必需基团，作用于某一种酶活必部位的必需基团，作用后引起酶失活。作用后引起酶失活。2、可逆抑制剂、可逆抑制剂最重要和最常见的是竞争性抑制剂。最重要和最常见的是竞争性抑制剂。（五）一些重要的酶的抑制剂1、不可逆抑制剂58非专一性不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂（1）有机磷化合物）有机磷化合物：能抑制某些蛋白酶及酯酶活：能抑制某些蛋白酶及酯酶活力，与酶分子活性部位的丝氨酸共价结合，抑制力，与酶分子活性部位的丝氨酸共价结合，抑制胆碱酯酶胆碱酯酶活力。常见：活力。常见：DFP、敌敌畏、敌百虫、敌敌畏、敌百虫、对硫磷等。对硫磷等。（2）有机汞、有机砷化合物）有机汞、有机砷化合物：与酶分子中半胱氨：与酶分子中半胱氨酸残基结合，抑制含巯基的酶。酸残基结合，抑制含巯基的酶。（3）重金属盐）重金属盐（4）烷化试剂）烷化试剂：含活泼的卤素原子与酶作用。：含活泼的卤素原子与酶作用。（5）氰化物、硫化物和）氰化物、硫化物和CO：能与酶：能与酶中金属离子中金属离子形成较为稳定的化合物，抑制酶活性。形成较为稳定的化合物，抑制酶活性。（6）青霉素）青霉素；与；与糖肽转肽酶糖肽转肽酶活性部位丝氨酸羟基活性部位丝氨酸羟基结合，使酶失活。结合，使酶失活。非专一性不可逆抑制剂（1）有机磷化合物：能抑制某些蛋白酶及酯59专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂（1）Ks型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂：具有底物类似的结构，：具有底物类似的结构，可和酶结合，同时带的一个活泼的化学基团，能可和酶结合，同时带的一个活泼的化学基团，能与酶分子中必需基团反应进行化学修饰，抑制酶与酶分子中必需基团反应进行化学修饰，抑制酶活性。活性。（2）kcat型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂：不但具有天然底物的：不但具有天然底物的类似结构，且本身是酶的底物，能与酶结合发生类似结构，且本身是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的变化，还有一个潜伏反应基团，当类似于底物的变化，还有一个潜伏反应基团，当酶对它进行催化时，该反应基团暴露，作用于酶酶对它进行催化时，该反应基团暴露，作用于酶的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，又称的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，又称为为自杀性底物自杀性底物。专一性不可逆抑制剂（1）Ks型不可逆抑制剂：具有底物类似的结60可逆抑制剂可逆抑制剂最常见的是竞争性抑制剂。最常见的是竞争性抑制剂。（1）对氨基苯磺酰胺：是对氨基苯甲酸的竞争性）对氨基苯磺酰胺：是对氨基苯甲酸的竞争性类似物。抑制二氢叶酸合成酶的对对氨基苯甲酸类似物。抑制二氢叶酸合成酶的对对氨基苯甲酸的催化合成二氢叶酸的活性。的催化合成二氢叶酸的活性。（2）过渡态底物类似物：与过渡态底物相似，能）过渡态底物类似物：与过渡态底物相似，能障小，与酶结合容易。其与酶结合能力远大于底障小，与酶结合容易。其与酶结合能力远大于底物与酶的结合。从而起抑制作用。物与酶的结合。从而起抑制作用。可逆抑制剂最常见的是竞争性抑制剂。61三、三、温度的影响温度的影响一方面是温度升高一方面是温度升高,酶酶促反应速度加快。促反应速度加快。另一方面另一方面,温度升高温度升高,酶酶的高级结构将发生变化的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降或变性，导致酶活性降低甚至丧失。低甚至丧失。因此大多数酶都有一个因此大多数酶都有一个最适温度。最适温度。在最适温在最适温度条件下度条件下,反应速度最反应速度最大。大。最适温度不是酶的特征最适温度不是酶的特征性常数，随多种因素互性常数，随多种因素互会改变。会改变。P379P379三、温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。62四、四、pH pH 的影响的影响在一定的在一定的pH pH 下下,酶具有最大的催酶具有最大的催化活性化活性,通常称此通常称此pH pH 为最适为最适 pH pH。pHpH影响酶活力的影响酶活力的原因：原因：（1 1）构象改变）构象改变（2 2）解离状态：）解离状态：酶的解离，底物酶的解离，底物解离解离四、pH 的影响在一定的pH 下,酶具有最大的催化活性,63如如何何解解释释酶酶活活性性与与pH的的变变化化关关系系，假假如如其其最最大大活活性性在在pH=4或或pH=11时，酶活性可能涉及那些氨基酸侧链？时，酶活性可能涉及那些氨基酸侧链？解解答答：(1)过过酸酸、过过碱碱影影响响酶酶蛋蛋白白的的构构象象，甚甚至至使使酶酶变变性失活。性失活。(2)pH改改变变不不剧剧烈烈时时，影影响响底底物物分分子子的的解解离离状状态态和和酶酶分分子的解离状态，从而影响酶对底物的结合与催化。子的解离状态，从而影响酶对底物的结合与催化。(3)pH影影响响酶酶分分子子中中另另一一些些基基团团的的解解离离，这这些些基基团团的的解解离状态与酶的专一性及酶分子的活性中心构象有关。离状态与酶的专一性及酶分子的活性中心构象有关。如如果果酶酶的的最最大大活活性性在在pH=4时时，可可能能涉涉及及酸酸性性氨氨基基酸酸：天冬氨酸、谷氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；如果酶的最大活性在如果酶的最大活性在pH=11时，可能涉及碱性氨基酸：时，可能涉及碱性氨基酸：赖氨酸、组氨酸和精氨酸。赖氨酸、组氨酸和精氨酸。如何解释酶活性与pH的变化关系，假如其最大活性在pH=4或p64五、激活剂对酶的影响五、激活剂对酶的影响凡是能够提高酶活性的物质都称为酶的激凡是能够提高酶活性的物质都称为酶的激活剂。活剂。大部分是无机离子和小分子有机化合物。大部分是无机离子和小分子有机化合物。如唾液淀粉酶的激活剂是：如唾液淀粉酶的激活剂是：ClCl-五、激活剂对酶的影响凡是能够提高酶活性的物质都称为酶的激活剂65习题习题Kcat酶工程酶工程固定化酶固定化酶中间产物学说中间产物学说金属酶金属酶比活性比活性 全酶与蛋白酶全酶与蛋白酶 多酶体系多酶体系 辅基辅基 诱导契合学说诱导契合学说乳乳酸酸脱脱氢氢酶酶经经过过透透析析后后，其其活活性性大大大大降降低低或或消消失失，这这是是因为：因为：A亚基解聚亚基解聚B酶蛋白变性酶蛋白变性C失去辅酶失去辅酶D缺乏底物与酶结合所需要的能量缺乏底物与酶结合所需要的能量E以上都不对以上都不对下列对酶的叙述，哪一项是正确的？下列对酶的叙述，哪一项是正确的？A所有的蛋白质都是酶所有的蛋白质都是酶B所有的酶均以有机化合物作为底物所有的酶均以有机化合物作为底物C所有的酶均需特异的辅助因子所有的酶均需特异的辅助因子D所有的酶对其底物都具绝对特异性所有的酶对其底物都具绝对特异性E上述都不对上述都不对习题Kcat 酶工程 固定化酶 中间产物学说 金属酶66习题习题测酶活性时，反应速度对底物应呈：测酶活性时，反应速度对底物应呈：A一级反应一级反应B混合级反应混合级反应C零级反应零级反应D二级反应二级反应温度对酶活性的影响是：温度对酶活性的影响是：A.低温可使酶失活低温可使酶失活B.催化的反应速度随温度的升高而升高催化的反应速度随温度的升高而升高C.最适温度是酶的特征性常数最适温度是酶的特征性常数D.最适温度随反应的时间而有所变化最适温度随反应的时间而有所变化E.以上都不对以上都不对关于研究酶反应速度应以初速度为准的原因中，哪项不对？关于研究酶反应速度应以初速度为准的原因中，哪项不对？A.反应速度随时间的延长而下降，反应速度随时间的延长而下降，B.产物浓度的增加对反应速度呈负反馈作用，产物浓度的增加对反应速度呈负反馈作用，C.底物浓度与反应速度成正比，底物浓度与反应速度成正比，D.温度和温度和pH有可能引起部分酶失活，有可能引起部分酶失活，E.测定初速度比较简单方便测定初速度比较简单方便习题 测酶活性时，反应速度对底物应呈：67习题习题*非竞争抑制作用是：非竞争抑制作用是：A.抑制剂与酶活性中心外的部位结合抑制剂与酶活性中心外的部位结合B.酶与抑制剂结合后，还可与底物结合酶与抑制剂结合后，还可与底物结合C.酶与底物结合后，还可与抑制剂结合酶与底物结合后，还可与抑制剂结合D.酶底物抑制剂复合物不能进一步释放产物酶底物抑制剂复合物不能进一步释放产物E.以上都不对以上都不对酶酶促促反反应应达达最最大大速速度度后后，增增加加底底物物浓浓度度不不能能加加快快反反应应速速度度的的原原因因是是：A.全部酶与底物结合成全部酶与底物结合成E-S复合体复合体B.过量底物对酶有负反馈抑制过量底物对酶有负反馈抑制C.过量底物与激活剂结合影响底物与酶的结合过量底物与激活剂结合影响底物与酶的结合D.改变了化学反应的平衡点改变了化学反应的平衡点E.以上都不是以上都不是底物浓度饱和后，再增加底物浓度，则底物浓度饱和后，再增加底物浓度，则A.反应速度随底物浓度的增加而增加反应速度随底物浓度的增加而增加B.随着底物浓度的增加酶逐渐失活随着底物浓度的增加酶逐渐失活C.酶的结合部位被更多的底物占据酶的结合部位被更多的底物占据D.再增加底物的浓度反应速度不再增加再增加底物的浓度反应速度不再增加E.形成酶形成酶底物复合体增加底物复合体增加习题*非竞争抑制作用是：68习题习题有机磷农药有机磷农药A.对酶有可逆性抑制作用对酶有可逆性抑制作用B.可与酶活性中心上组氨酸的咪唑基结合，使酶失活可与酶活性中心上组氨酸的咪唑基结合，使酶失活C.可与酶活性中心上半胱氨酸的巯基结合使，酶失活可与酶活性中心上半胱氨酸的巯基结合使，酶失活D.能抑制胆碱乙酰化酶能抑制胆碱乙酰化酶E.能抑制胆碱酯酶能抑制胆碱酯酶非竞争性抑制剂的存在，使酶促反应动力学改变为：非竞争性抑制剂的存在，使酶促反应动力学改变为：AV不变，不变，km变小变小BV不变，不变，km变大变大CV变小，变小，km变大变大DV变小，变小，km不变不变EV变小，变小，km变小变小FV变大，变大，km变大变大含含唾唾液液淀淀粉粉酶酶的的唾唾液液经经透透析析后后，水水解解淀淀粉粉的的能能力力显显著著下下降降，其其原原因因：A、酶酶变变性性失失活活B、失失去去ClC、失失去去Ca2+D、失失去去辅酶辅酶pH对酶促反应速度的影响，下列哪能项是正确的：对酶促反应速度的影响，下列哪能项是正确的：ApH对酶促反应速度影响不大对酶促反应速度影响不大B不同的酶有其不同的最适不同的酶有其不同的最适pHC酶的最适酶的最适pH都在中性即都在中性即pH=7左右左右D酶的活性随酶的活性随pH的提高而增大的提高而增大EpH对酶促反应速度影响最大的主要在于影响酶的等电点对酶促反应速度影响最大的主要在于影响酶的等电点习题有机磷农药 69习题习题根据国际系统命名法原则，以下哪一个属转移酶类根据国际系统命名法原则，以下哪一个属转移酶类、.7.1.126B、.7.1.126、.7.1.126、.7.1.126下列有关酶蛋白的叙述，哪个是不正确的？下列有关酶蛋白的叙述，哪个是不正确的？、属于结合酶的组成部分、为高分子化合物、属于结合酶的组成部分、为高分子化合物、与酶的特异性无关、与酶的特异性无关、不耐热、不耐热、不能透过半透膜、不能透过半透膜*酶蛋白和辅酶之间有下列关系酶蛋白和辅酶之间有下列关系A、两者以共价键相结合、两者以共价键相结合,二者不可缺一二者不可缺一B、只有全酶才有催化活性、只有全酶才有催化活性C、在酶促反应中两者具有相同的任务、在酶促反应中两者具有相同的任务D、一种酶蛋白通常只需一种辅酶、一种酶蛋白通常只需一种辅酶E、不同的酶蛋白可使用相同辅酶，催化不同的反应、不同的酶蛋白可使用相同辅酶，催化不同的反应同一种辅酶与酶蛋白之间有共价和非共价两种不同类型的结合方式。同一种辅酶与酶蛋白之间有共价和非共价两种不同类型的结合方式。Km值仅由酶和底物的相互关系决定，而不受其它因素影响。值仅由酶和底物的相互关系决定，而不受其它因素影响。酶的敏感性就是指酶对能使蛋白质变性的因素极为敏感。酶的敏感性就是指酶对能使蛋白质变性的因素极为敏感。人体生理的人体生理的pH值是体内各种酶的最适值是体内各种酶的最适pH值。值。习题根据国际系统命名法原则，以下哪一个属转移酶类70习题习题Km可近似表示酶对底物亲和力的大小，可近似表示酶对底物亲和力的大小，Km愈大，表明亲和力愈大。愈大，表明亲和力愈大。激活剂对酶具有激活作用，激活剂浓度越高，则酶活性越大。激活剂对酶具有激活作用，激活剂浓度越高，则酶活性越大。非非竞竞争争性性抑抑制制中中，一一旦旦酶酶与与抑抑制制剂剂结结合合后后，则则再再不不能能与与底底物物结结合合。毒毒气气DFP为不可逆型抑制剂。为不可逆型抑制剂。酶促反应的初速度与底物浓度无关。酶促反应的初速度与底物浓度无关。酶的酶的Km值是酶的特征常数，它不随测定的值是酶的特征常数，它不随测定的pH和温度而改变。和温度而改变。不可逆抑制作用中抑制剂通常以共价键与酶蛋白中的基团结合。不可逆抑制作用中抑制剂通常以共价键与酶蛋白中的基团结合。反竞争抑制中，酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合反竞争抑制中，酶只有与底物结合后，才能与抑制剂结合抗体酶既具有专一结合抗原的性质，又具有酶的催化功能。抗体酶既具有专一结合抗原的性质，又具有酶的催化功能。辅助因子都可用透析法去除。辅助因子都可用透析法去除。在在酶酶分分离离纯纯化化过过程程中中，有有时时需需在在抽抽提提溶溶剂剂中中加加入入少少量量的的巯巯基基乙乙醇醇，这这是是为为了防止酶蛋白的了防止酶蛋白的-SH被氧化。被氧化。在稳态平衡假说中，产物和酶结合形成复合物的速度极小在稳态平衡假说中，产物和酶结合形成复合物的速度极小Km可可近近似似表表示示酶酶对对底底物物亲亲和和力力的的大大小小，Km愈愈大大，表表明明亲亲和和力力愈愈大大。抑抑制制剂对酶的抑制作用是酶变性失活的结果。剂对酶的抑制作用是酶变性失活的结果。习题Km可近似表示酶对底物亲和力的大小，Km愈大，表明亲和力71习题习题某酶制剂的比活力为某酶制剂的比活力为42U/mg蛋白质蛋白质,每每ml含含12mg蛋白质蛋白质,(1)计算计算1ml反应液中含反应液中含5l酶制剂时的反应初速度（按国际单位）酶制剂时的反应初速度（按国际单位）(2)若若1ml反应液内含反应液内含5l酶制剂酶制剂,在在10分钟内消耗底物多少分钟内消耗底物多少?某某酶酶的的Km为为4.7*10-3M，如如果果该该反反应应的的Vmax是是22mol*L-1*min-1,在在底底物物浓度为浓度为2*10-4M和抑制的浓度为和抑制的浓度为5*10-4M的情况下在：的情况下在：（1）竞争性抑制，其反应速度将是多大？竞争性抑制，其反应速度将是多大？（2）非非竞竞争争性性，其其反反应应速速度度又又将将是是多多大大？（Ki在在这这两两种种情情况况下下都都是是3*10-4）某某酶酶的的Km为为4.010-4mol/L,Vmax=24mol/L/min，计计算算出出当当底底物物浓浓度度为为210-4mol/L，非非竞竞争争性性抑抑制制剂剂浓浓度度为为6.010-4 mol/L,Ki为为3.010-4mol/L时的抑制百分数。时的抑制百分数。某某一一酶酶促促80反反应应的的速速度度从从最最大大速速度度的的10%提提高高到到90%时时，底底物物浓浓度度要要做做多多少改变？少改变？过过氧氧化化氢氢酶酶Km值值为为2.5*10-2克克分分子子/升升，当当底底物物过过氧氧化化氢氢浓浓度度为为100毫毫克克分分子子/升升时时，求求在在此此浓浓度度下下，过过氧氧化化氢氢酶酶被被底底物物所所饱饱和和的的百百分分数数（即即V/Vmax=？）？）习题某酶制剂的比活力为42U/mg蛋白质,每ml含12mg蛋72